本發(fā)明涉及一種新型環(huán)介導等溫擴增結合側向層析技術檢測霍亂弧菌的方法，具體講，涉及一種新型等溫環(huán)介導霍亂弧菌核酸標記檢測試劑。

背景技術：

霍亂弧菌是人類霍亂的病原體,霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。屬于國際檢疫傳染病。人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過污染的水源或飲食物經口傳染。在一定條件下，霍亂弧菌進入小腸后，依靠鞭毛的運動，穿過粘膜表面的粘液層，可能藉菌毛作用粘附于腸壁上皮細胞上，在腸粘膜表面迅速繁殖，經過短暫的潛伏期后便急驟發(fā)病。該菌不侵入腸上皮細胞和腸腺，也不侵入血流，僅在局部繁殖和產生霍亂腸毒素，此毒素作用于粘膜上皮細胞與腸腺使腸液過度分泌，從而患者出現上吐下瀉，瀉出物呈“米泔水樣”并含大量弧菌，此為本病典型的特征。該病曾在世界上引起多次大流行，主要表現為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚高。快速檢測霍亂弧菌是有效控制和預防霍亂的有效手段。

環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification)是一種新型的核酸檢測技術，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，在鏈置換dna聚合酶(bstdnapolymerase)的作用下，在60℃～65℃恒溫擴增，60分鐘左右即可實現10⁹～10¹⁰倍的核酸擴增，具有操作簡單、特異性強等特點。該技術的優(yōu)勢除了高特異性、高靈敏度外，操作十分簡單，對儀器設備要求低，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現反應。其擴增結果可以通過凝膠電泳、肉眼觀察焦磷酸鎂沉淀或加入熒光物質后的顏色改變來做初步的判斷。但該方法也有一定的缺陷，主要表現在擴增結果檢測環(huán)節(jié)，凝膠電泳檢測容易造成污染，焦磷酸鎂沉淀檢測靈敏度較差，熒光物質變色方法受到熒光物質的成本或者需要使用檢測儀器的限制。因此，在產物檢測環(huán)節(jié)的限制，影響了該技術的推廣應用。

本發(fā)明公開了一種新型的等溫環(huán)介導霍亂弧菌核酸標記檢測試劑。該方法具有本發(fā)明的相對傳統環(huán)介導等溫核酸擴增技術具有靈敏度更高，結果判斷更準確的優(yōu)勢。

技術實現要素：

本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提供一種新型環(huán)介導等溫擴增結合側向層析技術檢測霍亂弧菌的方法。

本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供一種新型等溫環(huán)介導霍亂弧菌核酸標記檢測試劑。

本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提供這種新型等溫環(huán)介導霍亂弧菌核酸標記檢測試劑盒的應用。

發(fā)明的主要技術方案為：

1.等溫環(huán)介導霍亂弧菌核酸標記檢測試劑的組成為：

(1)核酸恒溫標記擴增反應試劑

核酸恒溫擴增反應液中含有前外引物、后外引物、前促環(huán)引物、后促環(huán)引物、前內引物、后內引物、dntps溶液、具有鏈置換活性的dna聚合酶(如：bstdna聚合酶等)、mgso4、無菌雙蒸水以及環(huán)介導等溫擴增的緩沖液。

環(huán)介導等溫擴增的緩沖液的最終工作濃度為20mmtris-hcl、10mmkcl、10mm(nh4)2so4、2mmmgso4以及質量濃度為0.1％tritonx-100，緩沖液的ph值為8.8。

其中前外引物、后外引物、前促環(huán)引物、后促環(huán)引物、前內引物、后內引物均為人工合成的脫氧核糖核酸分子，其中前外引物的核苷酸序列為seqidno:1、后外引物的核苷酸序列為seqidno:2、前促環(huán)引物的核苷酸序列為seqidno:3、后促環(huán)引物的核苷酸序列為seqidno:4、前內引物的核苷酸序列為seqidno:5、后內引物的核苷酸序列為seqidno:6，上述引物分別與待測基因的相應位置互為反義互補序列，上述引物能夠在等溫條件下以環(huán)介導的方式檢測待測基因。將前內引物的5’端標記上生物素基團，將后內引物的5’端標記上異硫氰酸熒光素基團。

各引物的具體核苷酸序列如下：

seqidno:15’-gggcatacagtcctcatccag-3’,

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(2)標記核酸膠體金檢測試紙條

該試紙條的組成包括樣品墊、金膠墊、醋酸纖維素膜(膜上由相應的抗體組成的檢測線和質控線)和吸水墊等，具體組成參見附圖1。該膠體金檢測試紙的金膠墊上含有標記后抗生物素抗體的金顆粒，膠體金檢測試紙層析膜的檢測線上包被有抗異硫氰酸生物素抗體，膠體金檢測試紙層析膜的質控線上包被有能和金顆粒上標記的抗生物素抗體結合的二抗。

2.使用等溫環(huán)介導霍亂弧菌核酸標記檢測試劑的具體步驟為：

(1)將待檢測的dna溶液，加入到裝有恒溫擴增反應液的pcr管中；在對照pcr管中分別加入陽性對照試劑和陰性對照試劑，將上述pcr管在60～65℃下擴增反應30～60分鐘，優(yōu)選條件為60℃下擴增反應60分鐘。

(2)利用標記核酸膠體金檢測試紙條，檢測pcr管中反應后的核酸擴增產物。

下面對本發(fā)明的技術方案作進一步的解釋和說明：

等溫環(huán)介導霍亂弧菌核酸標記檢測試劑能夠在60～65℃下將霍亂弧菌的dna進行擴增，在擴增的同時，由于前內引物和后內引物分別標記有生物素基團和異硫氰酸熒光素基團，因此在dna擴增產物上同時含有生物素基團和異硫氰酸熒光素基團。

上述擴增產物滴加在核酸膠體金檢測試紙條的樣品墊上，在層析作用下，擴增產物在經過金膠墊時雙標記的核酸擴增產物由于攜帶有生物素基團和異硫氰酸熒光素基團，因此能夠和標記有金顆粒的抗生物素抗體結合形成核酸抗體復合物；核酸抗體復合物在醋酸纖維素膜上層析，經過檢測線時該復合物由于帶有異硫氰酸熒光素基團，因此能夠和檢測線上的抗異硫氰酸熒光素抗體結合，形成復合物，該復合物由于攜帶有有色的標記物(納米金顆粒呈紅色)，此時檢測線呈現紅色；當核酸抗體復合物或者單獨的標記抗生物素抗體經過質控線時，由于質控線上含有能夠結合抗生物素抗體的二抗，所以只要有標記的抗生物素抗體層析至質控線，無論該抗體是否結合有標記的核酸，均能夠形成二抗和標記抗體的復合物，該復合物由于攜帶有有色的標記物(納米金顆粒呈紅色)，此時質控線呈現紅色。

本發(fā)明的相對傳統環(huán)介導等溫核酸擴增技術具有靈敏度更高，結果判斷更準確的優(yōu)勢。首先，本發(fā)明的新型恒溫環(huán)介導核酸標記檢測試劑，使用標記的引物，使得環(huán)介導等溫擴增后，擴增產物攜帶了兩種抗原標記物。這樣的雙標記核酸擴增產物，能夠被制備好的膠體金試紙條檢測出來。當含有雙標記擴增產物的樣本在膠體金試紙上層析時，雙標記產物能夠結合攜帶有有色顆粒標記的抗體，在檢測線上呈現紅色，這樣目的擴增產物可以通過試紙上檢測線的顏色改變顯示出來。即使有很少的擴增產物也能夠進行準確的檢測，因此有效地提高了檢測靈敏度。其次，檢測反應的結果通過膠體金檢測試紙的檢測線得到，相對于濁度觀察法和熒光燃料變色法讀取結果更加準確，避免了由于檢驗人員主觀判斷帶來的結果偏差。上述檢測方法擴大了該檢測試劑的應用范圍，使之可以廣泛應用于野外現場等特殊環(huán)境。此方法操作簡單、時間短，同時也降低了檢測成本，使得檢測結果更加快速、可靠，具有免疫與核酸診斷試劑各自的優(yōu)點。該技術由于操作簡單、快速、低廉的成本和防止核酸擴增物對實驗室的污染，對于病原體的檢測具有重大意義。

附圖說明

附圖1膠體金試紙條的組成。

該試紙條的組成包括樣品墊(1)、金膠墊(2)、醋酸纖維素膜(3)、質控線(4)、檢測線(5)和吸水墊(6)。該膠體金檢測試紙的金膠墊上含有標記后抗生物素抗體的金顆粒，膠體金檢測試紙層析膜的檢測線上包被有抗異硫氰酸生物素抗體，膠體金檢測試紙層析膜的質控線上包被有能和金顆粒上標記的抗生物素抗體結合的二抗。

附圖2霍亂弧菌標記擴增檢測結果

加入的擴增dna模板如下，1號條為霍亂弧菌dna模板標準品其中含目的基因約10⁶拷貝；2號條為霍亂弧菌dna模板標準品其中含目的基因約10⁰拷貝；3號條為待測樣品；4號條為副溶血弧菌dna模板標準品；5號條為加入的雙蒸水進行陰性對照。

下面結合具體實施例，進一步詳細地闡述本發(fā)明：

具體實施方式

本發(fā)明的具體實施方式僅對本發(fā)明做進一步的解釋和說明，并不對本發(fā)明的內容進行限制。

實施例1：霍亂弧菌dna基因組梯度稀釋標記擴增檢測

取濃度已知的霍亂弧菌dna基因組對其進行10倍梯度稀釋，稀釋至霍亂弧菌dna中的目的基因終濃度為10⁰拷貝/μl，取霍亂弧菌dna模板標準品制備的陽性參照物，陰性參照物，以及霍亂弧菌dna梯度稀釋液(在pcr管中霍亂弧菌特異性目的基因的終濃度分別為10⁶拷貝、10⁵拷貝、10⁴拷貝、10³拷貝、10²拷貝、10¹拷貝和10⁰拷貝)，做為模板進行標記擴增檢測。

等溫擴增中的各組分構成比例如下：

1倍緩沖液中各物質組成如下：20mmtris-hcl、10mmkcl、10mm(nh4)2so4、2mmmgso4以及質量濃度為0.1％tritonx-100，緩沖液的ph值為8.8，10倍緩沖液的各組份濃度是1倍緩沖液中各組份濃度的10倍。

將上述混合物加入到pcr管中，在水浴鍋中進行等溫擴增，擴增步驟為：60℃，30分鐘；80℃，2分鐘。

將擴增產物加于膠體金檢測試紙條上，在15分鐘之內讀取結果，當檢測線和質控線都呈現紅色時為陽性結果；當檢測線無色、質控線呈現紅色時為陰性結果；當質控線無色時，實驗失敗，需要重新進行實驗。

濃度已知的霍亂弧菌dna基因組進行梯度稀釋，分別加入為霍亂弧菌dna模板標準品制備的陽性參照物、10⁶-10⁰拷貝目的基因的霍亂弧菌dna和用于做參照的無菌水，擴增結果為其中陽性參照物和10⁶-10⁰拷貝目的基因的擴增產物均為陽性，陰性參照物的擴增結果為陰性。

實施例2：霍亂弧菌的檢測

樣本：某dna樣本懷疑為霍亂弧菌。

取該樣本進行等溫標記擴增檢測擴增，擴增的同時使用霍亂弧菌dna模板標準品其中含目的基因約10⁶拷貝的dna樣本；霍亂弧菌dna模板標準品其中含目的基因約10⁰拷貝的dna樣本；副溶血弧菌dna模板標準品和無菌雙蒸水的陰性對照同時進行檢測。

等溫擴增中的各組分構成比例如下：

1倍緩沖液中各物質組成如下：20mmtris-hcl、10mmkcl、10mm(nh4)2so4、2mmmgso4以及質量濃度為0.1％tritonx-100，緩沖液的ph值為8.8，10倍緩沖液的各組份濃度是1倍緩沖液中各組份濃度的10倍。

將上述混合物加入到pcr管中，在水浴鍋中進行等溫擴增，擴增步驟為：60℃，30分鐘；80℃，2分鐘。

將擴增產物加于膠體金檢測試紙條上，在15分鐘之內讀取結果，當檢測線和質控線都呈現紅色時為陽性結果；當檢測線無色、質控線呈現紅色時為陰性結果；當質控線無色時，實驗失敗，需要重新進行實驗。

實施例2的結果見附圖2所示，各擴增產物中加入的dna模板如下，1號條為霍亂弧菌dna模板標準品其中含目的基因約10⁶拷貝；2號條為霍亂弧菌dna模板標準品其中含目的基因約10⁰拷貝；3號條為待測樣品；4號條為副溶血弧菌dna模板標準品；5號條為加入的雙蒸水進行陰性對照。

<110>南開大學

<120>環(huán)介導等溫擴增結合側向層析技術檢測霍亂弧菌的方法

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