本發(fā)明涉及一種基于ph值控制的高溫厭氧菌生產(chǎn)乙醇的方法，屬于能源微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著工業(yè)的飛速發(fā)展，傳統(tǒng)化石能源在日益枯竭，環(huán)境也在日益惡化。利用來源豐富的木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇是優(yōu)秀的化石能源替代物，而且還能減少對環(huán)境的污染和溫室氣體的排放。然而，木質(zhì)纖維素乙醇的生產(chǎn)成本過高阻礙了傳統(tǒng)纖維素乙醇實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，造成成本過高的主要原因有：（1）纖維素酶成本過高；（2）缺少能夠高效利用來源于半纖維素的戊糖（五碳糖）的乙醇菌株；半纖維素在植物生物質(zhì)中的含量僅次于纖維素，而且相比起纖維素，半纖維素更容易水解。但半纖維素水解產(chǎn)生的戊糖和阿拉伯糖等碳源不但不能被傳統(tǒng)纖維素乙醇菌株釀酒酵母（saccharomycescerevisiae）和運動發(fā)酵單胞菌（zymomonasmobilis）利用，而且還會抑制菌株的生長。（3）傳統(tǒng)發(fā)酵菌株為常溫菌，但是發(fā)酵過程會釋放熱量，導(dǎo)致發(fā)酵罐溫度上升。因此，為了保持發(fā)酵菌株活性，發(fā)酵罐需要配備冷卻裝置；而隨后乙醇蒸餾回收步驟又需要加溫，導(dǎo)致生產(chǎn)過程中的能耗過大。

高溫厭氧菌具有纖維素降解能力強、可直接利用多糖或單糖（六碳糖、五碳糖）等多種碳水化合物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的特點。而且高溫發(fā)酵可以加速生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成燃料或其衍生化合物的速度，抑制雜菌的生長，還能減少乙醇蒸餾回收時的成本。thermoanaerobacteriumsp.rx1是一株分離于云南保山熱泉的革蘭氏陽性嚴格厭氧高溫芽孢桿菌，能利用葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、纖維二糖、木聚糖、淀粉、果膠、纖維二糖中一種或幾種發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，生長的ph范圍為4.5-8.0，最適ph值是7.0[1]。利用培養(yǎng)環(huán)境ph控制來改變發(fā)酵產(chǎn)物分布在很多常溫菌領(lǐng)域都有報道，但在高溫厭氧菌領(lǐng)域卻鮮有報道；而且很多對ph值的控制僅限于初始ph，無法控制發(fā)酵過程的ph變化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于ph值控制的高溫厭氧菌生產(chǎn)乙醇的方法，該方法利用控制ph值來使高溫厭氧菌thermoanaerobacteriumsp.rx1中心碳流向乙醇，提高乙醇產(chǎn)量。

本發(fā)明所使用的菌株thermoanaerobacteriumsp.rx1已于2011年4月5日保藏在“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號為cctccm2011109[1]。

一種基于ph值控制的高溫厭氧菌生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，具體步驟如下：

（1）劃線培養(yǎng)：在溫度為50~60℃條件下，將低溫保存的嗜熱嚴格厭氧革蘭氏陽性菌thermoanaerobacteriumsp.rx1置于固體培養(yǎng)基上進行厭氧培養(yǎng)48~60h得到rx1單菌落，其中液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基的ph值為6.0~8.0；

（2）純化培養(yǎng)：將步驟（1）所得rx1單菌落接種至液體培養(yǎng)基中，在溫度為50~60℃條件下進行厭氧培養(yǎng)12~16h得到純化rx1菌種，其中液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的ph值為6.0~8.0；

（3）傳代培養(yǎng)：將步驟（2）所得純化rx1菌種接種至液體培養(yǎng)基中，在溫度為50~60℃條件下進行厭氧培養(yǎng)至菌體生長至對數(shù)期后期得到活化rx1菌種，其中液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基；

（4）乙醇發(fā)酵：將步驟（3）所得活化rx1菌種接種至發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，在溫度為50~60℃、通入氮氣或二氧化碳、ph值為6.00~8.00的條件下，發(fā)酵6~10h，然后在攪拌條件下繼續(xù)發(fā)酵48~72h后終止發(fā)酵，其中發(fā)酵液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基；

所述mm641培養(yǎng)基配方包括碳源、氮源、nh4cl、mgcl2·6h2o、kh2po4、k2hpo4、酵母膏、fecl3·6h2o、刃天青、微量元素；

所述微量元素包括fe²⁺、fe³⁺、zn²⁺、mn²⁺、co²⁺、cu²⁺、ni²⁺、mo⁶⁺、b³⁺，碳源為葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、木聚糖、淀粉、果膠或纖維二糖；氮源為胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母提取物、水解乳蛋白、水解酪蛋白的一種或任意比多種；

所述mm641培養(yǎng)基為5~10g/l碳源、2~5g/l氮源、0.6~1.0g/lnh4cl、0.4~1.0g/lmgcl2·6h2o、0.5~1.5g/lkh2po4、1~4g/lk2hpo4、0.5~1.0g/l刃天青、5~10mmol/lfe²⁺、8~12nmol/lfe³⁺、0.4~0.6mmol/lzn²⁺、0.4~0.6mmol/lmn²⁺、0.6~1.0mmol/lco²⁺、10~16nmol/lcu²⁺、0.08~0.2mmol/lni²⁺、0.16~0.20mmol/lmo⁶⁺、0.08~0.2mmol/lb³⁺；

所述步驟（1）固體培養(yǎng)基為采用naoh溶液調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為6.0~8.0，煮沸，加入0.5~1.0g/l半胱氨酸鹽酸鹽、2~4g植物凝膠，滅菌，凝固；

所述發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基為采用naoh溶液調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為6.0~8.0，煮沸，加入0.5~1.0g/l半胱氨酸鹽酸鹽，滅菌，冷卻至溫度為50~60℃，通入氮氣或二氧化碳，通氣流量為10~30l/h；

所述液體培養(yǎng)基為采用naoh溶液調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為6.0~8.0，煮沸，加入0.5~1.0g/l半胱氨酸鹽酸鹽，通入氮氣或二氧化碳，通氣量為10~20l/h，冷卻，滅菌；

所述步驟（3）中純化rx1菌種的接種量為1%；

所述步驟（4）中活化rx1菌種的接種量為0.5%；

本發(fā)明的有益效果是：

（1）本發(fā)明方法通過全程控制ph值來使高溫厭氧菌thermoanaerobacteriumsp.rx1中心碳流向乙醇，提高乙醇產(chǎn)量；相比現(xiàn)有技術(shù)，通過控制ph值，在最佳ph值的條件下可使乙醇生產(chǎn)量提高60%，副產(chǎn)物乳酸產(chǎn)量降低92%，副產(chǎn)物乙醇產(chǎn)量降低75%，適于木質(zhì)纖維素類原料物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)乙醇；

（2）本發(fā)明方法操作簡單，便于規(guī)?；\用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中對比例和實施例1~3的高溫厭氧菌thermoanaerobacteriumsp.rx1的生長曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于所述內(nèi)容。

對比例：一種高溫厭氧菌生產(chǎn)乙醇的方法，具體步驟如下：

（1）劃線培養(yǎng)：將低溫保存的嗜熱嚴格厭氧革蘭氏陽性菌thermoanaerobacteriumsp.rx1劃線于平皿固體培養(yǎng)基上，接種完成后把平板倒置于厭氧罐中，用真空泵抽取罐內(nèi)氣體，再通入氮氣，反復(fù)3次，溫度為55℃的條件下厭氧培養(yǎng)48h得到rx1單菌落；其中培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基，平皿固體培養(yǎng)基的ph值為7.0；

（2）純化培養(yǎng)：將步驟（1）所得rx1單菌落接種至5ml亨特試管液體培養(yǎng)基中，在溫度為55℃條件下進行厭氧培養(yǎng)16h得到純化rx1菌種，其中亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基，亨特試管液體培養(yǎng)基的ph值為7.0；

（3）傳代培養(yǎng)：將步驟（2）所得純化rx1菌種接種至亨特試管液體培養(yǎng)基中，其中純化rx1菌種的接種量為1%，在溫度為55℃條件下進行厭氧培養(yǎng)至菌體生長至對數(shù)期后期（od為1.0~1.2）得到活化rx1菌種，其中亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基；

（4）乙醇發(fā)酵：將步驟（3）所得活化rx1菌種接種至發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，其中活化rx1菌種的接種量為0.5%，在溫度為55℃、通入氮氣的條件下，發(fā)酵8h，然后在攪拌條件下繼續(xù)發(fā)酵48h后終止發(fā)酵，其中發(fā)酵液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基、氮氣的通氣流量為5l/h；

本對比例中mm641培養(yǎng)基配方包括木糖、蛋白胨、酵母提取物、nh4cl、mgcl2·6h2o、kh2po4、k2hpo4、fecl3·6h2o、刃天青、微量元素；其中微量元素包括fe²⁺、fe³⁺、zn²⁺、mn²⁺、co²⁺、cu²⁺、ni²⁺、mo⁶⁺、b³⁺；mm641培養(yǎng)基為10g/l木糖、2g/l胰蛋白胨、1g/l酵母提取物、0.9g/lnh4cl、0.4g/lmgcl2·6h2o、0.75g/lkh2po4、1.5g/lk2hpo4、0.5g/l刃天青、7.5mmol/lfe²⁺、9nmol/lfe³⁺、0.5mmol/lzn²⁺、0.5mmol/lmn²⁺、0.8mmol/lco²⁺、12nmol/lcu²⁺、0.1mmol/lni²⁺、0.2mmol/lmo⁶⁺、0.1mmol/lb³⁺；

本對比例中亨特試管液體培養(yǎng)基為采用naoh溶液調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為7.0，煮沸驅(qū)氧，待培養(yǎng)基顏色從藍色變?yōu)榉凵?，加?.75g/l半胱氨酸鹽酸鹽，通入氮氣，通氣量為10l/h，待冷卻至室溫后，分裝到充滿氮氣的亨特試管中，115℃滅菌30min；

本對比例中平皿固體培養(yǎng)基為采用naoh溶液調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為7.0，煮沸驅(qū)氧，待培養(yǎng)基顏色從藍色變?yōu)榉凵?，加?.75g/l半胱氨酸鹽酸鹽和3g植物凝膠，115℃滅菌30min，超凈臺內(nèi)分裝倒至平皿內(nèi)，待凝固后即可進行接種；

本對比例中發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基為采用naoh調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值，加入0.75g/l半胱氨酸鹽酸鹽，然后倒入發(fā)酵罐內(nèi)，安裝ph計、泡沫計、溶氧計，擰緊蓋板固定螺絲，115℃滅菌30min，待發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基冷卻至60℃后，通入氮氣15min，通氣量為20l/h；

rx1菌株生長性能的測定：發(fā)酵液中取2ml樣品置于1cm比色杯在600nm下測定od值；用無接種菌液的培養(yǎng)基作為空白對照，本對比例的rx1菌株生長性能如圖1所示，rx1菌干重的最大值為0.854g/l；

殘?zhí)羌鞍l(fā)酵代謝產(chǎn)物分析：殘?zhí)羌按x產(chǎn)物通過高效液相色譜（hplc）檢測，檢測設(shè)備為：日本島津at-20高效液相色譜儀；檢測器為rid-10a型示差折光檢測器；色譜柱為aminexhpx-87hcolumn(300×7.8mm)（bio-rad)；流動相：5mmol/lh2so4；流速：0.6ml/min；柱溫：55℃；采集時間為30min；本對比例的測試結(jié)果如表1所示，從表1可知，乙醇為2.436g/l，副產(chǎn)物乳酸為1.341g/l，乙酸為1.554g/l。

實施例1：一種基于ph值控制的高溫厭氧菌生產(chǎn)乙醇的方法，具體步驟如下：

（1）劃線培養(yǎng)：將低溫保存的嗜熱嚴格厭氧革蘭氏陽性菌thermoanaerobacteriumsp.rx1劃線于平皿固體培養(yǎng)基上，接種完成后把平板倒置于厭氧罐中，用真空泵抽取罐內(nèi)氣體，再通入氮氣，反復(fù)3次，55℃條件下厭氧培養(yǎng)48h得到rx1單菌落；其中培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基，平皿固體培養(yǎng)基的ph值為7.0；

（2）純化培養(yǎng)：將步驟（1）所得rx1單菌落接種至5ml亨特試管液體培養(yǎng)基中，在溫度為55℃條件下進行厭氧培養(yǎng)12h得到純化rx1菌種，其中亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基，亨特試管液體培養(yǎng)基的ph值為7.0；

（3）傳代培養(yǎng)：將步驟（2）所得純化rx1菌種接種至亨特試管液體培養(yǎng)基中，其中純化rx1菌種的接種量為1%，在溫度為50℃條件下進行厭氧培養(yǎng)至菌體生長至對數(shù)期后期（od為1.0~1.2）得到活化rx1菌種，其中亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基；

（4）乙醇發(fā)酵：將步驟（3）所得活化rx1菌種接種至發(fā)酵亨特試管液體培養(yǎng)基中，其中活化rx1菌種的接種量為0.5%，在溫度為55℃、氮氣氛圍、控制ph值為7.0的條件下，發(fā)酵8h，然后在攪拌條件下繼續(xù)發(fā)酵48h后終止發(fā)酵，其中發(fā)酵亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基，氮氣的通入流量為5l/h；

本實施例中mm641培養(yǎng)基配方包括碳源、氮源、nh4cl、mgcl2·6h2o、kh2po4、k2hpo4、fecl3·6h2o、刃天青、微量元素；其中微量元素包括fe²⁺、fe³⁺、zn²⁺、mn²⁺、co²⁺、cu²⁺、ni²⁺、mo⁶⁺、b³⁺；mm641培養(yǎng)基為10g/l木糖、2g/l蛋白胨、1g/l酵母提取物、0.9g/lnh4cl、0.4g/lmgcl2·6h2o、0.5g/lkh2po4、1.0g/lk2hpo4、0.5g/l刃天青、7.5mmol/lfe²⁺、9nmol/lfe³⁺、0.5mmol/lzn²⁺、0.5mmol/lmn²⁺、0.8mmol/lco²⁺、12nmol/lcu²⁺、0.1mmol/lni²⁺、0.2mmol/lmo⁶⁺、0.1mmol/lb³⁺；

本實施例中亨特試管液體培養(yǎng)基為采用naoh溶液調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為7.0，煮沸驅(qū)氧，待培養(yǎng)基顏色從藍色變?yōu)榉凵尤?.75g/l半胱氨酸鹽酸鹽，通入氮氣，通氣量為10l/h，待冷卻至室溫后，分裝到充滿氮氣的亨特試管中，115℃滅菌30min；

本實施例中平皿固體培養(yǎng)基為采用naoh溶液調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為7.0，煮沸驅(qū)氧，待培養(yǎng)基顏色從藍色變?yōu)榉凵?，加?.75g/l半胱氨酸鹽酸鹽和3g植物凝膠，115℃滅菌30min，超凈臺內(nèi)分裝倒至平皿內(nèi)，待凝固后即可進行接種；

本實施例中發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基為采用naoh調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為7.0，煮沸驅(qū)氧，待培養(yǎng)基顏色從藍色變?yōu)榉凵?，加?.75g/l半胱氨酸鹽酸鹽，然后倒入發(fā)酵罐內(nèi)，安裝ph計、泡沫計、溶氧計，擰緊蓋板固定螺絲，115℃滅菌30min，待發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基冷卻至55℃后，通入氮氣15min，通氣量為20l/h；

rx1菌株生長性能的測定：發(fā)酵液中取2ml樣品置于1cm比色杯在600nm下測定od值；用無接種菌液的培養(yǎng)基作為空白對照，本實施例的rx1菌株生長性能如圖1所示，rx1菌干重的最大值為0.877g/l；

殘?zhí)羌鞍l(fā)酵代謝產(chǎn)物分析：殘?zhí)羌按x產(chǎn)物通過高效液相色譜（hplc）檢測，檢測設(shè)備為：日本島津at-20高效液相色譜儀；檢測器為rid-10a型示差折光檢測器；色譜柱為aminexhpx-87hcolumn(300×7.8mm)（bio-rad)；流動相：5mmol/lh2so4；流速：0.6ml/min；柱溫：55℃；采集時間為30min；本實施例的測試結(jié)果如表1所示，乙醇為3.865g/l，副產(chǎn)物乳酸為0.136g/l，乙酸為0.610g/l，相比對比例，乙醇產(chǎn)量為對比例的1.6倍，副產(chǎn)物乳酸僅為對比例的10%，副產(chǎn)物乙酸僅為對比例的39%。

實施例2：一種基于ph值控制的高溫厭氧菌生產(chǎn)乙醇的方法，具體步驟如下：

（1）劃線培養(yǎng)：將低溫保存的嗜熱嚴格厭氧革蘭氏陽性菌thermoanaerobacteriumsp.rx1劃線于平皿固體培養(yǎng)基上，接種完成后把平板倒置于厭氧罐中，用真空泵抽取罐內(nèi)氣體，再通入氮氣，反復(fù)3次，50℃條件下厭氧培養(yǎng)60h得到rx1單菌落；其中培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基，平皿固體培養(yǎng)基的ph值為6.0；

（2）純化培養(yǎng)：將步驟（1）所得rx1單菌落接種至5ml亨特試管液體培養(yǎng)基中，在溫度為55℃條件下進行厭氧培養(yǎng)16h得到純化rx1菌種，其中亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基，亨特試管液體培養(yǎng)基的ph值為7.5；

（3）傳代培養(yǎng)：將步驟（2）所得純化rx1菌種接種至亨特試管液體培養(yǎng)基中，其中純化rx1菌種的接種量為1%，在溫度為60℃條件下進行厭氧培養(yǎng)至菌體生長至對數(shù)期后期（od為1.0~1.2）得到活化rx1菌種，其中亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基；

（4）乙醇發(fā)酵：將步驟（3）所得活化rx1菌種接種至發(fā)酵亨特試管液體培養(yǎng)基中，其中活化rx1菌種的接種量為0.5%，在溫度為50℃、通入氮氣、控制ph值為8.0的條件下，發(fā)酵6h，然后在攪拌條件下繼續(xù)發(fā)酵72h后終止發(fā)酵，其中發(fā)酵亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基、氮氣的通氣流量為10l/h；

本實施例中mm641培養(yǎng)基配方包括碳源、氮源、nh4cl、mgcl2·6h2o、kh2po4、k2hpo4、fecl3·6h2o、刃天青、微量元素；其中微量元素包括fe²⁺、fe³⁺、zn²⁺、mn²⁺、co²⁺、cu²⁺、ni²⁺、mo⁶⁺、b³⁺；碳源為甘露糖，氮源為酵母提取物和大豆蛋白胨的混合物；mm641培養(yǎng)基為8g/l甘露糖、5g/l氮源（酵母提取物和大豆蛋白胨的混合物）、0.6g/lnh4cl、1.0g/lmgcl2·6h2o、1.5g/lkh2po4、4.0g/lk2hpo4、1.0g/l刃天青、5mmol/lfe²⁺、12nmol/lfe³⁺、0.4mmol/lzn²⁺、0.4mmol/lmn²⁺、0.6mmol/lco²⁺、10nmol/lcu²⁺、0.08mmol/lni²⁺、0.16mmol/lmo⁶⁺、0.08mmol/lb³⁺；

本實施例中亨特試管液體培養(yǎng)基為采用naoh溶液調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為7.5，煮沸驅(qū)氧，待培養(yǎng)基顏色從藍色變?yōu)榉凵?，加?.5g/l半胱氨酸鹽酸鹽，通入氮氣，通氣量為15l/h，待冷卻至室溫后，分裝到充滿氮氣的亨特試管中，121℃滅菌30min；

本實施例中平皿固體培養(yǎng)基為采用naoh溶液調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為7.5，煮沸驅(qū)氧，待培養(yǎng)基顏色從藍色變?yōu)榉凵?，加?.5g/l半胱氨酸鹽酸鹽和4g植物凝膠，115℃滅菌30min，超凈臺內(nèi)分裝倒至平皿內(nèi)，待凝固后即可進行接種；

本實施例中發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基為采用naoh調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為8.0，加入0.5g/l半胱氨酸鹽酸鹽，然后倒入發(fā)酵罐內(nèi)，安裝ph計、泡沫計、溶氧計，擰緊蓋板固定螺絲，115℃滅菌30min，待發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基冷卻至60℃后，通入氮氣15min，通氣量為30l/h；

rx1菌株生長性能的測定：測試方法與實施例1相同，本實施例的rx1菌株生長性能如圖1所示，本實施例的rx1菌干重的最大值為0.862g/l；

殘?zhí)羌鞍l(fā)酵代謝產(chǎn)物分析：測試方法與實施例1相同，本實施例與其重復(fù)的測試結(jié)果如表1所示，乙醇為3.905g/l，副產(chǎn)物乳酸為0.105g/l，乙酸為0.392g/l，相比對比例，乙醇產(chǎn)量都為對比例的1.6倍，副產(chǎn)物乳酸僅為對比例的8%，副產(chǎn)物乙酸僅為對比例的25%。

實施例3：一種基于ph值控制的高溫厭氧菌生產(chǎn)乙醇的方法，具體步驟如下：

（1）劃線培養(yǎng)：將低溫保存的嗜熱嚴格厭氧革蘭氏陽性菌thermoanaerobacteriumsp.rx1劃線于平皿固體培養(yǎng)基上，接種完成后把平板倒置于厭氧罐中，用真空泵抽取罐內(nèi)氣體，再通入氮氣，反復(fù)3次，60℃條件下厭氧培養(yǎng)55h得到rx1單菌落；其中培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基，平皿固體培養(yǎng)基的ph值為8.0；

（2）純化培養(yǎng)：將步驟（1）所得rx1單菌落接種至5ml亨特試管液體培養(yǎng)基中，在溫度為60℃條件下進行厭氧培養(yǎng)14h得到純化rx1菌種，其中亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基，亨特試管液體培養(yǎng)基的ph值為8.0；

（3）傳代培養(yǎng)：將步驟（2）所得純化rx1菌種接種至亨特試管液體培養(yǎng)基中，其中純化rx1菌種的接種量為1%，在溫度為60℃條件下進行厭氧培養(yǎng)至菌體生長至對數(shù)期后期（od為1.0~1.2）得到活化rx1菌種，其中亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基；

（4）乙醇發(fā)酵：將步驟（3）所得活化rx1菌種接種至發(fā)酵亨特試管液體培養(yǎng)基中，其中活化rx1菌種的接種量為0.5%，在溫度為50℃、通入氮氣、ph值控制在恒7.5的條件下，發(fā)酵10h，然后在攪拌條件下繼續(xù)發(fā)酵60h后終止發(fā)酵，其中發(fā)酵亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基、氮氣的通氣流量為15l/h；

本實施例中mm641培養(yǎng)基配方包括碳源、氮源、nh4cl、mgcl2·6h2o、kh2po4、k2hpo4、、fecl3·6h2o、刃天青、微量元素；其中微量元素包括fe²⁺、fe³⁺、zn²⁺、mn²⁺、co²⁺、cu²⁺、ni²⁺、mo⁶⁺、b³⁺；碳源為葡萄糖，氮源為水解酪蛋白、胰蛋白胨和酵母提取物的混合物；mm641培養(yǎng)基為10g/l葡萄糖、3g/l蛋氮源（水解酪蛋白、胰蛋白胨和酵母提取物的混合物）、1.0g/lnh4cl、1.0g/lmgcl2·6h2o、1.0g/lkh2po4、2.5g/lk2hpo4、0.5g/l刃天青、10mmol/lfe²⁺、8nmol/lfe³⁺、0.6mmol/lzn²⁺、0.6mmol/lmn²⁺、1.0mmol/lco²⁺、16nmol/lcu²⁺、0.2mmol/lni²⁺、0.2mmol/lmo⁶⁺、0.2mmol/lb³⁺；

本實施例中亨特試管液體培養(yǎng)基為采用naoh溶液調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為8，煮沸驅(qū)氧，待培養(yǎng)基顏色從藍色變?yōu)榉凵?，加?g/l半胱氨酸鹽酸鹽，通入氮氣，通氣量為18l/h，待冷卻至室溫后，分裝到充滿氮氣的亨特試管中，115℃滅菌30min；

本實施例中平皿固體培養(yǎng)基為采用naoh溶液調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為8，煮沸驅(qū)氧，待培養(yǎng)基顏色從藍色變?yōu)榉凵?，加?g/l半胱氨酸鹽酸鹽和2g植物凝膠，115℃滅菌30min，超凈臺內(nèi)分裝倒至平皿內(nèi)，待凝固后即可進行接種；

本實施例中發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基為采用naoh調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為7.5，加入1g/l半胱氨酸鹽酸鹽，然后倒入發(fā)酵罐內(nèi)，安裝ph計、泡沫計、溶氧計，擰緊蓋板固定螺絲，115℃滅菌30min，待發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基冷卻至50℃后，通入氮氣15min，通氣量為15l/h；

rx1菌株生長性能的測定：測試方法與實施例1相同，本實施例的rx1菌株生長性能如圖1所示，本實施例的rx1菌干重的最大值為0.782g/l；

殘?zhí)羌鞍l(fā)酵代謝產(chǎn)物分析：測試方法與實施例1相同，本實施例的測試結(jié)果如表1所示，乙醇為3.389g/l，副產(chǎn)物乳酸為0.137g/l，乙酸為0.743g/l，相比對比例，乙醇產(chǎn)量為對比例的1.4倍，副產(chǎn)物乳酸僅為對比例的10%，副產(chǎn)物乙酸為對比例的48%。

實施例4：一種基于ph值控制的高溫厭氧菌生產(chǎn)乙醇的方法，具體步驟如下：

（1）劃線培養(yǎng)：將低溫保存的嗜熱嚴格厭氧革蘭氏陽性菌thermoanaerobacteriumsp.rx1劃線于平皿固體培養(yǎng)基上，接種完成后把平板倒置于厭氧罐中，用真空泵抽取罐內(nèi)氣體，再通入氮氣，反復(fù)3次，55℃條件下厭氧培養(yǎng)60h得到rx1單菌落；其中培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基，平皿固體培養(yǎng)基的ph值為7.5；

（2）純化培養(yǎng)：將步驟（1）所得rx1單菌落接種至5ml亨特試管液體培養(yǎng)基中，在溫度為55℃條件下進行厭氧培養(yǎng)14h得到純化rx1菌種，其中亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基，亨特試管液體培養(yǎng)基的ph值為6.0；

（3）傳代培養(yǎng)：將步驟（2）所得純化rx1菌種接種至亨特試管液體培養(yǎng)基中，其中純化rx1菌種的接種量為1%，在溫度為50℃條件下進行厭氧培養(yǎng)至菌體生長至對數(shù)期后期（od為1.0~1.2）得到活化rx1菌種，其中亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基；

（4）乙醇發(fā)酵：將步驟（3）所得活化rx1菌種接種至發(fā)酵亨特試管液體培養(yǎng)基中，其中活化rx1菌種的接種量為0.5%，在溫度為55℃、通入氮氣、ph值為6.0的條件下，發(fā)酵6h，然后在攪拌條件下繼續(xù)發(fā)酵54h后終止發(fā)酵，其中發(fā)酵亨特試管液體培養(yǎng)基為mm641培養(yǎng)基、氮氣的通氣流量為20l/h；

本實施例中mm641培養(yǎng)基配方包括碳源、氮源、nh4cl、mgcl2·6h2o、kh2po4、k2hpo4、、fecl3·6h2o、刃天青、微量元素；其中微量元素包括fe²⁺、fe³⁺、zn²⁺、mn²⁺、co²⁺、cu²⁺、ni²⁺、mo⁶⁺、b³⁺；碳源為纖維二糖，氮源為胰蛋白胨和酵母提取物的混合物，mm641培養(yǎng)基為5g/l纖維二糖、3g/l氮源（胰蛋白胨和酵母提取物的混合物）、0.8g/lnh4cl、0.8g/lmgcl2·6h2o、0.75g/lkh2po4、2.0g/lk2hpo4、0.75g/l刃天青、7.5mmol/lfe²⁺、9nmol/lfe³⁺、0.5mmol/lzn²⁺、0.5mmol/lmn²⁺、0.8mmol/lco²⁺、14nmol/lcu²⁺、0.1mmol/lni²⁺、0.18mmol/lmo⁶⁺、0.12mmol/lb³⁺；

本實施例中亨特試管液體培養(yǎng)基為采用naoh溶液調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為6.0，煮沸驅(qū)氧，待培養(yǎng)基顏色從藍色變?yōu)榉凵?，加?.6g/l半胱氨酸鹽酸鹽，通入氮氣，通氣量為20l/h，待冷卻至室溫后，分裝到充滿氮氣的亨特試管中，115℃滅菌30min；

本實施例中平皿固體培養(yǎng)基為采用naoh溶液調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為6.0，煮沸驅(qū)氧，待培養(yǎng)基顏色從藍色變?yōu)榉凵?，加?.6g/l半胱氨酸鹽酸鹽和4g植物凝膠，115℃滅菌30min，超凈臺內(nèi)分裝倒至平皿內(nèi)，待凝固后即可進行接種；

本實施例中發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基為采用naoh調(diào)節(jié)mm641培養(yǎng)基的ph值為7.5，加入0.6g/l半胱氨酸鹽酸鹽，然后倒入發(fā)酵罐內(nèi)，安裝ph計、泡沫計、溶氧計，擰緊蓋板固定螺絲，115℃滅菌30min，待發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基冷卻至55℃后，通入氮氣15min，通氣量為10l/h；

rx1菌株生長性能的測定：測試方法與實施例1相同，經(jīng)測定，本實施例的rx1菌干重的最大值為0.871g/l；

殘?zhí)羌鞍l(fā)酵代謝產(chǎn)物分析：測試方法與實施例1相同，本實施例的測試結(jié)果如表1所示，本實施的乙醇為2.990g/l，副產(chǎn)物乳酸為0.122g/l，乙酸為1.113g/l，相比對比例，乙醇產(chǎn)量為對比例的1.2倍，副產(chǎn)物乳酸僅為對比例的9%，副產(chǎn)物乙酸為對比例的72%；

表1

發(fā)酵環(huán)境的ph值不同，乙醇的產(chǎn)量和副產(chǎn)物乙酸、乳酸的量均不相同，控制發(fā)酵環(huán)境的ph值，更適于木質(zhì)纖維素類原料物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。