本發(fā)明屬于海藻低聚糖提取分離技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種κ-卡拉膠寡糖單體快速分離純化的方法。

背景技術(shù)：

卡拉膠寡糖與其他硫酸低聚糖及其衍生物類似，具有多種生物學(xué)活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗氧化及調(diào)節(jié)免疫等。其功能活性與卡拉膠寡糖的聚合度、硫酸基團的取代數(shù)量及取代位置有關(guān)，已引起了科研工作者的關(guān)注，成為食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域開發(fā)和研究的熱點。牟海津等采用酶解法獲得不同聚合的新型κ-卡拉膠低聚糖，并采用磺化修飾獲得其衍生物，樣品能明顯抑制小鼠s180肉瘤活性，結(jié)果表明其抗腫瘤效果隨著硫酸基團的增多而降低，因此卡拉膠低聚糖的抗腫瘤效果與硫酸基團的含量有著密切聯(lián)系。weiwang等研究發(fā)現(xiàn)，低分子量的卡拉膠低聚糖及其硫酸化衍生物可有效地抑制mdck細(xì)胞中甲型流感病毒（iva）的生長，同時抗病毒活性最佳的為分子量在1~3kda、硫酸含量在0.8~1.0mole/mole之間的低聚糖片段，進(jìn)一步闡明了卡拉膠低聚糖的抗病毒活性與其分子量與硫酸基團含量有密切的關(guān)系。除此之外，weiwang等進(jìn)一步驗證了κ-卡拉膠寡糖抗h1ni病毒的活性與其分子量有密切關(guān)系，即2kda＞3kda＞5kda。lingxu等、zi-angyao等研究了κ-卡拉膠寡糖對lps誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性，結(jié)果表明κ-卡拉膠寡糖及脫硫κ-卡拉膠寡糖能抑制lps誘導(dǎo)的小膠質(zhì)炎癥細(xì)胞的活性，并且呈劑量依賴關(guān)系，同時，脫硫κ-卡拉膠寡糖的抗炎效果弱于κ-卡拉膠寡糖。

目前，寡糖分離方法很多，傳統(tǒng)的有分步沉淀法、鹽析法、超濾、凝膠柱層析、離子交換等，近來發(fā)展起來的有高效液相色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、電印跡、離子色譜等新方法。近年來，科研工作者已采用了乙醇分步沉淀法、凝膠過濾層析法（abio-gelp-2column、abio-gelp6column、q-sepharosefastflow）、高效凝膠滲透色譜法（plaquagel-ohcolumn）、體積排阻色譜法（sec）、高效液相系統(tǒng)（superdexpeptide10/300glcolumn）、離子對液相色譜法（spherisorbods1column）、akta快速蛋白液相色譜（superdex30colunm）等對卡拉膠寡糖進(jìn)行分離純化。但都因其效率低，制備量小，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。其中凝膠柱superdex30colunm及bio-gel為兩種最常用的填料，因其較好的靈敏度和分辨率，對于低分子量寡糖，具有較好的分離效果。但由于這些制備柱多被高效液相系統(tǒng)等色譜系統(tǒng)聯(lián)用，雖然可在線監(jiān)測，但其制備量及工作效率，大大影響了其規(guī)?；瘧?yīng)用。

閃式制備色譜技術(shù)，根據(jù)所施加的壓力，可以分為快速色譜(0.1-5/10bars)或中壓液相色譜mplc(5/10-50bars)。閃式色譜系統(tǒng)最初用于快速純化合成化合物的應(yīng)用，很少見到將這種系統(tǒng)應(yīng)用在復(fù)雜天然產(chǎn)物提取所得混合物的分離中。相比于高效液相色譜和高速逆流色譜法，其制備量大，樣品上樣量可從毫克級到百克不等，試驗時間較短，同時分離柱填料能夠自主填充，增加了分離選擇性，有效地節(jié)約了試驗生產(chǎn)成本，在天然產(chǎn)物的分離純化研究工作中發(fā)揮著重要作用。同時，一般配置的制備色譜只有紫外檢測器，這并不適用于沒有紫外吸收峰的化合物檢測，如碳水化合物等；而采用苯酚-硫酸法等離線檢測，常需使用有害的化學(xué)試劑，且特異性差，分析時間較長，樣品浪費也較為嚴(yán)重。盧旭等人，已采用中低壓制備色譜系統(tǒng)對蓮子低聚糖進(jìn)行理想的分離純化，并且上樣量較大，得率較高，效果顯著。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種κ-卡拉膠寡糖單體快速分離純化的制備方法。以rs分辨率為評價指標(biāo)，通過優(yōu)化上樣濃度、上樣體積、洗脫流速等，確定最佳分離純化工藝，以期為κ-卡拉膠寡糖單體規(guī)模化制備奠定基礎(chǔ)；該方法操作方便，同時制備量大，上樣濃度可達(dá)克級別，純度高，分離耗時短，工藝過程穩(wěn)定重現(xiàn)性高，所用預(yù)備柱及儀器可重復(fù)使用，可實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案在于：

一種κ-卡拉膠寡糖單體快速分離純化的方法，具體步驟如下：

1）κ-卡拉膠寡糖的酶解制備：用去離子水配制質(zhì)量濃度為0.2%~0.5％的κ-卡拉膠底物溶液，往溶液中加入用量為反應(yīng)總體積的5%~10％的κ-卡拉膠酶液，于45℃恒溫水浴反應(yīng)48h，加熱煮沸5min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，水解液于10000r/min離心10min以去除未酶解的不溶性片段；

2）收集離心上清液，依次過10kda、3kda切向超濾膜，收集分子量小于3kda的酶解液，采用sevag法去除上清液中的蛋白、脂類，再次離心取上清液旋蒸濃縮、冷凍干燥，獲得κ-卡拉膠寡糖固體混合物；

3）將κ-卡拉膠寡糖固體混合物配制成κ-卡拉膠寡糖溶液，采用中低壓制備色譜系統(tǒng)（mediumpressurepreparativeliquidchromatographysystem，簡稱mplc，包括mplc色譜泵）分離純化寡糖單體，分離純化條件為：等度洗脫，柱溫：25℃，上樣濃度為0.3~1.2g/ml，上樣體積為0.5~3ml，洗脫液0.1mnh4hco3，洗脫流速為1~4ml/min；

4）合并組分一致的溶液，旋蒸濃縮，冷凍干燥，采用tlc及esi-ms檢測，得到聚合度不同的κ-卡拉膠寡糖單體。

所述κ-卡拉膠酶液為實驗室自主篩選菌株發(fā)酵制得。發(fā)酵方法如下：所述κ-卡拉膠酶液的制備方法如下：將海旋菌（thalassospirasp）fjfst-332菌株于斜面培養(yǎng)基活化24h后，接種至液體種子培養(yǎng)基，接種量為3ml/25ml，在25℃、125r/min震蕩培養(yǎng)12h后，得到種子培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為3ml/25ml，在25℃、125r/min震蕩培養(yǎng)36h，將發(fā)酵液以8000r/min轉(zhuǎn)速離心20min，除去培養(yǎng)基中的顆粒性雜質(zhì)和菌體細(xì)胞，收集上清液，分別過50kd和10kd的超濾膜，收集濃縮酶液即為κ-卡拉膠酶液。

優(yōu)選的，步驟3）中，中低壓制備色譜系統(tǒng)分離純化寡糖單體的條件為：上樣濃度為1.2g/ml，上樣體積為1ml，洗脫流速為4ml/min。

步驟3）中，每次進(jìn)樣使用3個柱體積的初始梯度流動相平衡色譜柱，每次分離純化完成后，流動相拉回原梯度沖洗一個柱體積，然后再次準(zhǔn)備下次進(jìn)樣。

步驟3）所述的中低壓制備色譜系統(tǒng)采用dad紫外全波長掃描器與flashelsd蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)合使用，系統(tǒng)的控制和數(shù)據(jù)采集采用interchimsoftware5.0軟件操作；紫外全波長掃描器波長范圍：190-840nm，蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)設(shè)置：吹掃氮氣壓力為3.4bar，漂移管溫度100℃。

本發(fā)明的有益效益在于：

1、發(fā)明采用自主篩選的活性菌株酶解制備獲得卡拉膠寡糖，該野生菌株（海旋菌（thalassospirasp）fjfst-332）發(fā)酵酶解效率高，且產(chǎn)物種類專一，雜質(zhì)少，產(chǎn)物聚合度并不隨酶解時間的延長而進(jìn)一步斷裂降解；

2、本發(fā)明首次采用中低壓制備色譜聯(lián)合蒸發(fā)光散射系統(tǒng)并結(jié)合superdex30colunm預(yù)備柱，分離純化κ-卡拉膠寡糖，操作方便，上樣量大、耗時短，所得寡糖單體純度高，為海藻寡糖的規(guī)?；苽涞於嘶A(chǔ)。

附圖說明

圖1不同酶解時間下的酶解產(chǎn)物tlc分析圖；

圖2a、圖2b、圖2c、圖2d是不同洗脫流速下κ-卡拉膠寡糖色譜圖（上樣濃度0.6g/ml，上樣體積1ml；流動相0.1mnh4hco3；a：1ml/min；b：2ml/min；c：3ml/min；d：4ml/min）；

圖3a、圖3b、圖3c、圖3d是不同上樣濃度下κ-卡拉膠寡糖色譜圖（上樣體積1ml；洗脫流速4ml/min；流動相0.1mnh4hco3；a：0.3g/ml；b：0.6g/ml；c：1g/ml；d：1.2g/ml）；

圖4a、圖4b、圖4c、圖4d是不同上樣體積下κ-卡拉膠寡糖色譜圖（上樣濃度1.2g/ml；洗脫流速4ml/min；流動相0.1mnh4hco3；a：0.5ml；b：1ml；c：2ml；d：3ml）；

圖5κ-卡拉膠寡糖單體tlc分析圖；

圖6a、圖6b、圖6c、圖6d是κ-卡拉膠寡糖單體的esi-ms圖譜（a：κ-卡拉膠二糖；b：κ-卡拉膠四糖；c：κ-卡拉膠六糖；d：κ/ι-卡拉膠六糖）。

具體實施方式

以下是說明本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明并不限于此。

一、不同酶解時間對酶解產(chǎn)物的影響

κ-卡拉膠寡糖的酶解制備：用去離子水配制質(zhì)量濃度0.4％的κ-卡拉膠底物溶液，按反應(yīng)總體積加入7.5%的κ-卡拉膠酶液，于45℃分別恒溫水浴反應(yīng)1h、4h、8h、12h、24h、30h、36h、48h、72h，加熱煮沸5min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，水解液于10000r/min離心10min以去除未酶解的不溶性片段。

分別取不同酶解時間點下的降解樣品，點板觀察產(chǎn)物情況，由圖1可知，隨著酶解時間的延長，酶解產(chǎn)物的種類并沒有變化，而產(chǎn)量隨著時間的延長而積累，因此綜合考慮酶解時間選擇為48h。

二、不同洗脫流速下κ-卡拉膠寡糖分離情況

1）κ-卡拉膠寡糖的酶解制備：用去離子水配制質(zhì)量濃度0.4％的κ-卡拉膠底物溶液，往溶液中加入用量為反應(yīng)總體積的7.5％的κ-卡拉膠酶液，于45℃分別恒溫水浴反應(yīng)48h，加熱煮沸5min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，水解液于10000r/min離心10min以去除未酶解的不溶性片段；

2）收集離心上清液，依次過10kda、3kda切向超濾膜，收集分子量小于3kda的酶解液，采用sevag法去除上清液中的蛋白、脂類，再次離心取上清液旋蒸濃縮、冷凍干燥，獲得κ-卡拉膠寡糖固體混合物；

3）將κ-卡拉膠寡糖固體混合物配制成κ-卡拉膠寡糖溶液，采用中低壓制備色譜系統(tǒng)（mediumpressurepreparativeliquidchromatographysystem，簡稱mplc，包括mplc色譜泵）分離純化寡糖單體，參數(shù)條件為：等度洗脫，柱溫為：25℃，上樣濃度0.6g/ml，上樣體積1ml，洗脫液0.1mnh4hco3，洗脫流速分別為：1、2、3、4ml/min；

4）合并組分一致的溶液，旋蒸濃縮，冷凍干燥。

從圖2和表1的結(jié)果，綜合選擇洗脫流速為4ml/min。

三、不同上樣濃度下κ-卡拉膠寡糖分離情況

1）κ-卡拉膠寡糖的酶解制備：用去離子水配制質(zhì)量濃度0.4％的κ-卡拉膠底物溶液，往溶液中加入用量為反應(yīng)總體積的7.5％的κ-卡拉膠酶液，于45℃恒溫水浴反應(yīng)48h，加熱煮沸5min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，水解液于10000r/min離心10min以去除未酶解的不溶性片段；

2）收集離心上清液，依次過10kda、3kda切向超濾膜，收集分子量小于3kda的酶解液，采用sevag法去除上清液中的蛋白、脂類，再次離心取上清液旋蒸濃縮、冷凍干燥，獲得κ-卡拉膠寡糖固體混合物。

3）配置κ-卡拉膠寡糖溶液，采用中低壓制備色譜系統(tǒng)（mediumpressurepreparativeliquidchromatographysystem，簡稱mplc，包括mplc色譜泵）分離純化寡糖單體，參數(shù)條件為：上樣濃度0.3、0.6、1.0、1.2g/ml，上樣體積1ml，洗脫液0.1mnh4hco3，洗脫速度：4ml/min；

4）合并組分一致的溶液，旋蒸濃縮，冷凍干燥。

從圖3和表2的結(jié)果，綜合選擇上樣濃度為1.2g/ml。

三、不同上樣體積下κ-卡拉膠寡糖分離情況

1）κ-卡拉膠寡糖的酶解制備：用去離子水配制質(zhì)量濃度0.4％的κ-卡拉膠底物溶液，往溶液中加入用量為反應(yīng)總體積的7.5％的κ-卡拉膠酶液，于45℃恒溫水浴反應(yīng)48h，加熱煮沸5min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，水解液于10000r/min離心10min以去除未酶解的不溶性片段；

2）收集離心上清液，依次過10kda、3kda切向超濾膜，收集分子量小于3kda的酶解液，采用sevag法去除上清液中的蛋白、脂類，再次離心取上清液旋蒸濃縮、冷凍干燥，獲得κ-卡拉膠寡糖固體混合物。

3）配置κ-卡拉膠寡糖溶液，采用中低壓制備色譜系統(tǒng)（mediumpressurepreparativeliquidchromatographysystem，簡稱mplc，包括mplc色譜泵）分離純化寡糖單體，參數(shù)條件為：上樣濃度1.2g/ml，上樣體積0.5、1.0、2.0、3.0ml，洗脫液0.1mnh4hco3，洗脫速度：4ml/min；

4）合并組分一致的溶液，旋蒸濃縮，冷凍干燥。

從圖4和表3的結(jié)果，綜合選擇上樣體積為1.0ml。

凝膠層析色譜是混合樣品隨著流動相流經(jīng)裝有凝膠做固定相的的層析柱時，樣品按照分子量大小的不同，按照先后順序依次被分離。各分子量物質(zhì)通過填料時同時進(jìn)行著垂直及擴散流動。分子量大的物質(zhì)由于顆粒直徑較大，不易進(jìn)入凝膠微孔，只能分布于凝膠顆粒間隙中，隨著流動相快速向下移動。分子量小的物質(zhì)不僅擴散于凝膠顆粒間隙中，還可進(jìn)入顆粒微孔中，在凝膠顆粒內(nèi)與間隙間不斷分配，從而大分子量的物質(zhì)快于小分子量物質(zhì)流出柱外，樣品混合物因此而得到分離純化。resolutionfactor（rs）分辨率用以評價凝膠層析色譜的分離效果，取決于選擇性（selectivity）和柱效（efficiency）。峰分離量度高，其選擇性好，高選擇性可以達(dá)到基線分離；柱效與峰寬量度有關(guān)，柱效越高峰越窄，高柱效可以彌補選擇性的不足。柱效取決于流動相流速、填料粒徑大小、粒徑分布、層析柱的裝填及樣品體積和濃度。研究分別優(yōu)化了洗脫流速、上樣濃度及上樣體積對分離純化效果的影響。獲得最優(yōu)純化參數(shù)為：上樣濃度1.2g/ml，上樣體積1ml，洗脫流速4ml/min。

表1不同洗脫流速下的rs和寡糖得率

表2不同上樣濃度下的rs和寡糖得率

表3不同上樣體積下的rs和寡糖得率

實施例1

一種κ-卡拉膠寡糖單體快速分離純化的方法，具體步驟如下：

1）κ-卡拉膠寡糖的酶解制備：用去離子水配制質(zhì)量濃度0.4％的κ-卡拉膠底物溶液，往溶液中加入用量為反應(yīng)總體積的7.5％的κ-卡拉膠酶液，于45℃恒溫水浴反應(yīng)48h，加熱煮沸5min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，水解液于10000r/min離心10min以去除未酶解的不溶性片段；

2）收集離心上清液，依次過10kda、3kda切向超濾膜，收集分子量小于3kda的酶解液，采用sevag法去除上清液中的蛋白、脂類，再次離心取上清液旋蒸濃縮、冷凍干燥，獲得κ-卡拉膠寡糖固體混合物。

3）配置κ-卡拉膠寡糖溶液，采用中低壓制備色譜系統(tǒng)（mediumpressurepreparativeliquidchromatographysystem，簡稱mplc，包括mplc色譜泵）分離純化寡糖單體，參數(shù)條件為：上樣濃度1.2g/ml，上樣體積1.0ml，洗脫液0.1mnh4hco3，洗脫速度：4ml/min；

4）合并組分一致的溶液，旋蒸濃縮，冷凍干燥。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。