本發(fā)明涉及生物納米材料領(lǐng)域和精細(xì)化工領(lǐng)域一類熒光染料、其制法和用途，具體涉及一種靶向腫瘤細(xì)胞表面谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的萘酰亞胺衍生物類熒光染料及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥已經(jīng)成為威脅人類生命的主要疾病之一。據(jù)統(tǒng)計，全球每年新發(fā)癌癥患者人數(shù)高達(dá)數(shù)千萬人次，死亡人數(shù)在六百萬左右，危害嚴(yán)重，治療困難；目前，越來越多的國家政府和科學(xué)界投入了大量的精力和財力用于癌癥的治療和預(yù)防。因此，發(fā)展能夠更加有效地治療這類疾病的手段，對促進(jìn)人類健康具有重大意義。

抗腫瘤藥物化療是除外科手術(shù)之外最重要的癌癥治療手段，包括傳統(tǒng)化療和靶向治療兩種方法。傳統(tǒng)化療是指利用抗腫瘤藥物(細(xì)胞毒性物質(zhì))干擾體內(nèi)細(xì)胞有絲分裂，殺死快速分裂的細(xì)胞。即在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，又殺傷正常組織的細(xì)胞，尤其是殺傷人體中生長發(fā)育旺盛的血液、淋巴組織細(xì)胞等。而這些細(xì)胞與組織是人體重要的免疫防御系統(tǒng)，因此傳統(tǒng)化療往往伴隨著很大程度上的毒副作用。

靶向治療主要是基于傳統(tǒng)化療的基礎(chǔ)上，通過瘤內(nèi)注射，載體修飾等手段，實現(xiàn)化療藥物對于腫瘤的識別，降低正常組織細(xì)胞的攝入，從而大大提高傳統(tǒng)化療的治療效果。瘤內(nèi)注射雖然簡便，大多數(shù)情況下由于實際腫瘤部位無法精確探知，所以并不適用。目前，更多是利用能夠識別腫瘤細(xì)胞膜上特定分子信號的特殊配體來修飾藥物載體外層，主要包括小分子靶向染料、縮氨酸(如環(huán)狀五肽crgd)、鐵傳遞蛋白和某些抗體。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(ggt)是一種糖蛋白性的膜腱酶。肝臟中的ggt主要分布在肝細(xì)胞毛細(xì)膽管內(nèi)側(cè)和整個膽管系統(tǒng)，ggt合成增多或膽管系統(tǒng)病變，膽汁排泄受阻時均可引起血清ggt升高。而血清ggt有癌胚特性，在原發(fā)性肝癌(phc)實體腫瘤組織生長時，釋放到外周血液中的甚至高達(dá)600u/l以上。即肝癌患者ggt活性顯著升高，尤其是惡性腫瘤肝轉(zhuǎn)移及肝癌手術(shù)復(fù)發(fā)時更明顯，往往大于正常的幾倍甚至幾十倍，陽性率可達(dá)90％。當(dāng)腫瘤切除后，ggt可降至正常，復(fù)發(fā)時又升高，故動態(tài)觀察可監(jiān)測肝癌療效、判斷預(yù)后。

另一方面，目前多數(shù)小分子抗癌藥水溶性較差，臨床上通常使用表面活性劑對其進(jìn)行乳化，但在血液循環(huán)過程中其穩(wěn)定性較差，基本上不具有緩釋或控釋性能，而且存在血液半衰期短、毒副作用依然很大等眾多缺點。因此，研究新型的高效藥物運(yùn)輸載體已成為生物醫(yī)藥、腫瘤治療領(lǐng)域的關(guān)鍵。以無機(jī)納米材料作為藥物載體用于靶向藥物輸送系統(tǒng)，近年來得到迅速發(fā)展。無機(jī)藥物載體如二氧化硅、四氧化三鐵等，雖然藥物負(fù)載能力高，化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性好，但若在體內(nèi)過量積聚，會對正常組織造成損傷，目前已有文獻(xiàn)報道體內(nèi)過量積聚的二氧化硅對肺和肝的損傷尤為明顯。羥磷灰石(hap)是脊椎動物骨骼和牙齒的主要無機(jī)組成成分，具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性、安全低毒、穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)和載藥性廣等優(yōu)點。此外，在酸性條件下(ph3.5-6)，羥磷灰石易水解，且對正常細(xì)胞無毒副作用，是一種有潛力的藥物載體。

熒光染料的識別或傳感功能是近年發(fā)展起來的。相比于傳統(tǒng)的檢測手段，熒光染料具有選擇性，靈敏度高，實時原位檢測，動態(tài)可視化檢測等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用在各個領(lǐng)域。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，熒光染料可被應(yīng)用在細(xì)胞、組織或體內(nèi)，用于疾病的早期診斷和病理分析，如基因診斷(dna測序、基因重組)、生物分析(核酸識別、蛋白質(zhì)標(biāo)記、離子及活性氧等小分子檢測)，熒光成像(細(xì)胞,組織及活體成像)及醫(yī)療診斷(免疫檢測、血液分析、腫瘤標(biāo)志物檢測)等。因此，設(shè)計以ggt為靶標(biāo)的熒光染料用于檢測ggt含量異常具有重要意義；將這類熒光染料與羥磷灰石納米藥物載體結(jié)合，在腫瘤靶向治療和示蹤具有實際應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種對癌細(xì)胞靶向識別示蹤且酸敏響應(yīng)性的羥磷灰石納米藥物復(fù)合體，用于靶向表面谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶過表達(dá)的癌細(xì)胞，從而實現(xiàn)癌細(xì)胞選擇性識別示蹤及抗癌藥物的緩慢靶向釋放。

為此，本發(fā)明首先公開一種靶向熒光染料，具有通式i的結(jié)構(gòu)：

通式i中，

r1和r2各自獨(dú)立地選自：h、no2、cooh、nh2、oh、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、c1-6酰胺基、鹵素或c1-6鹵代烷基；

r3是n或o。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供上述靶向熒光染料的制備方法，該制備方法中：

(1)當(dāng)r3＝n時所述方法包括如下步驟：

①式ii的化合物與式iii的化合物在125℃條件下按照摩爾比0.1-1000:1反應(yīng)4-8h，制備式iv的化合物；

反應(yīng)溶劑優(yōu)選為冰醋酸，反應(yīng)摩爾比優(yōu)選為0.1-500:1，更優(yōu)選為0.1-100:1，最優(yōu)選為0.1-20:1；

②式iv的化合物與zn粉在90℃條件下按照摩爾比0.1-100:1下反應(yīng)3-6h，反應(yīng)體系加入適量無水cacl2結(jié)晶固體，制備式v的化合物；

反應(yīng)溶劑優(yōu)選為乙醇，摩爾比優(yōu)選為0.1-50:1，更優(yōu)選為0.1-20:1。

③式v的化合物與式x的化合物在室溫下按照摩爾比0.1-1000:1下反應(yīng)24-72h，加入0.05當(dāng)量催化劑edcl和hobt，制備式xi的化合物(即式i的化合物，r3＝n)；

反應(yīng)溶劑優(yōu)選為dmf與二氯甲烷體積比0.1-100:1的混合溶劑，更優(yōu)選為0.1-20：1；

(2)當(dāng)r3＝o時所述方法包括如下步驟：

①式vi的化合物與式iii的化合物在125℃條件下按照摩爾比0.1-1000:1反應(yīng)4-8h，制備式vii化合物。

反應(yīng)溶劑優(yōu)選為冰醋酸，摩爾比優(yōu)選為0.1-100:1，更優(yōu)選為0.1-20:1。

②式vii的化合物與乙醇鈉在85℃條件下按照摩爾比1:0.1-1000反應(yīng)6-24h，制備式viii化合物；

反應(yīng)溶劑優(yōu)選為甲醇，加入0.1-0.5當(dāng)量無水cu2so4，反應(yīng)優(yōu)選進(jìn)行氮?dú)獗Ｗo(hù)，摩爾比優(yōu)選1:0.1-200，更優(yōu)選1:0.1-50，最優(yōu)選1:0.1-20；

式viii與過量的hi水溶液中反應(yīng)2-5h，制備式ix化合物。

反應(yīng)溶劑優(yōu)選為乙醇水溶液，條件優(yōu)選為回流反應(yīng)。

③式ix的化合物與式x的化合物在室溫下按照摩爾比0.1-1000:1下反應(yīng)24-72h，加入0.05當(dāng)量催化劑edcl和hobt，制備式xii化合物(即式i的化合物，r3＝o)。

反應(yīng)溶劑優(yōu)選為dmf與二氯甲烷體積比0.1-100:1的混合溶劑，更優(yōu)選為0.1-20:1。

進(jìn)一步，本發(fā)明公開一種靶向熒光染料修飾的載藥羥基磷灰石，所述的靶向熒光染料即上述本發(fā)明的靶向熒光染料(具有通式i的結(jié)構(gòu))。

再一方面，本發(fā)明還公開上述靶向熒光染料修飾的載藥羥基磷灰石的制備方法，包括下述步驟：(1)制備載藥羥基磷灰石(d@hap)；(2)以靶向熒光染料對載藥羥基磷灰石進(jìn)行表面修飾。

本發(fā)明所提供的靶向熒光染料以及在其基礎(chǔ)上所構(gòu)建的靶向熒光染料修飾的載藥羥基磷灰石靶向谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶?；诠劝滨０忿D(zhuǎn)氨酶在大多數(shù)腫瘤中高度表達(dá)，而靶向熒光染料的谷氨酸酰胺區(qū)域同腫瘤細(xì)胞表面的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶親和力很強(qiáng)；熒光染料修飾的載藥羥基磷灰石經(jīng)由靶向熒光染料區(qū)域與谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶識別結(jié)合，并以內(nèi)吞方式穿過細(xì)胞膜，從而靶向表面谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，實現(xiàn)抗癌藥物的緩慢靶向釋放。因此，本發(fā)明再一方面提供所述的靶向熒光染料修飾的載藥羥基磷灰石在制備腫瘤示蹤及治療制劑中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的靶向熒光染料修飾的載藥羥基磷灰石在如下幾個方面都有突出的優(yōu)勢：(1)設(shè)計合成的熒光染料i對谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶具有專一、快速識別的效果，能夠?qū)劝滨０忿D(zhuǎn)氨酶過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞與谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶低表達(dá)的正常細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，從而通過熒光信號有效區(qū)分腫瘤與正常細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞中發(fā)出極強(qiáng)的黃色的熒光，實現(xiàn)納米材料對腫瘤部位的識別與示蹤。(2)羥磷灰石(hap)是脊椎動物骨骼和牙齒的主要無機(jī)組成成分，具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性、安全低毒、穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)和載藥性廣等優(yōu)點。隨著生物體內(nèi)ph的變化，有機(jī)藥物載體如脂質(zhì)體、聚合微球等不穩(wěn)定，易發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，不能有效進(jìn)行藥物釋放。無機(jī)藥物載體如二氧化硅、四氧化三鐵等雖然藥物負(fù)載能力高，化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性好，但若在體內(nèi)過量積聚，會對正常組織造成損傷。與這些無機(jī)納米材料相比，羥基磷灰石有著極為優(yōu)異的性能；此外，在酸性條件下(ph3.5-6)，羥磷灰石易發(fā)生酸解，且對正常細(xì)胞無毒副作用，是一種有潛力的藥物載體。(3)本發(fā)明所述的藥物載體是將抗癌藥物和羥磷灰石納米顆粒進(jìn)行共摻雜，而非僅僅將抗癌藥物修飾在納米顆粒表面，從而提高了抗癌藥物的包覆率。(4)摻雜抗癌藥物的羥磷灰石納米顆粒表面修飾上靶向熒光染料后，就如同在該納米載體表面增加了一個開關(guān)，從而有效地降低了該納米載體在血液循環(huán)過程中的被體內(nèi)正常組織，血液內(nèi)含物等的吸附，提高了納米載體在腫瘤部位的聚集，進(jìn)而提高了抗癌藥物的釋放效率和局部濃度并降低抗癌藥物的使用劑量和毒副作用等，在癌癥治療領(lǐng)域有著重大的研究價值和應(yīng)用前景。(5)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大多數(shù)腫瘤中高度表達(dá)，在正常組織內(nèi)低表達(dá)，而靶向腫瘤細(xì)胞萘酰亞胺衍生物類熒光染料i與谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶有著極高的結(jié)合能力，熒光染料與酶結(jié)合，并可通過內(nèi)吞方式穿過細(xì)胞膜。因此，本發(fā)明制備的i@d@hap納米藥物載體對腫瘤細(xì)胞具有很好的主動響應(yīng)性能，也就是說該納米藥物載體具有良好的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶特異靶向性，從而實現(xiàn)抗癌藥物的靶向緩慢釋放。

附圖說明

本發(fā)明附圖11幅：

圖1是實施例2.1hap、dox@hap、dfa1@dox@hap納米顆粒的透射電鏡(tem)圖。其中，(a)、(b)、(c)分別為hap、dox@hap、dfa1@dox@hap在200nm下的電鏡圖。其形態(tài)為棒狀，平均長度是60-130nm，平均直徑15-50nm，不易聚集，分散性較好。

圖2是實施例2.2的紅外光譜(ftir)圖。其中，(a)為hap，(b)為dox@hap，(c)為dfa1@dox@hap。

圖3是實施例2.3hap，dox@hap，dfa1@dox@hap納米顆粒的zeta電位圖。其中hap，dox@hap，dfa1@dox@hap的濃度均為0.5mg/ml。

圖4(a)是實施例2.4dfa1的時間響應(yīng)曲線；圖4(b)是實施例2.4dfa1的濃度響應(yīng)曲線；圖4(c)是實施例2.4dfa1對氨基酸選擇性實驗；圖4(d)是實施例2.4dfa1對陰陽離子選擇性實驗；母液濃度為2.5mm，激發(fā)波長為440nm。

圖5-7是實施例3dfa1@dox@hap納米顆粒的熒光光譜圖。dfa1@dox@hap濃度分別為5mg/ml，熒光染料的最大吸收波長為440nm，最大發(fā)射波長為550nm；抗癌藥物的最大吸收波長為480nm，最大發(fā)射波長為590nm。

圖7中，1-14物質(zhì)分別為：1、空白；2、人血清蛋白；3、rna；4、dna；5、三酰基甘油基水解酶；6、溶菌酶；7、蛋白激酶k；8、精氨酸；9、膠原；10、血紅素；11、牛血清蛋白；12、β-淀粉酶；13、酪氨酸；14、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶ggt。

圖8是實施例4dfa1@dox@hap在不同ph值下的藥物釋放過程。不同ph值下的藥物累積釋放率圖。激發(fā)波長為480nm。

圖9是實施例5dfa1@dox@hap納米顆粒的細(xì)胞毒性圖。其中，a-f分別為cos-7、hl-7702、hct-116、mcf-7，hela以及a2780細(xì)胞，g圖為6種細(xì)胞的細(xì)胞毒性柱狀比較圖。dfa1@dox@hap濃度為5mg/ml，激發(fā)波長為480nm，細(xì)胞孵育時間為24h。

圖10是實施例6dfa1@dox@hap在不同細(xì)胞、不同時間的熒光共聚焦顯微成像圖。其中，選擇cos-7、hl-7702、hct-116、mcf-7，hela以及a2780這六種細(xì)胞，以時間間隔為15min進(jìn)行單光子顯微共聚焦成像。dfa1@dox@hap濃度為5mg/ml，激發(fā)波長為488nm。

圖11是實施例7dfa1@dox@hap在裸鼠瘤體冰凍切片中的組織成像實驗。其中，裸鼠瘤體為皮下種植hepg2細(xì)胞，切片與材料母液孵育時間為4h。dfa1@dox@hap濃度為5mg/ml，激發(fā)波長為405nm和488nm。

具體實施方式

本發(fā)明旨在提供對腫瘤細(xì)胞靶向識別示蹤且酸敏響應(yīng)性的功能性靶向熒光染料及其與載藥羥磷灰石所構(gòu)成的功能復(fù)合體，并且提供這些產(chǎn)品的制備方法。本發(fā)明中所述及的靶向均表示針對腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的靶向。

如無特殊說明，本說明書中所使用的符號ggt均代表谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，i代表靶向ggt的萘酰亞胺衍生物類熒光染料，dfa1代表r1，r2為氫原子，x為氮原子，r3為氮原子的小分子染料，d代表所載的藥物，dox代表阿霉素，hap代表羥基磷灰石，d@hap代表載藥羥基磷灰石，dfa1@d@hap代表修飾靶向ggt的萘酰亞胺衍生物類熒光染料dfa1的載藥羥基磷灰石。

首先，本發(fā)明中所述的靶向熒光染料，具有通式i的結(jié)構(gòu)：

通式i中，r1和r2各自獨(dú)立地選自：h、no2、cooh、nh2、oh、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、c1-6酰胺基、鹵素或c1-6鹵代烷基；作為優(yōu)選地，選自h、no2、nh2、cooh、oh、och3、oc2h5、br、cl；進(jìn)一步優(yōu)選，選自h、no2、oh、och3、oc2h5、br，更優(yōu)選h、no2、och3；最優(yōu)選為h。

通式i中，r3是n或o。優(yōu)選為n。

當(dāng)上述優(yōu)選條件的組合，所得到的通式i的化合物，是本發(fā)明中關(guān)于靶向熒光染料的優(yōu)選化合物。該組合可舉例為，當(dāng)r1和r2均為h，而r3是n時，所獲得的化合物視為本發(fā)明代表性的優(yōu)選化合物，具備如下dfa1的結(jié)構(gòu)描述：

使上述本發(fā)明的靶向熒光染料與載藥羥基磷灰(d@hap)石結(jié)合，獲得靶向熒光染料修飾的載藥羥基磷灰石。具體一些，是通過靶向熒光染料與載藥羥基磷灰石在乙醇-水體系中充分接觸制得。該說明書中所描述的靶向熒光染料的結(jié)構(gòu)、基團(tuán)選擇與優(yōu)選均適用于該復(fù)合體中的靶向熒光染料結(jié)構(gòu)區(qū)域。根據(jù)所述，則最為優(yōu)選的靶向熒光染料修飾的載藥羥基磷灰石可描述為dfa1修飾的載藥羥基磷灰石，記為dfa1@d@hap。

根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中修飾的載藥羥基磷灰石的制備方法，可經(jīng)適應(yīng)性調(diào)整獲得本發(fā)明的靶向熒光染料修飾的載藥羥基磷灰石的制備方法，該方法可概括性描述為：靶向熒光染料與載藥羥基磷灰石在乙醇-水體系中充分接觸。

更為具體地，所述的制備方法包括包括下述步驟：

(1)制備載藥羥基磷灰石(d@hap)；

(2)以靶向熒光染料對載藥羥基磷灰石進(jìn)行表面修飾。

進(jìn)一步具體的實施方式中，上述步驟(1)是由水可溶性鈣鹽、磷酸鹽及藥物在乙醇-水體系中，于室溫條件下反應(yīng)制備載藥羥基磷灰石(d@hap)。其中，所述的可溶性鈣鹽優(yōu)選但不限于ca(no3)2·4h2o；所述的可溶性磷酸鹽優(yōu)選但不限于(nh4)2hpo4。

另一方面，該所述載藥羥基磷灰石中述及的藥物選自：阿霉素、紫杉醇、順鉑、吉西他濱、氟尿嘧啶、蓋諾、表阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、博萊霉素、多帕菲或其衍生物。尤其優(yōu)選優(yōu)選阿霉素(dox)、鹽酸阿霉素(dox·hcl)或其衍生物。其可舉例但不限于：阿霉素、吡喃阿霉素、表柔比星、米托蒽醌。

另一方面，所述的步驟(2)是在室溫條件下，靶向熒光染料與載藥羥基磷灰石在乙醇-水體系中充分接觸。該接觸可舉例描述為：室溫條件(25℃)下，靶向熒光染料與載藥羥基磷灰石在乙醇-水體系中攪拌反應(yīng)10～30h。

上述方法所制備的載藥羥基磷灰石是棒狀材料，平均長度是60-130nm，平均直徑15-50nm。

進(jìn)一步的具體實施方式中，上述靶向熒光染料修飾的載藥羥基磷灰石的制備方法包括如下步驟：

(1)向100ml濃度為15～30mg/ml、ph為10.5±0.5的ca(no3)2·4h2o的乙醇溶液中緩慢滴加20～50ml的濃度為6～10mg/ml的藥物-水溶液，攪拌5～15min后，滴加50ml濃度為60～100mg/ml的(nh4)2hpo4水溶液，繼續(xù)攪拌1～2h；混合物在室溫條件下(25℃下)反應(yīng)72-96h后，高速離心，沉淀物洗滌干燥，得到載藥羥基磷灰石；

(2)將質(zhì)量比1：100～5:50的200mg靶向熒光染料、載藥羥基磷灰石的混合物加入到50～100ml含25％(v/v)乙醇的去離子水溶液中以1000r/min攪拌0.5～2h，繼續(xù)以600r/min攪拌12～24h后，高速離心，沉淀物洗滌干燥，得到靶向熒光染料修飾的載藥羥基磷灰石。

上述本發(fā)明的方法制得的表面修飾靶向熒光染料的載藥羥基磷灰石基于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶靶向且酸敏響應(yīng)性羥磷灰石納米藥物載體被用于靶向傳輸抗癌藥物，所得納米藥物載體的結(jié)構(gòu)驗證、大小和形態(tài)等基本性能分別采用傅里葉紅外光譜分析儀(ftir)、zeta電位分析儀、透射電子顯微鏡(tem)來測定。其對抗癌藥物負(fù)載能力的大小則采用紫外可見分光光度計、熒光顯微鏡來進(jìn)行驗證，并通過體外細(xì)胞實驗及組織成像來檢測該納米藥物載體的靶向治療效果。

此外，該納米藥物載體還通過細(xì)胞實驗來評價這一可定向傳輸抗癌藥物到腫瘤細(xì)胞的靶向體系，即采用人肝細(xì)胞(hl-7702)、非洲綠猴腎細(xì)胞(cos-7)、人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞(hct-116)、乳腺腫瘤細(xì)胞(mcf-7)、宮頸腫瘤細(xì)胞(hela)、人卵巢腫瘤細(xì)胞(a2780)來進(jìn)行體外的細(xì)胞毒性實驗，以測定表面修飾靶向熒光染料的載藥羥基磷灰石對不同細(xì)胞的細(xì)胞毒性。其中cos-7，hl-7702為正常細(xì)胞，后者有一定ggt表達(dá)，hct-116、mcf-7，hela以及a2780為腫瘤細(xì)胞，將兩組進(jìn)行對比實驗。

下述非限制性實施例用于對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明內(nèi)容任何形式的限定。

實施例1.dfa1@dox@hap的制備

1.1載藥羥基磷灰石(dox@hap)的合成

采用沉淀水熱法結(jié)合，稱取30mg鹽酸阿霉素，1.490g的ca(no3)2·4h2o和0.495g的(nh4)2hpo4分別溶于2ml的超純水，30ml的無水乙醇和2ml的超純水中，并將ca(no3)2·4h2o的乙醇溶液ph調(diào)節(jié)至10.5左右。在這種堿性環(huán)境下，邊攪拌邊緩慢滴加鹽酸阿霉素的水溶液，穩(wěn)定10min后，繼續(xù)滴加(nh4)2hpo4水溶液，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌1h，然后將渾濁液倒入反應(yīng)釜中，25℃條件下室溫反應(yīng)72h，然后高速離心，用超純水和無水乙醇多次洗滌產(chǎn)物，60℃下真空干燥12h，研磨，即得樣品。

1.2修飾靶向熒光染料的載藥羥基磷灰石(dfa1@dox@hap)

稱取10mg靶向熒光染料dfa1和200mg載藥羥基磷灰石dox@hap溶于50ml的含25％(w/w)的乙醇去離子水中，先攪拌0.5～2h，繼續(xù)以600r/min攪拌12～24h后，高速離心，沉淀物洗滌干燥，得到表面修飾靶向熒光染料的載藥羥基磷灰石(dfa1@dox@hap)。

實施例2.表面修飾靶向熒光染料的載藥羥基磷灰石基本性能的測試

2.1表面修飾靶向熒光染料的載藥羥基磷灰石大小和形態(tài)的測試

實施例1所得表面修飾靶向熒光染料的載藥羥基磷灰石的形態(tài)大小采用透射電子顯微鏡來觀察確定，測試結(jié)果見圖1。從透射電子顯微鏡圖片可以明顯看出，通過共沉淀的方法合成的dfa1@dox@hap納米顆粒，其形態(tài)為棒狀，平均長度是60-130nm，平均直徑15-50nm，不易聚集，分散性較好。

2.2高級傅里葉變換紅外光譜測定

取1-2mg表面修飾靶向熒光染料的載藥羥基磷灰石樣品在瑪瑙研缽中與干燥的溴化鉀粉末(a.r.級)混合并研磨成細(xì)粉末，裝入模具中，在壓片機(jī)上壓制成片后在6700ftir(thermofisher，usa)上測試。測試參數(shù)為：光譜范圍7800-350cm^-1，分辨率0.09cm^-1，溫度25℃。測試結(jié)果如圖2所示，和hap的ftir光譜圖比較，dox@hap和dfa1@dox@hap在1641cm^-1，1590cm^-1和1490cm^-1處的峰是羧基的伸縮振動和平面彎曲振動。此外，612cm^-1處的峰是hap羰基的伸縮振動，1002cm^-1處的峰是hap的po4^3-特征峰。說明靶向熒光染料很好的修飾到材料的表面。

2.3zeta電位的測定

zeta電位的測量在納米粒度及zeta電位分析儀(nanozs90，uk)上進(jìn)行。測試參數(shù)為：溫度25℃，測試數(shù)遍取平均值。測試結(jié)果如圖3所示，由于羥磷灰石幾乎是電中性的，故測其zeta電位接近于零，與阿霉素?fù)诫s后，電位變化不大；在摻雜阿霉素的羥磷灰石材料表面修飾染料分子后，電位發(fā)生變化，zeta值變大，表明靶向染料分子已經(jīng)成功的修飾在dox@hap納米顆粒表面。

2.4熒光染料dfa1的光譜測試

稱取一定質(zhì)量的熒光染料dfa1，將稱好的物質(zhì)分別移入1.5ml的棕色容量瓶里面，用dmso定容，配成濃度2.5mm的母液。采用量程為10μl微量進(jìn)樣器吸取3μl母液，移入3ml測試體系石英池中，攪拌均勻，測其吸收和發(fā)射波長。測試參數(shù)為：熒光染料的最大吸收波長為440nm，最大發(fā)射波長為550nm。

使用上述配置的母液進(jìn)行選擇性實驗，選擇不同的氨基酸以及陰陽離子進(jìn)行檢測，檢測時間為30min。測試參數(shù)為：熒光染料的最大吸收波長為440nm，最大發(fā)射波長為550nm。

熒光染料dfa1的時間響應(yīng)時間曲線和濃度滴定實驗，如圖4a,4b所示。熒光染料與dfa1與ggt的反應(yīng)時間為40min；濃度實驗中，dfa1在15mg/mlggt下即實現(xiàn)飽和。在響應(yīng)的氨基酸與陰陽離子選擇性和競爭性實驗中，如圖4(c)和4(d)所示，表明dfa1具備優(yōu)異的選擇性，對相對應(yīng)得氨基酸和陰陽離子沒有響應(yīng)；再繼續(xù)加入ggt后，熒光信號發(fā)生了明顯響應(yīng)。綜上所述，dfa1熒光染料是一個高選擇性和高靈敏性的ggt識別熒光染料。

實施例3.表面修飾靶向熒光染料的載藥羥基磷灰石光譜性質(zhì)測試

稱取一定質(zhì)量的dfa1@dox@hap，將稱好的物質(zhì)分別移入1.5ml的棕色容量瓶里面，用dmso定容，配成濃度分別為5mg/ml的母液。采用量程為10μl微量進(jìn)樣器吸取3μl母液，移入3ml測試體系石英池中，攪拌均勻，測其吸收和發(fā)射波長。如圖5和圖6的測試結(jié)果表明，當(dāng)dox@hap的表面修飾上靶向腫瘤細(xì)胞表面的熒光染料之后，阿霉素的熒光基本上被完全淬滅，究其原因是dox@hap被熒光染料完全包覆，泄漏率降低。將材料母液進(jìn)行g(shù)gt酶檢測，逐次加入1-50mgggt，檢測時間間隔為30min；當(dāng)熒光信號不變后，降低ph7.4到5.5，在保持?jǐn)嚢璧那闆r下檢測阿霉素?zé)晒庑盘?，時間間隔為10min。光譜測試在紫外分光光度計(agiilent8453，usa)和熒光分光光度計(agiilentcaryecliipse，usa)上進(jìn)行。測試參數(shù)為：熒光染料的最大吸收波長為440nm，最大發(fā)射波長為550nm；抗癌藥物的最大吸收波長為480nm，最大發(fā)射波長為590nm。

使用上述配置的材料母液進(jìn)行生物選擇性實驗，選擇不同的生物活性物質(zhì)進(jìn)行檢測，檢測時間為30min，結(jié)果如圖7所示。表明dfa1@dox@hap測試參數(shù)為：熒光染料的最大吸收波長為480nm，最大發(fā)射波長為600nm。

實施例4.表面修飾靶向熒光染料的載藥羥基磷灰石中藥物釋放測試

在不同ph值下，如圖8所示，藥物的釋放量不同，并且隨著ph的不斷降低，其藥物釋放量不斷增大，阿霉素的熒光不斷增強(qiáng)。并且在同一ph值，不同時間內(nèi)，藥物的釋放量也不斷增大，當(dāng)ph＝5.5時，其藥物的最大釋放量達(dá)到了80％以上，由此說明，合成的該納米載體可以有效地進(jìn)行藥物緩慢釋放，從而達(dá)到治療腫瘤細(xì)胞的效果。

實施例5.表面修飾靶向熒光染料的載藥羥基磷灰石細(xì)胞毒性測試

本實驗選用噻唑藍(lán)mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)分析法，以細(xì)胞的存活率來評估染料對細(xì)胞的毒性大小。分別將對數(shù)生長期的cos-7，hl-7702、hct-116、mcf-7，hela以及a2780細(xì)胞以每毫升1×10⁵個細(xì)胞濃度接種于96孔板中，每孔加入10μl，于37℃、5％co2條件下培養(yǎng)24h，分別加入2.5mg/l，5mg/l，10mg/l，15mg/l，20mg/l的藥物載體dfa1@dox@hap，相同條件下再培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)液，每孔加入mtt溶液(10μl，5mg/ml)孵育4h后，小心吸掉孔內(nèi)上清液并加入200μl的dmso，待甲瓚結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)儀上測定570nm的吸光值od，選擇490nm作為參考波長，平行測定三次。細(xì)胞存活率＝(od實驗組-od空白對照)/(od陽性對照-od空白對照)×100％，空白對照為不加藥物載體組。

細(xì)胞毒性是衡量納米載體用于活細(xì)胞成像性能好壞的一項重要指標(biāo)。測試結(jié)果如圖9所示，從中可以看出，10mg/l納米載體與cos-7，hl-7702、hct-116、mcf-7，hela以及a2780細(xì)胞共培養(yǎng)24h之后，細(xì)胞存活率分別在83％、117％、34％、29％、24％和25％左右，表明該納米載體對正常細(xì)胞具有較低的細(xì)胞毒性，對谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有高細(xì)胞毒性。

實施例6.表面修飾靶向熒光染料的載藥羥基磷灰石體外吸收的細(xì)胞成像實驗

實驗過程中用到的細(xì)胞主要有人肝細(xì)胞(hl-7702)、非洲綠猴腎細(xì)胞(cos-7)、人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞(hct-116)、乳腺腫瘤細(xì)胞(mcf-7)、宮頸腫瘤細(xì)胞(hela)、人卵巢腫瘤細(xì)胞(a2780)。

細(xì)胞孵育：待貼壁生長的細(xì)胞長滿瓶底，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，并用pbs緩沖溶液洗兩次。加入適量胰酶進(jìn)行消化，然后加入新鮮的培養(yǎng)基吹掉貼壁細(xì)胞，棄去部分細(xì)胞懸液，再加入適量新鮮的培養(yǎng)基，放置在37℃，5％co2的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)基為加入10％的胎牛血清和0.1％的硫酸慶大霉素的dmem培養(yǎng)基。實驗操作過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中以每毫升2×10⁵個細(xì)胞密度種上細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待用。

進(jìn)行細(xì)胞成像時，將12μl母液(10mg/ml)加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37℃及5％co2條件下培養(yǎng)30min后小心地用pbs溶液沖洗除去未進(jìn)入細(xì)胞的染料，加入2ml新dmem培養(yǎng)基后在olympusfv1000-ix81激光共聚焦熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察明場和熒光圖像。測試結(jié)果如圖10所示，從中可以看出，納米載體0.5h后幾乎沒有進(jìn)入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶低表達(dá)的細(xì)胞(cos-7)。hl-7702、hct-116、mcf-7，hela以及a2780細(xì)胞有納米載體攝入并具有強(qiáng)黃色熒光。在75min后，對于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶過表達(dá)的5種細(xì)胞中，正常細(xì)胞hl-7702中紅色通道沒有明顯信號，表明羥基磷灰石中的藥物沒有釋放，而其余四種腫瘤細(xì)胞中納米載體攝入量就大大增多，紅色通道熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。以上實驗結(jié)果表明，納米載體dfa1@dox@hap能夠特異性識別谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶過表達(dá)的細(xì)胞，并且對腫瘤細(xì)胞有著極強(qiáng)的藥物釋放效率。

實施例7.表面修飾靶向熒光染料的載藥羥基磷灰石與癌癥組織切片的細(xì)胞成像實驗

實驗過程中用到的組織切片選自皮下腫瘤的裸鼠內(nèi)，選取適量大小的瘤體進(jìn)行冰凍切片。

進(jìn)行組織切片成像時，將12μl母液(10mg/ml)加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37℃及5％co2條件下培養(yǎng)4h后小心地用pbs溶液沖洗除去未進(jìn)入細(xì)胞的染料，加入2ml新dmem培養(yǎng)基后在olympusfv1000-ix81激光共聚焦熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察明場和熒光圖像。測試結(jié)果如圖11所示，從中可以看出在肝癌組織中，材料大量的吸附在該組織表面，與癌細(xì)胞表面的ggt發(fā)生作用，從其所掃取的熒光曲線可以得出該染料已經(jīng)發(fā)生酸解，大量阿霉素得到釋放；此外從組織深度成像來看，可以證明該材料有效滲透入組織內(nèi)部，可以通過紅色通道觀測內(nèi)部阿霉素(dox)釋放，滲透深度約為500um。以上實驗結(jié)果表明，納米載體dfa1@dox@hap能夠特異性識別腫瘤部位的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶過表達(dá)的細(xì)胞，并且對腫瘤細(xì)胞有著極強(qiáng)的藥物釋放效率，能夠很快的滲透入組織內(nèi)，滲透深度大約為0.5mm，證實納米載體dfa1@dox@hap具有應(yīng)用到組織層面的能力。