本發(fā)明涉及化工
技術(shù)領域：
，具體來說涉及一種含哌嗪酰胺類楊梅素類衍生物的制備方法及其在抗腫瘤方面的應用。
背景技術(shù)：
：腫瘤是一類病因、病理、臨床表現(xiàn)以及治療均比較復雜的常見病，尤其是惡性腫瘤是嚴重地威脅人類的健康。腫瘤的形成是多因素、多步驟和多基因突變的過程，已知許多化學致癌物能誘發(fā)和促進腫瘤的形成。體外試驗表明楊梅素對人類多種腫瘤細胞有明顯的抑制作用。楊梅素(3',4',5',3,5,7-六羥基黃酮醇，myricetin(myr))，異名楊梅樹皮素、楊梅黃酮、楊梅酮，是一種天然黃酮及多酚類化合物，通常存在于我們?nèi)粘Ｊ秤玫乃?、蔬菜、茶葉和飲料中。大多數(shù)以甙的形式存在，而不是以自由苷的形式存在。同時由于楊梅素具有多種生物活性，如：抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗過敏、降血糖、保肝護肝、抗炎和抗突變等，受到了廣泛科研工作者的關(guān)注。2010年，韋偉等(韋偉,姜慶.楊梅素誘導膀胱癌細胞株biu-87凋亡機制研究[j].重慶醫(yī)科大學學報,2010,12(7):1791-1794.)利用mtt及hoechst33258染色法來研究了楊梅素誘導膀胱癌細胞株biu-87凋亡的機制，通過培養(yǎng)人膀胱癌細胞株biu-87，向其中加入不同濃度楊梅素干擾，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。研究結(jié)果表明：楊梅素能夠誘導膀胱癌細胞biu-87的細胞凋亡，對survivin的轉(zhuǎn)錄和表達有明顯的抑制作用，對caspase-3也有上調(diào)作用。2011年，kang等(kang,n.j.；jung,s.k.；lee,k.w.；lee,h.j.myricetinisapotentchemopreventivephytochemicalinskincarcinogenesis[j].ann.n.y.acad.sci.,2011,1229(1):124-132.)研究了楊梅素對小鼠皮膚癌細胞的抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)：楊梅素是通過減弱紫外線b，誘導cox-2的表達，從而抑制皮膚癌凋亡；通過作用靶標抑菌作用pi3-k誘導的血管生成，因此，楊梅素是一個有前途的抑制皮膚癌的化學預防劑。同年，zhang等(zhang,x.h.；zou,z.q.；xu,c.w.；shen,y.z.；li,d.myricetininducesg2/mphasearrestinhepg2cellsbyinhibitingtheactivityofthecyclinb/cdc2complex[j].mol.med.report.,2011,4:273-277.)進一步研究了楊梅素對肝癌細胞的作用機制，發(fā)現(xiàn)楊梅素是通過降低肝癌細胞中cdc2和周期蛋白b1的水平，從而抑制肝癌細胞的生長繁殖。2013年，kazuakishiomi等(shiomi,k.；kuriyama,i.；yoshida,h.；mizushina,y.inhibitoryeffectsofmyricetinonmammaliandnapolymerase,topoisomeraseandhumancancercellproliferation[j].foodchem.,2013,139(1-4):910-918.)研究了楊梅素對人類的dna聚合酶，拓撲異構(gòu)酶和人類癌細胞增值的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：楊梅素對哺乳動物聚合酶α、β和κ和人類dna拓撲異構(gòu)酶ii均有一定的抑制活性，其中對人類dna拓撲異構(gòu)酶ii的ic50值為27.5μmol/l，預防了人類結(jié)腸hct116腫瘤細胞的增值，ld50值為28.2μmol/l。而楊梅素是通過與酶直接作用，來抑制酶的活性；通過誘導細胞凋亡，進而引起癌細胞的死亡，其機理是通過抑制拓撲異構(gòu)酶ii。2013年，徐容容等(徐容容,張英.楊梅素和楊梅苷對一些腫瘤細胞的體外抑制及誘導凋亡作用研究[j].營養(yǎng)學報,2013,35(3):303-306.)研究了楊梅素、楊梅苷及楊梅素與楊梅苷聯(lián)用對人肝癌細胞系hepg2、人膀胱癌細胞系yts-1及人前列腺癌細胞系pc-3的增殖抑制和誘導凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在72h時，楊梅素、楊梅苷、楊梅素與楊梅苷摩爾比1:1聯(lián)用對yts-1的半抑制濃度ic50值分別為207.7、209.2、249.4μmol/l；楊梅素、楊梅苷以及楊梅素楊梅苷聯(lián)用對pc-3的半抑制濃度ic50值分別為110.2、423.8、43.13μmol/l；三種樣品對hepg2的作用最弱。楊梅素對hepg2、yts-1、pc-3三種癌細胞均有較好的誘導凋亡作用，楊梅苷誘導凋亡作用相對較弱，楊梅素與楊梅苷以1:1摩爾比聯(lián)用時對hepg2與pc-3的誘導凋亡作用最強，這可能與楊梅苷比楊梅素的化學結(jié)構(gòu)在3位少一個羥基有關(guān)。2014年，zang等(zang,w.q.；wang,t.；wang,y.y.；li,m.；xuan,x.y.；ma,y.y.；du,y.w.；liu,k.d.；dong,z.m.；zhao,g.q.myricetinexertsanti-proliferative,anti-invasive,andpro-apoptoticeffectsonesophagealcarcinomaec9706andkyse30cellsviarsk2[j].tumorbiol.,2014,35:12583-12592.)通過cck-8實驗方法，體外侵襲實驗，傷口愈合試驗，細胞循環(huán)分析和細胞凋亡等方法，來測試楊梅素對食管癌細胞ec9706和kyse30的體外增值、細胞凋亡和入侵的抑制作用。研究結(jié)果表明：楊梅素通過胺基激酶領域綁定rsk2來抑制ec9706和kyse30細胞的增殖、入侵和細胞凋亡。對食管癌的預防和治療提供了新的試劑。2014年，maggioni等(maggioni,d.；nicolini,g.；rigolio,r.；biffi,l.；pignataro,l.；gaini,r.；garavello,w.myricetinandnaringenininhibithumansquamouscellcarcinomaproliferationandmigrationinvitro[j].nutr.cancer,2014,66(7):1257-1267.)研究了楊梅素對口腔鱗狀細胞癌(oscc)、scc-25和hacat細胞有潛在的抑制作用。抑制了scc-25細胞的生長。楊梅素抑制細胞增殖與誘導細胞凋亡沒有關(guān)系，但與細胞周期障礙有關(guān)。蛋白質(zhì)印跡分析表明：楊梅素誘導了細胞周期蛋白d1在scc-25細胞中和細胞周期蛋白b1在hacat細胞中的減少。愈合和細胞入侵試驗證明：楊梅素可能減少了scc-25和hacat細胞的運動性。結(jié)果表明：楊梅素是通過阻礙細胞進程來發(fā)揮抑制細胞生長的作用。2015年，feng等(feng,j.f.；chen,x.n.；wang,y.y.；du,y.w.,sun,q.q.；zang,w.q.；zhao,g.q.myricetininhibitsproliferationandinducesapoptosisandcellcyclearrestingastriccancercells[j].mol.cell.biochem.,2015,408:163-170.)研究了楊梅素對gchgc-27和sgc7901細胞的增值、細胞凋亡和細胞循環(huán)的作用，使用細胞計算工具(cck)試驗，免疫印跡法、細胞循環(huán)分析法和細胞凋亡試驗等方法來測試楊梅素對細胞增殖、細胞凋亡和細胞循環(huán)的作用。研究結(jié)果表明：楊梅素抑制了gc細胞增殖，誘導了細胞凋亡和細胞周期阻滯，影響了gc的細胞凋亡和細胞周期阻滯。進而說明楊梅素具有抑制細胞增殖、細胞凋亡、細胞循環(huán)和細胞周期阻滯的作用。2015年，xue等(xue,w.；song,b.a.；zhao,h.j.；qi,x.b.；huang,y.j.；liu,x.h.novelmyricetinderivatives:design,synthesisandanticanceractivity[j].eur.j.med.chem.,2015,97:155-163.)報道了一系列含酰腙類楊梅素衍生物，以楊梅苷為原料，碘甲烷保護羥基、依次與溴乙酸乙酯、水合肼，不同取代的芳香甲醛反應，最終合成楊梅素酰腙類衍生物。利用mtt法，對所合成的化合物進行了人類乳腺癌細胞mda-mb-231的體外增殖抑制活性測試，研究結(jié)果表明：楊梅素酰腙類衍生物對人類乳腺癌細胞mda-mb-231都表現(xiàn)較好的抑制率，其中化合物2-((5,7-二甲氧基-4-氧代-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-3-基)氧基)-n'-(呋喃-2-基亞甲基)乙酰肼酰肼表現(xiàn)出較好的抑制活性，其ic50值為0.91μmol/l。綜上所述，楊梅素及其衍生物在抗腫瘤方面具有一定的研究價值，且毒副作用小。目前對楊梅素多數(shù)是對其本身進行研究，而對楊梅素進行結(jié)構(gòu)修飾，研究楊梅素衍生物抗腫瘤活性的研究較少。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種結(jié)構(gòu)中含哌嗪酰胺的楊梅素類化合物及其制備方法，發(fā)現(xiàn)具有較好抗腫瘤活性楊梅素類化合物，且化合物本身對正常細胞的毒副作用較少。本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種含哌嗪酰胺類楊梅素類衍生物，其通式如下所示：其中，r1為苯環(huán)上鄰、間或?qū)ξ簧虾幸粋€以上氫原子、甲氧基、硝基、甲基、三氟甲基或鹵原子。一種含哌嗪酰胺類楊梅素類衍生物的制備方法，以1-(4-取代芐基哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮和3-羥基-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮為原料制備含哌嗪酰胺類楊梅素類衍生物：所述的哌嗪酰胺類楊梅素類衍生物的制備方法為：(1)以哌嗪和取代芐氯為原料，堿性條件下加熱回流制備1-取代芐基哌嗪：(2)以取代的1-芐基哌嗪和氯乙酰氯為原料，制備1-(4-取代芐基哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮：(3)以楊梅苷和碘甲烷為原料，制備3-羥基-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮：(4)以3-羥基-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮和1-(4-取代芐基哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮為原料，制備3-(取代芐基哌嗪)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4酮：本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明將具有優(yōu)良活性的哌嗪酰胺結(jié)構(gòu)引入楊梅素結(jié)構(gòu)中，設計合成了一系列結(jié)構(gòu)中含哌嗪酰胺類楊梅素類化合物，并將所合成的含哌嗪酰胺類楊梅素類化合物應用于抗腫瘤方面的研究，發(fā)現(xiàn)此類化合物不僅對所供試的腫瘤細胞有一定抑制作用外，而且對正常細胞的毒副作用也非常小，其中部分化合物在抑制腫瘤細胞增殖的抑制活性超過其對照藥劑表柔比星，具有一定的應用價值。具體實施方式總實施例：(1)以哌嗪和取代芐氯為原料，堿性條件下加熱回流制備1-取代芐基哌嗪：(2)以取代的1-芐基哌嗪和氯乙酰氯為原料，制備1-(4-取代芐基哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮：(3)以楊梅苷和碘甲烷為原料，制備3-羥基-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮：(4)以3-羥基-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮和1-(4-取代芐基哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮為原料，制備3-(取代芐基哌嗪)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4酮：以下以圖表的方式列出具體實施例，見下：其中，r1＝2-cl，2-ch3，2-f，3-ch3，2，4-di-cl，h；。實施例13-(2-(4(2-氯苯基)哌嗪基)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成(化合物編號為i1)，包括以下步驟：(1)1-(2-氯芐基)哌嗪的合成：向50ml單口燒瓶中加入無水哌嗪2.59g(30mmol)，氫氧化鈉1.20g(30mmol)和25ml無水乙醇，常溫下攪拌待其完全溶解后，加入取代芐氯1.27g(10mmol)，并升溫至回流，直到芐氯完全消失約5～7h。停止反應，減壓除去溶劑，加水溶解，調(diào)ph>12，用二氯甲烷(3×30ml)萃取，合并有機層用無水硫酸鈉干燥、抽濾、減壓除去溶劑，得粗產(chǎn)物未經(jīng)提純直接用于下一步。(2)1-(4-(2-氯芐基)哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮的合成：向50ml單口燒瓶中，加入1.00g1-(2-氯芐基)哌嗪(4.75mmol)的粗產(chǎn)物、1.44g三乙胺(14.24mmol)和25ml二氯甲烷，在常溫下攪拌30min后，將反應體系轉(zhuǎn)移到冰浴中，緩慢滴加氯乙酰氯的二氯甲烷溶液(10ml)，并保持此溫度繼續(xù)反應3h，tlc監(jiān)測反應(石油醚：乙酸乙酯＝1:1,v/v)。停止反應后，反應液用水(3×40ml)洗、無水na2so4干燥、減壓除去溶劑，得到1-(4-(2-氯芐基)哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮的粗產(chǎn)品，未經(jīng)提純，直接用于下一步。(3)3-羥基-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成：在250ml圓底燒瓶中依次加入4.64g楊梅苷(10mmol)、22.09gk2co3(160mmol)和120mldmf，常溫下攪拌0.5～1h后，緩慢滴加7.50ml碘甲烷(120mmol)，室溫攪拌48h，tlc監(jiān)測反應(甲醇：乙酸乙酯＝1:4,v/v)。停止反應后，過濾沉淀，濾渣用乙酸乙酯(或二氯甲烷)洗滌，合并濾液，用100ml水稀釋，用乙酸乙酯(或二氯甲烷)萃取三次，合并有機層，減壓濃縮，然后將濃縮物溶于30ml無水乙醇中，升溫至回流，待溶液澄清后，回流下加入16ml濃鹽酸，隨后有黃色固體析出，繼續(xù)反應2h，冷卻，過濾，得到粗產(chǎn)物3-羥基-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮。(4)3-(2-(4(2-氯苯基)哌嗪基)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基)-4h-稀-4-酮的合成：在50ml圓底燒瓶中，依次加入3-羥基-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮(1.30mmol)、無水碳酸鉀(3.90mmol)和15mldmf，常溫下攪拌0.5～1h，緩慢滴加1-(4-(2-氯芐基)哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮(1.56mmol)的dmf(10ml)溶液，升溫至100℃，在此溫度下繼續(xù)反應5～7h，tlc跟蹤反應(乙酸乙酯：甲醇＝10:1,v/v)，停止反應，冷卻至室溫，加入冰水靜置，如析出固體，固體經(jīng)過濾，甲醇重結(jié)晶得到目標化合物。如未析出固體，用二氯甲烷(3×30ml)萃取，合并有機層，用飽和食鹽水洗滌(3×40ml)、無水硫酸鈉干燥、減壓除去溶劑，得粗產(chǎn)物，經(jīng)柱層析(乙酸乙酯：甲醇＝15:1～10:1,v/v)提純得到目標化合物，產(chǎn)率：55.3％。實施例23-(2-(4(2,4-二氯苯基)哌嗪基)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成(化合物編號為i2)，包括以下步驟：(1)1-(2,4-二氯芐基)哌嗪的合成：如實施例1第(1)步，區(qū)別在于以2,4-二氯芐氯為原料。(2)1-(4-(2,4-二氯芐基)哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮的合成：如實施例1第(2)步，區(qū)別在于以1-(2,4-二氯芐基)哌嗪為原料。(3)3-羥基-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成：如實施例1第(3)步。(4)3-(2-(4(2,4-二氯苯基)哌嗪基)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成：如實施例1第(4)步，區(qū)別在于以1-(4-(2,4-二氯芐基)哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮為原料。實施例33-(2-(4(3-甲基苯基)哌嗪基)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成(化合物編號為i3)，包括以下步驟：(1)1-(3-甲基芐基)哌嗪的合成：如實施例1第(1)步，區(qū)別在于以3-甲基芐氯為原料。(2)1-(4-(3-甲基芐基)哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮的合成：如實施例1第(2)步，區(qū)別在于以1-(3-甲基芐基)哌嗪為原料。(3)3-羥基-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成：如實施例1第(3)步。(4)3-(2-(4(3-甲基苯基)哌嗪基)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成：如實施例1第(4)步，區(qū)別在于以1-(4-(3-甲基芐基)哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮為原料。實施例43-(2-(4(2-氟苯基)哌嗪基)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成(化合物編號為i4)，包括以下步驟：(1)1-(2-氟芐基)哌嗪的合成：如實施例1第(1)步，區(qū)別在于以2-氟芐氯為原料。(2)1-(4-(2-氟芐基)哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮的合成：如實施例1第(2)步，區(qū)別在于以1-(2-氟芐基)哌嗪為原料。(3)3-羥基-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成：如實施例1第(3)步。(4)3-(2-(4(2-氟苯基)哌嗪基)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成：如實施例1第(4)步，區(qū)別在于以1-(4-(2-氟芐基)哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮為原料。實施例53-(2-(4(2-甲基苯基)哌嗪基)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成(化合物編號為i3)，包括以下步驟：(1)1-(2-甲基芐基)哌嗪的合成：如實施例1第(1)步，區(qū)別在于以2-甲基芐氯為原料。(2)1-(4-(2-甲基芐基)哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮的合成：如實施例1第(2)步，區(qū)別在于以1-(2-甲基芐基)哌嗪為原料。(3)3-羥基-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成：如實施例1第(3)步。(4)3-(2-(4(2-甲基苯基)哌嗪基)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成：如實施例1第(4)步，區(qū)別在于以1-(4-(2-甲基芐基)哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮為原料。實施例63-(2-(4-芐基)哌嗪基)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成(化合物編號為i6)，包括以下步驟：(1)1-芐基哌嗪的合成：如實施例1第(1)步，區(qū)別在于以芐氯為原料。(2)1-(4-芐基)哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮的合成：如實施例1第(2)步，區(qū)別在于以1-芐基哌嗪為原料。(3)3-羥基-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成：如實施例1第(3)步。(4)3-(2-(4(3-甲基苯基)哌嗪基)-2-氧代乙基)-5,7-二甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-色烯-4-酮的合成：如實施例1第(4)步，區(qū)別在于以1-(4-芐基)哌嗪)-2-氯乙烷-1-酮為原料。合成的含哌嗪酰胺類楊梅素類衍生物的理化性質(zhì)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1，核磁共振氫譜(1hnmr)和碳譜(13cnmr)數(shù)據(jù)見表2和表3。表1目標化合物理化性質(zhì)及其質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)化合物產(chǎn)率性狀熔點(℃)hrms(esi)m/z(calcd.)i155.3白色固體134～136639.2105(639.2104[m+h]+)i265.8白色固體132～134673.1686(673.1714[m+h]+)i348.2白色固體103～105619.2652(619.2650[m+h]+)i453.7白色固體192～194623.2399(623.2399[m+h]+)i561.3白色固體189～191619.2654(619.2650[m+h]+)i643.8白色固體209～211605.2494(605.2494[m+h]+)表2目標化合物核磁共振氫譜數(shù)據(jù)表3目標化合物核磁共振碳譜數(shù)據(jù)目標化合物對hepg2細胞和sgc7901細胞的抑制活性：(1)測試方法a.實驗原理mtt全稱為3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，中文名為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素c的作用下四唑環(huán)開裂，生成藍紫色的甲瓚結(jié)晶。甲瓚結(jié)晶的生成量與活細胞數(shù)目成正比，而死細胞無此功能。二甲基亞砜、sds可溶解該結(jié)晶，利用酶標儀測定595nm處的吸光度，可以間接反映活細胞的數(shù)量。在一定的細胞范圍之內(nèi)，mtt形成的結(jié)晶物的數(shù)量與細胞數(shù)成正比。該方法可用于大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性實驗以及腫瘤放射敏感性測定等。b.實驗步驟將96孔板的上、下行用滅菌二次水封邊，每孔200μl。取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化后，重懸于含10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基中，以4×104個/ml的終濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，最右側(cè)一列為空白對照組，加無細胞的有血清rpmi1640培養(yǎng)基。置于37℃、5％co2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細胞貼壁。吸掉培養(yǎng)基，加入含不同藥物濃度的有血清培養(yǎng)基，每孔200μl，注意培養(yǎng)基中dmso終濃度不能超過0.1％，空白對照組每孔加200μl完全培養(yǎng)基。分別處理實驗要求時間，去除上清，加100μl/well濃度0.5mg/ml的mtt。培養(yǎng)4h后再補加100μl/well的10％的sds。37℃下10h使結(jié)晶物充分溶解后取出，微震蕩5min，放置室溫下30min，在a595波長下測od值，并計算細胞活性、抑制率和p值。以藥物濃度或處理時間為橫軸，od值或抑制率為縱軸，繪制曲線。每樣本濃度重復六個孔，每個實驗重復三次，取平均值為最終結(jié)果。實驗結(jié)果以spss軟件進行方差分析，p<0.05時為差異顯著，p<0.01時為差異極顯著。細胞增殖的抑制率計算公式如下：(2)生物活性測試結(jié)果表4目標化合物對hepg2細胞的抑制活性注：*化合物在設定濃度下對hepg2的抑制率與陰性對照組(dmso)的抑制率差異性分析有顯著性差異(p＜0.05)。表5目標化合物對sgc7901細胞的抑制活性注：*化合物在設定濃度下對胃癌sgc7901細胞的抑制率與陰性對照組(dmso)的抑制率差異性分析有顯著性差異(p＜0.05)。采用mtt法，以表柔比星為對照藥劑，在所測試濃度下，所供試化合物i1～i6對hepg2細胞和sgc7901細胞的抑制活性(見表4和表5)。測試結(jié)果表明：所供試化合物對兩種腫瘤細胞均有一定的抑制活性。在濃度為1μmol/l時，所有化合物對hepg2細胞的抑制活性均超過50％，而對胃癌sgc7901細胞的抑制活性相對較低；在濃度為10μmol/l時，化合物i3對hepg2細胞和胃癌sgc7901細胞的抑制活性均超過對照藥劑表柔比星(81.64、78.38％)，其抑制活性分別為97.90、87.53％。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當前第1頁12