本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種地中海貧血癥相關(guān)基因突變的檢測試劑盒、檢測方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：地中海貧血(簡稱地貧)是一種單基因遺傳性血紅蛋白病，是由于調(diào)控珠蛋白合成的基因缺失或突變，導(dǎo)致構(gòu)成血紅蛋白的α鏈和β鏈珠蛋白的合成比例失衡，紅細(xì)胞壽命縮短的一種溶血性貧血。我國南方特別是廣西、廣東、海南為高發(fā)區(qū)。全國90萬人的流行病學(xué)調(diào)查得出的總發(fā)病率為2.46％。其中廣西、廣東、江西、四川和浙江各省的發(fā)病率分別為14.95％、4.11％、2.6％、1.92％和1.20％，此病目前尚無有效的治療方法，所以開展產(chǎn)前診斷和婚前攜帶者篩查，預(yù)防患兒的出生，是優(yōu)生優(yōu)育的重要措施。根據(jù)基因缺陷的分類，臨床上主要分為α鏈珠蛋白地中海貧血及β鏈珠蛋白地中海貧血。α-珠蛋白基因缺失是導(dǎo)致α地貧的主要原因,α鏈珠蛋白地中海貧血基因位于16號染色體短臂13區(qū)3帶(16p13.3)。β鏈珠蛋白地中海貧血基因位于11號染色體短臂1區(qū)2帶(1p1.2)。α靜止型及標(biāo)準(zhǔn)型及β地中海貧血雜合子由于無或僅有輕度貧血，一般稱為α或β地中海貧血基因攜帶者，出現(xiàn)明顯貧血癥狀者稱為地中海貧血患者。α-珠蛋白基因簇包括7個連鎖的α類基因或假基因，即有2個α基因(α1、α2)，1個胚胎類基因(ζ2)，3個假基因(фζ1、фα2、фα1)和1個未知功能基因(θ)，全長約29kb。我國最常見、最早鑒定基因點突變的地貧是αqsα、αcsα。αqsα是α2基因第125密碼子ctg亮氨酸突變?yōu)閏cg(脯氨酸)，是一種高度不穩(wěn)定的α珠蛋白，阻礙α1、β1二聚體的形成，從而影響四聚體的合成；另外，αcsα是α2基因終止密碼突變，使α鏈延長為172個氨基酸，這種突變基因轉(zhuǎn)錄的mrna不穩(wěn)定，致α鏈障礙。研究發(fā)現(xiàn)缺失突變常見的3種α地貧主要由--sea、-α3.7、-α4.2缺失引起。β地貧主要分兩種類型，即β0地貧和β+地貧，分別是β鏈完全不能合成和β鏈合成量減少所致。β基于突變已發(fā)現(xiàn)有100多種，國內(nèi)已報道28種，常見有6種：cd41/42(-tctt)缺失4個堿基，造成閱讀框架突變，使終止密碼子提前出現(xiàn)，幾乎無β-鏈合成(β0地貧)，占45％；ivs-ii654(c→t)，內(nèi)含子ii中654位點c→t堿基替換，導(dǎo)致潛在拼接位點活化，mrna加工異常，不能翻譯成正常的β鏈(β0地貧)，占24％；cd17(a→t)，導(dǎo)致終止密碼tag形成，β鏈不能合成(β0地貧)，約占14％；-28(a→g)，突變位于起始位點上游的啟動子tata盒，使轉(zhuǎn)錄效率降低，mrna生成量減少(β+地貧)，約占9％；cd71/72(+1)，在第71和72位密碼子間插入1個堿基a，造成閱讀框架改變，mrna不能翻譯為正常β鏈(β0地貧)，約占2％；cd26(g→a)，26密碼子由g變a(hbe)，影響了mrna加工，βemrna合成減少，β鏈減少(β+地貧)，約占2％。由于α-珠蛋白基因簇的高g+c含量和高同源性，pcr擴(kuò)增難度大，而且其中有的引物設(shè)計欠合理，給結(jié)果的判定造成許多麻煩，不利于在實踐中推廣應(yīng)用。因此，就提要設(shè)計出更合理的地中海貧血癥相關(guān)基因突變的檢測方法。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的在于提供一種地中海貧血癥相關(guān)基因突變的檢測試劑盒，本發(fā)明的第二個目的在于地中海貧血癥相關(guān)基因突變的檢測試劑盒的應(yīng)用，本發(fā)明的第三個目的在于提供地中海貧血癥相關(guān)基因突變的檢測方法，本發(fā)明的第四個目的在于提供地中海貧血癥相關(guān)基因突變的檢測方法的應(yīng)用，以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的檢測結(jié)果準(zhǔn)確性差的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種地中海貧血癥相關(guān)基因突變的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括：用于檢測--sea缺失突變的上游引物a、下游引物b和下游引物c；用于檢測-α3.7缺失突變的上游引物d、下游引物e和下游引物f；用于檢測-α4.2缺失突變的上游引物g、下游引物h和下游引物l；用于擴(kuò)增hba1基因及其附近區(qū)域的擴(kuò)增引物ba1-f和擴(kuò)增引物ba1-r；用于擴(kuò)增hba2基因及其附近區(qū)域的擴(kuò)增引物ba2-f和擴(kuò)增引物ba2-r；用于擴(kuò)增hbb基因及其附近區(qū)域的擴(kuò)增引物bb1-f和擴(kuò)增引物bb1-r，以及擴(kuò)增引物bb2-f和擴(kuò)增引物bb2-r；用于檢測hba1基因及其附近區(qū)域的測序引物hba1-1、測序引物hba1-2和測序引物hba1-3；用于檢測hba2基因及其附近區(qū)域的測序引物hba2-1、測序引物hba2-2和測序引物hba2-3；用于檢測hbb基因及其附近區(qū)域的測序引物hbb-1、測序引物hbb-2、測序引物hbb-3和測序引物hbb-4；所述上游引物a為：tgactccaataaatggatgaggac(sedidno.1)；所述下游引物b為：cagttgggggatgtagataacg(sedidno.2)；所述下游引物c為：gatatatgggtctggaagtgtatc(sedidno.3)；所述上游引物d為：tacccagagccaagtttgtttatc(sedidno.4)；所述下游引物e為：cacattccgggatagagagaac(sedidno.5)；所述下游引物f為：gtttgctgagggaaaaaactcag(sedidno.6)；所述上游引物g為：ctcagcccagatcaagaaacaatg(sedidno.7)；所述下游引物h為：tccttggtctgagacaggtaaac(sedidno.8)；所述下游引物l為：gttggatcttctcatttcccctc(sedidno.9)；所述擴(kuò)增引物ba1-f為：ggttccagctattgctttgtttac(sedidno.10)；所述擴(kuò)增引物ba1-r為：gtttgctgagggaaaaaactcag(sedidno.11)；所述擴(kuò)增引物ba2-f為：ggctctgcgcagaaattcttttg(sedidno.12)；所述擴(kuò)增引物ba2-r為：cacattccgggatagagagaac(sedidno.13)；所述擴(kuò)增引物bb1-f為：agatatatcttagagggagggctg(sedidno.14)；所述擴(kuò)增引物bb1-r為：acttccacactgatgcaatcattc(sedidno.15)；所述擴(kuò)增引物bb2-f為：gaatgattgcatcagtgtggaagt(sedidno.16)；所述擴(kuò)增引物bb2-r為：ttaggcagaatccagatgctcaag(sedidno.17)；所述測序引物hba1-1為：gtttgctgagggaaaaaactcag(sedidno.18)；所述測序引物hba1-2為：cgctcaccttgaagttgacc(sedidno.19)；所述測序引物hba1-3為：agagtgaggggtggggtttg(sedidno.20)；所述測序引物hba2-1為：ggctctgcgcagaaattcttttg(sedidno.21)；所述測序引物hba2-2為：cacattccgggatagagagaac(sedidno.22)；所述測序引物hba2-3為：gagaagcagagtgaggggt(sedidno.23)；所述測序引物hbb-1為：agatatatcttagagggagggctg(sedidno.24)；所述測序引物hbb-2為：aggagaccaatagaaactgggc(sedidno.25)；所述測序引物hbb-3為：gaatgattgcatcagtgtggaagt(sedidno.26)；所述測序引物hbb-4為：ttaggcagaatccagatgctcaag(sedidno.27)。進(jìn)一步的，所述測序引物hba2-1、測序引物hbb-1、測序引物hbb-2以及測序引物hbb-3的測序方向為正向；所述測序引物hba1-1、測序引物hba1-2和測序引物hba1-3、測序引物hba2-2和測序引物hba2-3以及測序引物hbb-4的測序方向為反向。進(jìn)一步的，所述檢測--sea缺失突變時，上游引物a和下游引物b組成一個pcr反應(yīng)，上游引物a和下游引物c組成一個pcr反應(yīng)；所述檢測-α3.7缺失突變時，上游引物d和下游引物e組成一個pcr反應(yīng)，上游引物d和下游引物f組成一個pcr反應(yīng)；所述檢測-α4.2缺失突變時，上游引物g和下游引物h組成一個pcr反應(yīng)，上游引物g和下游引物l組成一個pcr反應(yīng)。進(jìn)一步的，分別應(yīng)用所述上游引物a和下游引物b，上游引物a和下游引物c，上游引物d和下游引物e，上游引物d和下游引物f，上游引物g和下游引物h，上游引物g和下游引物l，擴(kuò)增引物ba1-f和擴(kuò)增引物ba1-r，擴(kuò)增引物ba2-f和擴(kuò)增引物ba2-r，擴(kuò)增引物bb1-f和擴(kuò)增引物bb1-r，以及擴(kuò)增引物bb2-f和擴(kuò)增引物bb2-r進(jìn)行pcr反應(yīng)時的反應(yīng)條件包括：步驟(a)，95℃2min；步驟(b)，95℃20s；步驟(c)，68℃→55℃，緩慢降溫30s；步驟(d)，72℃1min；步驟(e)，72℃3min；所述步驟(b)至步驟(d)循環(huán)33次。進(jìn)一步的，所述步驟(c)具體為68℃→55℃，每秒降0.5℃，至55℃后保持，共30s。另外，本發(fā)明還提供了所述的檢測試劑盒在診斷地中海貧血癥中的應(yīng)用。進(jìn)一步的，所述地中海貧血癥包括α鏈珠蛋白地中海貧血和β鏈珠蛋白地中海貧血。另外，本發(fā)明還提供了地中海貧血癥相關(guān)基因突變的檢測方法，所述檢測方法應(yīng)用了所述的檢測試劑盒，所述檢測方法包括：步驟(i)，從采集血液或者口腔細(xì)胞作為待測樣品；步驟(ii)，對待測樣品進(jìn)行dna提取，并檢測所述dna的濃度；步驟(iii)，以所述dna為模板，分別應(yīng)用所述上游引物a和下游引物b，上游引物a和下游引物c，上游引物d和下游引物e，上游引物d和下游引物f，上游引物g和下游引物h，上游引物g和下游引物l進(jìn)行pcr反應(yīng)，并對pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；步驟(iv)，以所述dna為模板，應(yīng)用所述擴(kuò)增引物ba1-f和擴(kuò)增引物ba1-r進(jìn)行擴(kuò)增獲得hba1基因片段，并應(yīng)用所述測序引物hba1-1、測序引物hba1-2和測序引物hba1-3進(jìn)行測序；應(yīng)用所述擴(kuò)增引物ba2-f和擴(kuò)增引物ba2-r進(jìn)行擴(kuò)增獲得hba2基因片段，并應(yīng)用所述測序引物hba2-1、測序引物hba2-2和測序引物hba2-3進(jìn)行測序；應(yīng)用所述擴(kuò)增引物bb1-f和擴(kuò)增引物bb1-r，以及擴(kuò)增引物bb2-f和擴(kuò)增引物bb2-r進(jìn)行擴(kuò)增獲得hba2基因片段，并應(yīng)用所述測序引物hbb-1、測序引物hbb-2、測序引物hbb-3和測序引物hbb-4進(jìn)行測序；步驟(v)，對步驟(iii)中的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，以及步驟(iv)中的測序得到的測序峰圖進(jìn)行分析，并記錄突變信息；步驟(vi)，將步驟(v)中的分析結(jié)果和突變信息與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到檢測報告。另外，本發(fā)明還提供了所述的檢測方法在診斷地中海貧血癥中的應(yīng)用。進(jìn)一步的，所述地中海貧血癥包括α鏈珠蛋白地中海貧血和β鏈珠蛋白地中海貧血。本發(fā)明提供的檢測試劑盒能夠用于檢測婚前、孕期、新生兒、地貧高發(fā)地區(qū)人群以及地貧家族遺傳史等多種類型的患者，能夠準(zhǔn)確、全面、直觀、簡易的對地中海貧血癥相關(guān)的基因突變的情況進(jìn)行檢測，檢測的突變范圍包括基因組上hba1、hba2、hbb基因及附近區(qū)域，具有簡便準(zhǔn)確、重復(fù)性好、易于推廣應(yīng)用等特點。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明提供的地中海貧血癥相關(guān)基因突變的檢測方法的技術(shù)路線圖；圖2為--sea、-α3.7、-α4.2缺失突變pcr檢測示意圖；圖3為-α3.7、-α4.2、cs、qs及ws突變樣品的pcr產(chǎn)物電泳圖；圖4為--sea突變樣品的pcr產(chǎn)物電泳圖；圖5為cs雜合突變樣品hba2基因的測序結(jié)果圖；圖6為qs雜合突變樣品hba2基因的測序結(jié)果圖；圖7為ws雜合突變樣品hba2基因的測序結(jié)果圖；圖8為正常樣品hba1基因的測序結(jié)果圖；圖9為正常樣品hbb基因的測序結(jié)果圖。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。如無特別說明，本發(fā)明中涉及的“地貧”，代表“地中海貧血”。針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，發(fā)明人設(shè)計了合理的pcr引物，優(yōu)化了pcr條件，建立了簡便準(zhǔn)確、重復(fù)性好、易于推廣應(yīng)用的診斷技術(shù)。本發(fā)明提供的檢測試劑盒或者檢測方法，檢測的突變范圍包括基因組上hba1、hba2、hbb基因及附近區(qū)域，可檢測的突變類型見表1：表1為了有助于更清楚的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，現(xiàn)通過具體的實施例，詳細(xì)介紹如下。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種化學(xué)試劑和生物制劑，均為市售產(chǎn)品，其中所用實驗設(shè)備在無特殊說明情況下均可以使用以下試劑和儀器：實施例1本實施例提供了地中海貧血癥相關(guān)基因突變的檢測方法，其技術(shù)路線圖如圖1所示。本實施例提供的檢測方法包括以下步驟：一、采集樣品二、對樣品進(jìn)行dna提取，dna提取可使用本領(lǐng)域目前的各種常規(guī)試劑，提取基因組dna可以參照現(xiàn)有的常規(guī)方法即可進(jìn)行三、pcr反應(yīng)檢測三種常見的α地貧缺失突變(1)--sea、-α3.7、-α4.2缺失突變pcr檢測示意圖見圖2，a、b、c、d、e、f、g、h、l均表示引物，箭頭表示引物方向，即5’-3’。(2)檢測三種α地貧缺失突變的引物設(shè)計見表2：表2四、pcr反應(yīng)及sanger測序檢測檢測α地貧和β地貧相關(guān)基因：hba1、hba2、hbb基因及附近區(qū)域突變信息。(1)檢測hba1、hba2、hbb基因及附近區(qū)域的擴(kuò)增引物設(shè)計見表3：表3(2)檢測hba1、hba2、hbb基因及附近區(qū)域的sanger測序引物設(shè)計見表4：表4備注：單向測序時出現(xiàn)可能是插入缺失突變時，從另一端補(bǔ)sanger測序。其中，上述過程中涉及的pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為：pcr反應(yīng)所用pcr試劑為transstartfastpfuflydnapolymerase(全式金，目錄號ap231)，該試劑盒種的pcr酶擴(kuò)增速度：4-6kb/min，反應(yīng)體系見表5，pcr反應(yīng)條件見表6：表5成分體積/μl基因組dna(30-100ng/μl)2上引物(10μm)0.5下引物(10μm)0.55×transstartfastpfuflybuffer42.5mmdntp2transstartfastpfuflydnapolymerase0.5pcrstimulant2ddh2o8.5總體積20表6五、對pcr和測序結(jié)果進(jìn)行分析本實施例提供的檢測試劑盒及應(yīng)用其的檢測方法，在地貧基因檢測分析的方案中，能夠比較全面的去篩查地貧相關(guān)基因，而不是直接用其他方法檢測已知致病突變位點，操作簡便，結(jié)果直觀。另外，本申請的方案中引物特異性好，解決了α-珠蛋白基因高同源性造成的擴(kuò)增困難，優(yōu)化了pcr反應(yīng)條件，建立了準(zhǔn)確、重復(fù)性好、易于推廣的檢測體系，能在同一程序下一次完成要擴(kuò)增的dna片段，反應(yīng)時間也大大縮短。實施例2本實施例提供了地中海貧血相關(guān)基因突變的檢測方法，目標(biāo)為檢測α、β地中海貧血相關(guān)基因突變情況，使用了實施例1中涉及的引物和pcr優(yōu)化方案，所選樣品為7例人的外周血樣品，其中6例為已知的--sea、-α3.7、-α4.2、cs、qs、ws雜合突變，1例為正常人的樣品，外周血樣品來源于深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院兒科。一、外周血樣品的采集與處理(1)用含edta的真空采血管采集外周血2ml，提取基因組dna用量200μl。(2)外周血基因組dna提取用血液基因組dna提取試劑盒(dp318，天根生物)。(3)使用nanodrop2000型分光光度計測定其濃度，依據(jù)od260nm和od280nm比值確認(rèn)其純度高。二、pcr反應(yīng)以及核酸瓊脂糖凝膠電泳(1)按照
發(fā)明內(nèi)容中的引物和反應(yīng)體系來進(jìn)行pcr反應(yīng)，并對6個雜合突變樣品進(jìn)行核酸瓊脂糖凝膠電泳，膠濃度1％。(2)電泳圖如圖3、4：其中，圖3中，1、2為-α3.7雜合突變樣品的pcr產(chǎn)物，其中1所用引物為d、e，2中所用引物為d、f；3、4為-α4.2雜合突變樣品的pcr產(chǎn)物，其中3所用引物為g、h，4中所用引物為g、l；5、6、7分別為cs、qs、ws突變樣品的pcr產(chǎn)物，所用引物為ba2-f和ba2-r。圖4中，1、2為--sea雜合突變樣品的pcr產(chǎn)物，其中1所用引物為a、c，2中所用引物為a、b。pcr反應(yīng)使用的模板為從相應(yīng)的6例人血中提取的基因組dna。三、sanger測序檢測hba1、hba2、hbb基因及附近區(qū)域，測序結(jié)果見圖5、圖6、圖7、圖8和圖9。其中，圖5為cs雜合突變樣品hba2基因的測序結(jié)果圖，cs雜合突變：a＞g(hba2基因)；圖6為qs雜合突變樣品hba2基因的測序結(jié)果圖，qs雜合突變：a＞g(hba2基因)；圖7為ws雜合突變樣品hba2基因的測序結(jié)果圖，ws雜合突變：g＞c(hba2基因)；圖8為正常人hba1基因片段測序結(jié)果；圖9為正常人hbb基因片段測序結(jié)果。四、測序結(jié)果處理及分析(1)依據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(omin、hgmd、clinvar、文獻(xiàn)等)記錄的地中海貧血癥有關(guān)的致病突變位點為依據(jù)。(2)記錄瓊脂糖凝膠電泳和測序結(jié)果，找出突變位點并記錄，與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對找出是否有已知致病突變，如果發(fā)現(xiàn)未知突變可由專業(yè)基因突變解讀人員對突變進(jìn)行解讀，協(xié)助臨床醫(yī)生下診斷結(jié)論。(3)堅持以表型結(jié)合基因型的診斷原則：①②①表型與基因型相符，如表7：表7②表型與基因型不符，如：典型小細(xì)胞低色素地貧表型，基因檢測結(jié)果為陰性。提示受檢者很可能為罕見或者未知基因突變類型，必須進(jìn)行下一步檢測予以確診。在本實施例中，針對7例樣品準(zhǔn)確檢測出了常見的--sea、-α3.7、-α4.2、cs、qs、ws雜合突變，檢測范圍覆蓋了hba1、hba2、hbb基因及基因附件相關(guān)的所有位點。本發(fā)明提供的檢測試劑盒或者檢測方法，能夠準(zhǔn)確、全面、直觀、簡易的方法對人類地中海貧血癥相關(guān)的基因突變的情況進(jìn)行檢測，檢測的突變范圍包括基因組上hba1、hba2、hbb基因及附近區(qū)域，可檢測的突變類型見上述表1。另外，本發(fā)明提供的檢測試劑盒或者檢測方法，適用于婚前、孕期、新生兒、地貧高發(fā)地區(qū)人群以及地貧家族遺傳史，臨床血液學(xué)表型異常，比如：mcv和(或)mch異常(排除缺鐵性貧血)、hba2百分比異常、hbf百分比異常等多類人群。最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。sequencelisting<110>深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院<120>地中海貧血癥相關(guān)基因突變的檢測試劑盒、檢測方法及其應(yīng)用<130>2017<160>27<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<400>1tgactccaataaatggatgaggac24<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2cagttgggggatgtagataacg22<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3gatatatgggtctggaagtgtatc24<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列<400>4tacccagagccaagtttgtttatc24<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5cacattccgggatagagagaac22<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<400>6gtttgctgagggaaaaaactcag23<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列<400>7ctcagcccagatcaagaaacaatg24<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8tccttggtctgagacaggtaaac23<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列<400>9gttggatcttctcatttcccctc23<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列<400>10ggttccagctattgctttgtttac24<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列<400>11gtttgctgagggaaaaaactcag23<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列<400>12ggctctgcgcagaaattcttttg23<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列<400>13cacattccgggatagagagaac22<210>14<211>24<212>dna<213>人工序列<400>14agatatatcttagagggagggctg24<210>15<211>24<212>dna<213>人工序列<400>15acttccacactgatgcaatcattc24<210>16<211>24<212>dna<213>人工序列<400>16gaatgattgcatcagtgtggaagt24<210>17<211>24<212>dna<213>人工序列<400>17ttaggcagaatccagatgctcaag24<210>18<211>23<212>dna<213>人工序列<400>18gtttgctgagggaaaaaactcag23<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列<400>19cgctcaccttgaagttgacc20<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<400>20agagtgaggggtggggtttg20<210>21<211>23<212>dna<213>人工序列<400>21ggctctgcgcagaaattcttttg23<210>22<211>22<212>dna<213>人工序列<400>22cacattccgggatagagagaac22<210>23<211>19<212>dna<213>人工序列<400>23gagaagcagagtgaggggt19<210>24<211>24<212>dna<213>人工序列<400>24agatatatcttagagggagggctg24<210>25<211>22<212>dna<213>人工序列<400>25aggagaccaatagaaactgggc22<210>26<211>24<212>dna<213>人工序列<400>26gaatgattgcatcagtgtggaagt24<210>27<211>24<212>dna<213>人工序列<400>27ttaggcagaatccagatgctcaag24當(dāng)前第1頁12