本發(fā)明涉及一種提取高純度橙黃酮的方法，具體涉及一種從貓須草中提取橙黃酮含量≥98%產(chǎn)品的方法。

背景技術(shù)：

貓須草（clerodendranthusspicathus(thunb.)c.y.wu）為唇形科，腎茶屬植物，原名腎茶，又名貓須公、牙努秒等。貓須草為多年生草本植物，生于林下陰涼潮濕處，主要分布于印度尼西亞、馬來西亞等東南亞地區(qū)，我國主產(chǎn)于廣東、廣西、云南、福建及臺灣等。貓須草是一種藥食兩用的植物，性涼，味苦，氣清香。

貓須草具有顯著的藥理療效，現(xiàn)代藥理研究證明，貓須草的藥理功能主要體現(xiàn)在以下幾個方面：利尿排石、涼血、消炎；改善腎臟功能；抗氧化；消炎抗菌；治療糖尿??；降血壓；抗腫瘤等。貓須草的化學成分主要為黃酮類、酚酸類及萜類等，其中，黃酮類以多甲基取代為主，為脂溶性成分，而水溶性性成分以酚酸居多。

橙黃酮（sinensetin）是貓須草黃酮類成分中的一種，化學名：5,6,7,3’,4’-五甲氧基黃酮，分子式：c20h20o7，分子量：372.27，分子結(jié)構(gòu)式如下：

橙黃酮微溶于水，易溶于甲醇、乙醇及乙酸乙酯等有機溶劑。

cn101143160a公開了一種腎茶提取物及制備方法和用途，是將腎茶用乙醇回流提取，后經(jīng)大孔吸附樹脂分離純化，獲得含腎茶酚酸50～85%的提取物。該方法使用d-101樹脂純化，雖能獲得高含量的腎茶酚酸，但優(yōu)越樹脂的選擇性較差，最終獲得的產(chǎn)品是腎茶酚酸和黃酮類的混合物，不能獲得高純產(chǎn)品。

cn103127214a公開了一種治療糖尿病腎病的腎茶有效部位及其制備方法，是將腎茶使用30～80%的乙醇回流提取2次，然后大孔吸附樹脂純化，從而獲得腎茶總黃酮50%以上提取物，該提取物主要由佩蘭素、橙黃酮、3’-羥基-5,6,7,4’-四甲氧基黃酮等甲氧基黃酮類組成，得到產(chǎn)品可與現(xiàn)有可知的食品、藥物賦形劑混合通過劑型制備工藝，制成具有治療糖尿病腎病的藥物、食品及保健品。該方法工藝簡單，雖可獲得腎茶總黃酮提取物，但只是一種粗品，并沒有提到或解決從中提取高純度橙黃酮的技術(shù)。

cn105687309a公開了一種貓須草藥效成分的萃取方法，是先將貓須草原料烘干，破碎過篩，再使用超臨界co2對原料進行萃取，萃取溫度為40～60℃，萃取壓力15～25mpa，萃取時間60～120min，夾帶劑為乙醇，夾帶劑加入量為萃取釜體積1/10～1/20。該萃取工藝主要對貓須草中的熊果酸、迷迭香酸和齊墩果酸的萃取效果較好，并沒有公開對貓須草中橙黃酮的萃取效果，而且采用超臨界co2技術(shù)對原料直接萃取，滲透率較低，有效成分的提取也較低。

cn104072464a公開了一種橙黃酮提取分離方法，是使用香藜為原料，加生物酶酶解8～10h，酶解原料，再用60～80%乙醇溶液微波或超聲提取2～3次，提取液濃縮至浸膏，加適量水分散后用大孔吸附樹脂分離純化，樹脂型號為nk-9、ads-21和hpd-417，先用水洗脫，再用50～70%乙醇洗脫，洗脫液濃縮后用溶液制備型液相色譜分離，流動相為30～40%乙腈。該方法采用先酶解，再使用60～80%乙醇提取方法，雖然一定程度上提高了橙黃酮的提取率，但由于橙黃酮在水中有一定的溶解性，酶解又在水溶液中進行，會增大橙黃酮的損耗。且大孔吸附樹脂雖可以起到很好的分離效果，但由于其選擇性較差，洗脫濃縮液不經(jīng)過進一步純化，直接使用制備型液相色譜分離，對制備色譜填料污染較大，增大后續(xù)純化的難度，而且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性較差。

cn104193710a公開了一種橙黃酮的制備方法及其在抗白血病藥物中的運用，是取香藜地上部分，用飽和1%氨水浸泡2～6h，曬干，用85～95%乙醇溶液為提取溶劑，加入閃式提取容器中提取，提取液過濾濃縮，經(jīng)氧化鋁柱層析純化，氯仿-丙酮混合溶液洗脫，再經(jīng)制備型液相色譜分離得到橙黃酮。該方法使用閃式提取器，具有提取時間短，提取率高等優(yōu)點，但是存在生產(chǎn)連續(xù)性較差的缺陷，且使用85～95%的高濃度乙醇會提取出大量脂溶性雜質(zhì)，比如葉綠素、揮發(fā)油等，回收完溶劑后，會產(chǎn)生大量沉淀，導致后續(xù)氧化鋁層析分離純化效果較差。

綜上，現(xiàn)有技術(shù)主要是針對貓須草中的總酚酸類和總黃酮類的分離純化，沒有對貓須草中橙黃酮的純化分離進行研究，而目前市場上的貓須草提取物都對橙黃酮有0.2～98%的含量要求，需求量較大，市場前景廣闊，亟待尋找一種從貓須草中提取高純度橙黃酮的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種工藝簡單、成本低，選擇性好，所得產(chǎn)品純度、回收率高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)的從貓須草中提取高純度橙黃酮的方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：一種從貓須草中提取高純度橙黃酮的方法，包括以下步驟：

（1）提取、濃縮、過濾：將貓須草破碎，過篩，置于提取溶劑中連續(xù)逆流提取，冷卻，過濾，真空回收濾液中的溶劑，過濾，得濃縮液；

（2）氧化鋁柱層析分離純化：將步驟（1）所得濃縮液上氧化鋁柱層析，先用水洗至水洗脫液無色，再先后用低度醇水溶液和高度醇水溶液進行洗脫，分別收集洗脫液并真空回收洗脫液中的醇，得酚酸類浸膏和黃酮類浸膏；

（3）超臨界co2萃?。簩⒉襟E（2）所得黃酮類浸膏進行超臨界co2萃取，得萃取浸膏；

（4）制備液相色譜分離純化：將步驟（3）所得萃取浸膏用甲醇溶解，進樣至制備液相設(shè)備中，然后用洗脫劑進行洗脫，并收集目標洗脫液，減壓濃縮，真空干燥，得高純度橙黃酮產(chǎn)品。

本發(fā)明方法所用原料為貓須草地上莖葉，橙黃酮的質(zhì)量含量為0.05～0.15%。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述過篩的目數(shù)為20～60目。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述提取的溫度為40～80℃，提取的時間為2～4h。

優(yōu)選地，步驟（1）中，貓須草原料與提取溶劑的質(zhì)量體積比（kg/l）為1:8～20（更優(yōu)選1:10～15）。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述提取溶劑為體積分數(shù)20～70%（更優(yōu)選30～50%）的甲醇水溶液或體積分數(shù)30～60%（更優(yōu)選40～55%）的乙醇水溶液。貓須草中主要含有酚酸類和黃酮類兩大成分，其中的橙黃酮在水中具有一定溶解性，所以宜用醇提，但醇濃度不宜太高，因為貓須草原料為地上莖葉，大部分為葉子，若醇度太高了會導致大量脂溶性雜質(zhì)成分比如葉綠素，被提取出來，回收完溶劑后，將產(chǎn)生大量沉淀物，對后續(xù)過濾及純化不利，而使用體積分數(shù)20～70%的甲醇水溶液或體積分數(shù)30～60%的乙醇水溶液提取，則可在保證高提取率的條件下又可避免此問題。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述連續(xù)逆流提取設(shè)備為串聯(lián)連續(xù)逆流提取設(shè)備，可串聯(lián)兩套以上使用，提高生產(chǎn)效率；所述提取液用過板式換熱器進行冷卻。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述逆流提取后的溶液，用100～400目濾網(wǎng)過濾。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述真空回收的溫度為40～70℃，壓力為-0.10～-0.07mpa，回收至固含量為5～10%；所述真空回收的設(shè)備為單效濃縮器、雙效濃縮器或三效濃縮器。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述真空回收后的溶液，用陶瓷膜或超濾膜過濾。

優(yōu)選地，所述陶瓷膜的孔徑為0.2～1.0μm（更優(yōu)選0.4～0.6μm），過濾的膜壓為1～4mpa，溫度為30～60℃（更優(yōu)選35～45℃）。

優(yōu)選地，所述超濾膜為高分子材料超濾膜，分子量為0.5～10萬道爾頓（更優(yōu)選2～6萬道爾頓），過濾的膜壓為1～3mpa，溫度為10～30℃。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述低度醇水溶液的體積分數(shù)為20～30%，所述高度醇水溶液的體積分數(shù)為60～80%。先用水洗脫可以去除水溶性雜質(zhì)，氧化鋁柱層析可以有效分離粗提物中的酚酸類和黃酮類物質(zhì)，由于酚酸類物質(zhì)極性較大，而黃酮類物質(zhì)極性較小，所以可以先用體積分數(shù)20～30%的極性較大的溶劑洗脫酚酸類物質(zhì)，后用體積分數(shù)60～80%極性較小的溶劑洗脫黃酮類物質(zhì)以達到分離效果，而現(xiàn)有大孔吸附樹脂由于選擇性較差的問題，很難實現(xiàn)酚酸類和黃酮類物質(zhì)分離，得到的是混合物。高度醇水溶液洗脫后的洗脫液，經(jīng)真空回收洗脫液中的醇，即得黃酮類浸膏。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述低度醇水溶液或高度醇水溶液中的醇為甲醇或乙醇。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述洗脫的流速為0.5～2.0bv/h。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述真空回收的溫度為40～70℃，壓力為-0.10～-0.07mpa，回收至固含量為60～80%。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述氧化鋁為酸性氧化鋁或中性氧化鋁（更優(yōu)選中性氧化鋁），目數(shù)為80～300目（更優(yōu)選100～200目）。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述氧化鋁裝柱的徑高比為1:4～12。

優(yōu)選地，步驟（2）中，使用前，先將氧化鋁在110～600℃（更優(yōu)選400～580℃）的高溫條件下，活化4～24h（更優(yōu)選10～20h）后，再用體積分數(shù)85～99%的乙醇清洗至流出液無色透明，且除乙醇味外無其它氣味為止，最后用水洗至無乙醇味。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述超臨界co2萃取的壓力為30～40mpa，萃取的溫度為30～45℃，萃取≥2次，每次萃取的時間為2～4h。所得黃酮類浸膏含有較深顏色且橙黃酮純度較低，如果直接用制備型高效液相色譜分離，對填料污染較大，處理批次會大大減少，所得產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性較差，尤其是顏色及純度指標，會導致產(chǎn)品顏色較深，純度和收率偏低。黃酮類浸膏中的顏色物質(zhì)主要為殘留的水溶性較好的酚酸類物質(zhì)，使用超臨界co2萃取既可以有效分離酚酸類物質(zhì)也可以提高橙黃酮的純度，因此，在使用制備型液相色譜分離前使用超臨界co2萃取則可以有效解決上述問題。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述黃酮類浸膏與萃取co2流體的質(zhì)量體積比（kg/l）為1:8～30（更優(yōu)選1:10～20），超臨界co2萃取所用夾帶劑的用量為萃取co2流體體積的20～60%，所述夾帶劑為體積分數(shù)80～95%的甲醇或乙醇（更優(yōu)選乙醇）。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述萃取浸膏用甲醇溶解后的質(zhì)量濃度為40～80%（更優(yōu)選45～60%）。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述制備液相色譜的填料為c-18鍵合硅膠，裝柱徑高比為1:4～10。所述制備液相色譜為中低壓色譜柱。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述洗脫劑為乙腈-水或甲醇-水，所述乙腈-水的體積比為40～70:60～30，甲醇-水的體積比為30～90:70～10（更優(yōu)選50～80:50～20）。

優(yōu)選地，步驟（4）中，洗脫的次數(shù)≥1次，洗脫的流速為0.25～1.00bv/h。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述減壓濃縮的溫度為40～80℃，壓力為-0.10～-0.08mpa，濃縮至固含量為40～60%。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述真空干燥的溫度為60～80℃，壓力為-0.10～-0.07mpa，干燥至含水率≤3%。

本發(fā)明方法用水優(yōu)選純水。

本發(fā)明方法的有益效果如下：

（1）本發(fā)明方法通過采用氧化鋁柱層析、超臨界co2萃取及高效制備液色譜技術(shù)進行有機的技術(shù)，使得產(chǎn)品純化效果明顯，從貓須草中提取的橙黃酮產(chǎn)品呈純白色，純度≥98.5%，收率≥91%；

（2）本發(fā)明方法使用的是連續(xù)逆流提取設(shè)備，并且串聯(lián)兩套連續(xù)逆流設(shè)備，既保證了工業(yè)化生產(chǎn)的連續(xù)性，同時在保證提取收率的前提下，提取溶劑用量由原來提取罐相當于原料用量的30～40倍降低到10～20倍，能耗、成本低；

（3）本發(fā)明方法采用了氧化鋁柱層析、超臨界co2萃取和制備型高效液相色譜相結(jié)合的技術(shù)，相比現(xiàn)有氧化鋁柱層析或大孔樹脂吸附與制備型高效液相色譜分離結(jié)合的技術(shù)，具有較明顯的優(yōu)勢：由于大孔樹脂吸附具有選擇性差的缺陷，較難分離酚酸類和黃酮類物質(zhì)，而本發(fā)明方法利用酚酸類和黃酮類極性由大到小的特性，使用氧化鋁柱層析可以實現(xiàn)很好的分離效果；但是，由于氧化鋁柱層析所獲得的也僅僅只是黃酮類粗品，含有一定色素雜質(zhì)，若黃酮類浸膏經(jīng)氧化鋁柱層析或大孔樹脂吸附后，直接用制備型高效液相色譜分離，對填料污染較大，處理批次會大大減少，所得產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性較差，尤其是顏色及純度指標，會導致顏色較深，純度和收率偏低，本發(fā)明方法通過進一步結(jié)合超臨界co2萃取，利用超臨界流體co2的超強的滲透能力，使得橙黃酮的萃取效率更高，純化效果更好，收率更高，既可以有效分離酚酸類物質(zhì)，又可提高橙黃酮的純度，相比有機溶劑萃取技術(shù)，超臨界co2萃取技術(shù)操作簡潔，自動化程度高，溶劑損耗低，生產(chǎn)周期短，從而極大的降低了生產(chǎn)成本；

（4）本發(fā)明方法工藝簡單、成本低，選擇性好，適于工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。

本發(fā)明實施例所使用的貓須草為市售；本發(fā)明實施例所使用的原料或化學試劑，如無特殊說明，均通過常規(guī)商業(yè)途徑獲得。

參考例1

氧化鋁的預處理：先將市售100～200目的中性氧化鋁在550℃的高溫條件下，活化18h后，再用體積分數(shù)95%的乙醇清洗至流出液無色透明，且除乙醇味外無其它氣味為止，最后用水洗至無乙醇味。

實施例1

（1）提取、濃縮、過濾：將100kg貓須草（橙黃酮的質(zhì)量含量為0.0615%）破碎，過20目篩，置于1000l體積分數(shù)30%的甲醇水溶液中，用2套串聯(lián)的連續(xù)逆流提取設(shè)備，在50℃下，連續(xù)逆流提取2h，用過板式換熱器冷卻，先用200目濾網(wǎng)過濾，再用單效濃縮器，在60℃，真空度-0.09mpa下，真空回收濾液中的甲醇至濃縮液固含量為5%，然后用孔徑0.5μm的陶瓷膜，在膜壓3mpa，35℃下過濾，得濃縮液；

（2）氧化鋁柱層析分離純化：將步驟（1）所得濃縮液上氧化鋁柱層析（使用參考例1活化后的中性氧化鋁為填料，裝柱徑高比為1:4），先用純水洗至水洗脫液無色，然后先用體積分數(shù)20%的乙醇水溶液以0.5bv/h的流速洗脫，再用體積分數(shù)70%的乙醇水溶液以1.0bv/h的流速洗脫，分別收集洗脫液，并在60℃，壓力-0.09mpa下，分別真空回收洗脫液中的乙醇至濃縮液固含量為80%，得酚酸類浸膏和黃酮類浸膏；

（3）超臨界co2萃?。簩⒉襟E（2）所得黃酮類浸膏在30mpa，30℃下，超臨界co2萃取4次，每次萃取的時間為2h，得3.8kg萃取浸膏；所用萃取co2流體的體積為40l，夾帶劑為體積分數(shù)80%的乙醇，用量為20l；

（4）制備液相色譜分離純化：將步驟（3）所得3.8kg萃取浸膏用5l甲醇溶解（萃取浸膏的質(zhì)量濃度為49.0%），進樣至中低壓色譜柱的制備液相設(shè)備（填料為c-18鍵合硅膠，裝柱徑高比為1:4）中，再用體積比40:60的乙腈-水，以流速0.25bv/h洗脫2次，并收集目標洗脫液，然后在70℃，-0.09mpa下，減壓濃縮至固含量為40%，最后在80℃，-0.095mpa下，真空干燥至含水率≤3%，得56.83g高純度橙黃酮產(chǎn)品。

本實施例所得高純度橙黃酮產(chǎn)品外觀呈純白色，經(jīng)hplc檢測，橙黃酮的純度為98.5%，收率為91.05%。

實施例2

（1）提取、濃縮、過濾：將100kg貓須草（橙黃酮的質(zhì)量含量為0.0736%）破碎，過40目篩，置于1500l體積分數(shù)50%的乙醇水溶液中，用2套串聯(lián)的連續(xù)逆流提取設(shè)備，在60℃下，連續(xù)逆流提取3h，用過板式換熱器冷卻，先用300目濾網(wǎng)過濾，再用三效濃縮器，在70℃，真空度-0.09mpa下，真空回收濾液中的乙醇至濃縮液固含量為7%，然后用0.5μm孔徑的陶瓷膜，在膜壓4mpa，40℃下過濾，得濃縮液；

（2）氧化鋁柱層析分離純化：將步驟（1）所得濃縮液上氧化鋁柱層析（使用參考例1活化后的中性氧化鋁為填料，裝柱徑高比為1:6），先用純水洗至水洗脫液無色，然后先用體積分數(shù)30%的乙醇水溶液以0.5bv/h的流速洗脫，再用體積分數(shù)60%的乙醇水溶液以0.5bv/h的流速洗脫，分別收集洗脫液，并在70℃，壓力-0.09mpa下，分別真空回收洗脫液中的乙醇至濃縮液固含量為75%，得酚酸類浸膏和黃酮類浸膏；

（3）超臨界co2萃?。簩⒉襟E（2）所得黃酮類浸膏在35mpa，40℃下，超臨界co2萃取2次，每次萃取的時間為3h，得4.3kg萃取浸膏；所用萃取co2流體的體積為50l，夾帶劑為體積分數(shù)90%的乙醇，用量為10l；

（4）制備液相色譜分離純化：將步驟（3）所得4.3kg萃取浸膏用6l甲醇溶解（萃取浸膏的質(zhì)量濃度為47.5%），進樣至中低壓色譜柱的制備液相設(shè)備（填料為c-18鍵合硅膠，裝柱徑高比為1:6）中，再用體積比60:40的乙腈-水，以流速0.5bv/h洗脫2次，并收集目標洗脫液，然后在70℃，-0.09mpa下，減壓濃縮至固含量為50%，最后在80℃，-0.095mpa下，真空干燥至含水率≤3%，得70.36g高純度橙黃酮產(chǎn)品。

本實施例所得高純度橙黃酮產(chǎn)品外觀呈純白色，經(jīng)hplc檢測，橙黃酮的純度為99.1%，收率為94.76%。

實施例3

（1）提取、濃縮、過濾：將100kg貓須草（橙黃酮的質(zhì)量含量為0.0697%）破碎，過60目篩，置于1000l體積分數(shù)50%的甲醇水溶液中，用2套串聯(lián)的連續(xù)逆流提取設(shè)備，在40℃下，連續(xù)逆流提取4h，用過板式換熱器冷卻，先用400目濾網(wǎng)過濾，再用三效濃縮器，在70℃，真空度-0.09mpa下，真空回收濾液中的甲醇至濃縮液固含量為10%，然后用5萬道爾頓的高分子材料超濾膜，在膜壓2mpa，20℃下過濾，得濃縮液；

（2）氧化鋁柱層析分離純化：將步驟（1）所得濃縮液上氧化鋁柱層析（使用參考例1活化后的中性氧化鋁為填料，裝柱徑高比為1:8），先用純水洗至水洗脫液無色，然后先用體積分數(shù)20%的乙醇水溶液以1.0bv/h的流速洗脫，再用體積分數(shù)70%的乙醇水溶液以0.5bv/h的流速洗脫，分別收集洗脫液，并在60℃，壓力-0.09mpa下，分別真空回收洗脫液中的乙醇至濃縮液固含量為80%，得酚酸類浸膏和黃酮類浸膏；

（3）超臨界co2萃?。簩⒉襟E（2）所得黃酮類浸膏在40mpa，45℃下，超臨界co2萃取2次，每次萃取的時間為2h，得5.2kg萃取浸膏；所用萃取co2流體的體積為100l，夾帶劑為體積分數(shù)95%的乙醇，用量為20l；

（4）制備液相色譜分離純化：將步驟（3）所得5.2kg萃取浸膏用4.8l甲醇溶解（萃取浸膏的質(zhì)量濃度為57.8%），進樣至中低壓色譜柱的制備液相設(shè)備（填料為c-18鍵合硅膠，裝柱徑高比為1:8）中，再用體積比70:30的甲醇-水，以流速0.25bv/h洗脫2次，并收集目標洗脫液，然后在70℃，-0.09mpa下，減壓濃縮至固含量為55%，最后在70℃，-0.095mpa下，真空干燥至含水率≤3%，得65.34g高純度橙黃酮產(chǎn)品。

本實施例所得高純度橙黃酮產(chǎn)品外觀呈純白色，經(jīng)hplc檢測，橙黃酮的純度為98.8%，收率為92.56%。