本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種調(diào)控藍(lán)莓果實(shí)中花青素含量的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：藍(lán)莓是杜鵑花科(ericaceae)越橘屬(vaccinium)植物，果實(shí)中含有豐富的花青素，具有防止腦神經(jīng)老化、強(qiáng)心、抗癌軟化血管、增強(qiáng)人機(jī)體免疫等保健功能。藍(lán)莓可鮮食，也可加工成果汁飲料、果酒飲等，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著人類保健意識(shí)的提高，越來(lái)越表現(xiàn)出對(duì)富含花青素類食物的青睞，因此藍(lán)莓在世界范圍內(nèi)，特別是在我國(guó)的需求量逐年上升，消費(fèi)者對(duì)藍(lán)莓果實(shí)的品質(zhì)要求也越來(lái)越高。因此尋找與花青素生物合成有關(guān)的基因并研究其具體功能，以及調(diào)控途徑具有重要的理論和實(shí)踐意義。早期研究植物花青素生物合成主要集中在花青素生物合成途徑中的相關(guān)基因上，通過(guò)異源轉(zhuǎn)化單個(gè)或多個(gè)功能基因來(lái)提高植物花青素的含量，雖然轉(zhuǎn)基因植株的花青素生物合成和積累量有所提高，但效果不太明顯。最近，許多調(diào)節(jié)花青素生物合成的轉(zhuǎn)錄因子從許多植物中分離出來(lái)。研究結(jié)果表明通過(guò)這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)后期的許多功能基因的表達(dá)，可以大大提高轉(zhuǎn)基因植株的花青素產(chǎn)量，從而很大程度上促進(jìn)了植物花青素調(diào)控方面的研究工作并取得突破性進(jìn)展。myb是最大的植物轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，包括r2r3-myb、bhlh結(jié)構(gòu)以及wdr蛋白,這些蛋白通過(guò)形成mbw復(fù)合體結(jié)構(gòu)激活轉(zhuǎn)錄，mbw復(fù)合體通過(guò)一些特定的作用元件直接作用于dna的啟動(dòng)子區(qū)，進(jìn)而調(diào)控目的基因的表達(dá)。對(duì)myb的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究主要集中在調(diào)控植物生長(zhǎng)以及相應(yīng)逆境脅迫上。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種調(diào)控藍(lán)莓果實(shí)中花青素含量的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，來(lái)源于藍(lán)莓，命名為vcmyb5，具體是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且來(lái)源于藍(lán)莓并與植物果實(shí)中花青素含量相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；(c)與(a)或(b)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且來(lái)源于藍(lán)莓并與植物果實(shí)中花青素含量相關(guān)的蛋白質(zhì)。為了便于所述蛋白質(zhì)的純化，可在所述蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。表：標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列poly-arg5-6(通常為5個(gè))rrrrrpoly-his2-10(通常為6個(gè))hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸分子具體為編碼所述蛋白質(zhì)的基因，所述基因具體可為如下1)或2)或3)的dna分子：1)序列表中序列2所示的dna分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的dna分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子；3)與1)或2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子。上述嚴(yán)格條件可為用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。含上述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pcambia1300、pcubi1390、pchf3、pgreen0029、pcambia3301、pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia1301-ubin或其它衍生植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動(dòng)子、泛素基因ubiquitin啟動(dòng)子(pubi)、脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29a等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用重組表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述表達(dá)盒由能夠啟動(dòng)所述基因表達(dá)的啟動(dòng)子，所述基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成。所述蛋白質(zhì)或所述核酸分子或所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：(a)調(diào)控植物果實(shí)中花青素含量；(b)調(diào)控植物果實(shí)成熟時(shí)間；(c)調(diào)控植物果皮著色時(shí)間；(d)調(diào)控植物果實(shí)中花青素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)；(e)選育果實(shí)中花青素含量提高或降低的植物品種；(f)選育果實(shí)成熟時(shí)間提前或延后的植物品種；(g)選育果皮著色時(shí)間提前或延后的植物品種。其中，所述調(diào)控植物果實(shí)中花青素含量、所述調(diào)控植物果實(shí)成熟時(shí)間、所述調(diào)控植物果皮著色時(shí)間具體體現(xiàn)為：在所述植物果實(shí)中所述蛋白質(zhì)(或所述基因)vigs后，在所述植物果實(shí)(尤其是果肉)中，所述蛋白質(zhì)(或所述基因)的表達(dá)量越低，所述植物果實(shí)中花青素含量越高，所述植物果實(shí)成熟時(shí)間越提前，所述植物果皮著色時(shí)間越提前。在所述植物果實(shí)(尤其是果肉)中，所述蛋白質(zhì)(或所述基因)的表達(dá)量越高，所述植物果實(shí)中花青素含量越低。其中，所述選育果實(shí)中花青素含量提高/果實(shí)成熟時(shí)間提前/果皮著色時(shí)間提前的植物品種的方法，具體可包括將所述植物果實(shí)(尤其是果肉)中所述蛋白質(zhì)(或所述基因)表達(dá)量較低的植株作為親本進(jìn)行雜交的步驟。所述選育果實(shí)中花青素含量降低/果實(shí)成熟時(shí)間延后/果皮著色時(shí)間延后的植物品種的方法，具體可包括將所述植物果實(shí)(尤其是果肉)中所述蛋白質(zhì)(或所述基因)表達(dá)量較高的植株作為親本進(jìn)行雜交的步驟。本發(fā)明還提供了一種培育果實(shí)中花青素含量提高和/或果實(shí)成熟時(shí)間提前和/或果皮著色時(shí)間提前的植物的方法，以及一種培育果實(shí)中花青素含量降低和/或果實(shí)成熟時(shí)間延后和/或果皮著色時(shí)間延后的植物的方法。本發(fā)明所提供的培育果實(shí)中花青素含量提高和/或果實(shí)成熟時(shí)間提前和/或果皮著色時(shí)間提前的植物的方法，可包括如下步驟：降低受體植物中權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的表達(dá)量和/或活性，從而得到果實(shí)中花青素含量提高和/或果實(shí)成熟時(shí)間提前和/或果皮著色時(shí)間提前的植物。本發(fā)明所提供的培育果實(shí)中花青素含量降低和/或果實(shí)成熟時(shí)間延后和/或果皮著色時(shí)間延后的植物的方法，可包括如下步驟：提高受體植物中權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的表達(dá)量和/或活性，從而得到果實(shí)中花青素含量降低和/或果實(shí)成熟時(shí)間延后和/或果皮著色時(shí)間延后的植物。本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，可為如下(a)或(b)：(a)培育具有如下(a1)-(a3)所示性狀中至少一種的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟：抑制受體植物中所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物；從所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述受體植物相比，具有如下(a1)-(a3)所示性狀中至少一種的轉(zhuǎn)基因植物：(a1)果實(shí)中花青素含量提高；(a2)果實(shí)成熟時(shí)間提前；(a3)果皮著色時(shí)間提前。(b)培育具有如下(b1)-(b3)所示性狀中至少一種的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：向受體植物中轉(zhuǎn)入所述蛋白質(zhì)的編碼基因，得到轉(zhuǎn)基因植物；從所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述受體植物相比，具有如下(b1)-(b3)所示性狀中至少一種的轉(zhuǎn)基因植物：(b1)果實(shí)中花青素含量降低；(b2)果實(shí)成熟時(shí)間延后；(b3)果皮著色時(shí)間延后。在方法(a)中，所述蛋白質(zhì)在所述轉(zhuǎn)基因植物果實(shí)(尤其是果肉)中的表達(dá)量低于所述受體植物。在方法(b)中，所述蛋白質(zhì)在所述轉(zhuǎn)基因植物果實(shí)(尤其是果肉)中的表達(dá)量高于所述受體植物。所述基因具體可為如下1)或2)或3)的dna分子：1)序列表中序列2所示的dna分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的dna分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子；3)與1)或2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子。上述嚴(yán)格條件可為用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。在方法(a)中，抑制所述受體植物中所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)具體可通過(guò)如下實(shí)現(xiàn)：向所述受體植物中導(dǎo)入ptrv2-vcmyb5載體和ptrv1載體；所述ptrv2-vcmyb5載體為將所述基因插入到ptrv2載體的酶切位點(diǎn)ecori和bamhi之間后得到的重組載體。在方法(b)中，所述基因具體可通過(guò)所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體植物中，得到所述轉(zhuǎn)基因植物。所述重組表達(dá)載體為將所述基因插入到植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)后得到的能夠表達(dá)所述基因的重組載體。在上述兩種方法中，均可通過(guò)使用ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法將相應(yīng)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。在本發(fā)明中，所述果實(shí)中花青素含量具體為果肉中花青素含量。在本發(fā)明中，所述調(diào)控植物果實(shí)中花青素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)具體為調(diào)控植物果肉中花青素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)。其中，所述花青素合成途徑相關(guān)基因?yàn)槿缦轮腥我环N或任幾種：vcpal基因、vcc4h基因、vc4cl基因、vcchs基因。相應(yīng)的，在本發(fā)明中，所述調(diào)控植物果實(shí)中花青素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)具體體現(xiàn)為：在所述植物果實(shí)中，所述蛋白質(zhì)(或所述基因)的表達(dá)量越高，所述pal基因、所述vcc4h基因、所述vc4cl基因、和/或所述vcchs基因的表達(dá)量越低；在所述植物果實(shí)中，所述蛋白質(zhì)(或所述基因)的表達(dá)量越低，所述vcpal基因、所述vcc4h基因、所述vc4cl基因、和/或所述vcchs基因的表達(dá)量越高。在本發(fā)明中，所述植物可為越橘屬植物，如藍(lán)莓。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述藍(lán)莓具體為藍(lán)莓品種‘喜來(lái)(sierra)’。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的新基因vcmyb5構(gòu)建到ptrv2載體中，通過(guò)所述vigs沉默體系的方法注入藍(lán)莓果實(shí)中，得到vcmyb5基因沉默的藍(lán)莓果實(shí)，轉(zhuǎn)基因的藍(lán)莓果實(shí)成熟期提前，果皮表現(xiàn)為提前著色，所述轉(zhuǎn)基因藍(lán)莓果實(shí)花青素含量顯著高于對(duì)照組藍(lán)莓果實(shí)的花青素含量。上述結(jié)果表明vcmyb5基因及其編碼的蛋白負(fù)調(diào)控藍(lán)莓果實(shí)中花青素的生物合成。本發(fā)明對(duì)于培育花青素含量更高的藍(lán)莓新品種具有重要意義。附圖說(shuō)明圖1為正常生長(zhǎng)與vcmyb5基因vigs后藍(lán)莓果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育曲線。圖2為vcmyb5基因在藍(lán)莓果實(shí)中vigs沉默后的果實(shí)表型。其中“水、侵染液、空載體、vcmyb5”分別表示利用所述vigs體系在所述植物果實(shí)中注入“無(wú)菌水、侵染液、空ptrv1+空ptrv2、空ptrv1+ptrv1-vcmyb5”的所述植物果實(shí)表型變化圖。圖3為vcmyb5基因在藍(lán)莓果實(shí)中vigs沉默的載體檢測(cè)。其中，a為ptrv1載體檢測(cè)；b為ptrv2載體檢測(cè)。m：dna分子量標(biāo)準(zhǔn)；“1、2、3、5”分別表示利用所述vigs體系在所述植物果實(shí)中注入“無(wú)菌水、侵染液、攜帶空ptrv1+空ptrv2的農(nóng)桿菌侵染液、攜帶空ptrv1+ptrv1-vcmyb5的農(nóng)桿菌侵染”的所述植物果實(shí)中所述載體的檢測(cè)情況。圖4為vcmyb5基因在藍(lán)莓果實(shí)中vigs沉默后vcmyb5基因在藍(lán)莓果皮和果肉中的表達(dá)量變化。其中“ck-水、ck-侵染液、ck-空載體、vcmyb5”分別表示利用所述vigs體系在所述植物果實(shí)中注入“無(wú)菌水、侵染液、攜帶空ptrv1+空ptrv2的農(nóng)桿菌侵染液、攜帶空ptrv1+ptrv1-vcmyb5的農(nóng)桿菌侵染”的所述植物果皮和果肉中所述vcmyb5基因的表達(dá)量變化，所述“ck”表示對(duì)照組。圖中，不同小寫(xiě)字母之間表示差異顯著(p<0.05)。圖5為vcmyb5基因在藍(lán)莓果實(shí)中vigs沉默后花青素合成途徑中的相關(guān)基因在藍(lán)莓果皮和果肉中的表達(dá)量變化。圖中，“ck”表示的是注射“攜帶空ptrv1+空ptrv2的農(nóng)桿菌侵染液”的所述植物的果皮和果肉；不同小寫(xiě)字母之間表示差異顯著(p<0.05)。圖6為vcmyb5基因在藍(lán)莓果實(shí)中vigs沉默后，藍(lán)莓果皮和果肉中的花青素含量變化。其中“ck-水、ck-侵染液、ck-空載體、vcmyb5”分別表示利用所述vigs體系在所述植物果實(shí)中注入“無(wú)菌水、侵染液、攜帶空ptrv1+空ptrv2的農(nóng)桿菌侵染液、攜帶空ptrv1+ptrv1-vcmyb5的農(nóng)桿菌侵染”的所述植物果皮和果肉中的花青素含量變化，所述“ck”表示對(duì)照組。圖中，不同小寫(xiě)字母之間表示差異顯著(p<0.05)。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。ptrv2載體和ptrv1載體：由北京農(nóng)學(xué)院沈元月教授饋贈(zèng)。均記載于“jiahf,shenyy,(2013)virus-inducedgenesilencinginstrawberryfruit.methodsinmolecularbiology.975:211-218.”一文，公眾可從申請(qǐng)人處獲得，僅可用于重復(fù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)使用。藍(lán)莓品種‘喜來(lái)(sierra)’：取材于秦皇島天碩農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司。實(shí)施例1、轉(zhuǎn)錄因子vcmyb5及其編碼基的獲得提取藍(lán)莓品種‘喜來(lái)(sierra)’的總rna，并反轉(zhuǎn)錄得到cdna，然后以所得cdna為模板，采用引物f和引物r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，。引物f：5’-atgaattatctgagaccag-3’；引物r：5’-tcaaatcaacaatgattcgg-3’。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，可知所得cdna核苷酸序列為序列表中序列2，與genbank中的序列進(jìn)行比較，確定它屬于藍(lán)莓r2r3-myb類轉(zhuǎn)錄因子，將其所示的基因命名為vcmyb5，編碼的蛋白命名為vcmyb5，其氨基酸序列為序列表中序列1。上述cdna(序列1)也可以通過(guò)人工合成獲得。實(shí)施例2、基因瞬時(shí)vigs沉默體系在藍(lán)莓果實(shí)中的建立以及vcmyb5基因的功能研究一、重組表達(dá)載體的獲得將實(shí)施例1所得的pcr產(chǎn)物與peasy-t載體(全式金公司產(chǎn)品)相連接，得到的連接產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶ecori和bamhi(賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品)進(jìn)行雙酶切，得到酶切產(chǎn)物(含有上述vcmyb5基因的dna片段，核苷酸序列為序列表中序列3(序列3僅是在序列2兩端添加酶切位點(diǎn))，酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同酶切的ptrv2載體相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5a感受態(tài)細(xì)胞(天根公司產(chǎn)品)，并涂布在含有100μg/ml氨芐青霉素的lb平板上培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色單菌落，在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜并進(jìn)行菌落pcr鑒定；同時(shí)堿法提取質(zhì)粒dna進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明，所得重組載體為將序列表中序列2所示的vcmyb5基因的dna片段插入ptrv2載體的酶切位點(diǎn)ecori和bamhi間后得到的重組載體，命名為ptrv2-vcmyb5。二、以vcmyb5為對(duì)象在藍(lán)莓果實(shí)中建立vigs基因沉默體系將ptrv1載體、ptrv2載體以及上述步驟一制備的重組載體ptrv2-vcmyb5轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101的感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌gv3101/ptrv1、gv3101/ptrv2和gv3101/ptrv2-vcmyb5。對(duì)于gv3101/ptrv2-vcmyb5，提取質(zhì)粒送去測(cè)序，證實(shí)其中含有重組載體ptrv2-vcmyb5。具體vigs步驟如下：1.活化：將上述重組菌gv3101/ptrv1、gv3101/ptrv2以及gv3101/ptrv2-vcmyb5單克隆接種于含有100μg/ml卡那霉素、50μg/ml利福平和50μg/ml慶大霉素的lb液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)兩天。2.搖菌：將步驟1所述活化的gv3101/ptrv1、gv3101/ptrv2以及gv3101/ptrv2-vcmyb5農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)接到含有100μg/ml卡那霉素、50μg/ml利福平、50μg/ml慶大霉素、20mm/l2-嗎啉乙醋酸(mes)和10mm/l乙酰丁香酮(as)的lb液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)4-6h使菌液濃度od600≈0.6。3.侵染液培養(yǎng)：將步驟2所述的菌液在20℃條件下，5000rpm/min離心5min。將上述所得農(nóng)桿菌沉淀用含有20mm/l2-嗎啉乙醋酸(mes)和10mm/l乙酰丁香酮(as)的10mm/lmgcl2侵染液重懸并用所述侵染液調(diào)節(jié)菌液濃度至od600≈1.0。將gv3101/ptrv1與gv3101/ptrv2(或gv3101/ptrv2-vcmyb5)按照1:1的比例混勻后靜置2-4h。4.注射：用0.45mm的1ml注射器將重組菌gv3101/ptrv2(或gv3101/ptrv2-vcmyb5)與gv3101/ptrv1的混合液小心地注入白果期‘喜來(lái)(sierra)’藍(lán)莓的果實(shí)。待果實(shí)成熟(20天左右)后采樣，觀察表形，并進(jìn)行相關(guān)的分子和生理檢測(cè)。(1)轉(zhuǎn)vcmyb5藍(lán)莓果實(shí)的發(fā)育曲線統(tǒng)計(jì)自注射后藍(lán)莓果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間曲線，繪制生長(zhǎng)發(fā)育曲線圖。每個(gè)發(fā)育時(shí)期隨機(jī)取10個(gè)藍(lán)莓果實(shí)，稱重后取平均值。每個(gè)處理組的藍(lán)莓取樣按上述稱重方法重復(fù)3次，最后取上述3次取樣后果實(shí)重量均值的平均數(shù)繪制生長(zhǎng)發(fā)育曲線。結(jié)果如圖1所示，vcmyb5基因在藍(lán)莓果實(shí)中vigs沉默后，藍(lán)莓果實(shí)注射部分果皮提前著色，成熟期提前14天左右，果實(shí)重量與對(duì)照組無(wú)顯著差異。(2)將vcmyb5基因在藍(lán)莓果實(shí)中vigs沉默后的果實(shí)橫向切開(kāi)。結(jié)果如圖2所示發(fā)現(xiàn)基因vigs沉默部分在藍(lán)莓完全成熟后(對(duì)應(yīng)圖1所述實(shí)驗(yàn)組花后59天果實(shí))果肉著色，由原來(lái)的綠色變?yōu)榧t色表現(xiàn)為花青素積累量的上升。(2)對(duì)vcmyb5基因在藍(lán)莓果實(shí)中vigs沉默后的病毒載體進(jìn)行檢測(cè)。具體操作如下：用ctab法提取上述整個(gè)藍(lán)莓果實(shí)中的dna，用于病毒載體檢測(cè)：病毒載體pcr檢測(cè)引物：rnai引物(擴(kuò)增產(chǎn)物560bp)正義引物：5’-ttacaggttatttgggctag-3’；反義引物：5’-ccgggttcaattccttatc-3’。rna2引物(擴(kuò)增產(chǎn)物300bp)正義引物：5’-ttacgacgaaccaagggagtactac-3’；反義引物：5’-agtcacaattagccctatttagatgt-3’。病毒檢測(cè)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖3所示，結(jié)合圖2表明攜帶基因的載體成功轉(zhuǎn)入藍(lán)莓果實(shí)并隨果實(shí)發(fā)育表達(dá)并轉(zhuǎn)移。4、通過(guò)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)vcmyb5基因在藍(lán)莓果實(shí)中vigs沉默后其在藍(lán)莓果皮和果肉中的表達(dá)量變化。具體操作如下：通過(guò)plantrnakit試劑盒(omega，北京)提取各樣品的總rna，并利用primescripttmrtreagentkit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(tiangen，北京)合成第1鏈cdna作為模板，用于熒光定量檢測(cè)。以藍(lán)莓ubc28基因?yàn)閮?nèi)參基因，通過(guò)abisteponeplus熒光實(shí)時(shí)定量pcr儀檢測(cè)vcmyb5基因在上述藍(lán)莓果實(shí)和果皮的表達(dá)量。每個(gè)處理的樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。熒光染料使用sybrgreen(tiangen，北京)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性15min；95℃變性30s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)。具體引物序列如表1所示：表1用于檢測(cè)vcmyb5基因以及內(nèi)參基因ubc28的引物序列結(jié)果如圖4所示，表明vcmyb5基因在藍(lán)莓果皮和果肉中的表達(dá)量均顯著下降但在藍(lán)莓果肉中的表達(dá)量下降更顯著。5、通過(guò)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)vcmyb5基因在藍(lán)莓果實(shí)中vigs沉默后花青素合成途徑中相關(guān)基因(vcpal、vcc4h、vc4cl、vcchs、vcchi、vcdfr、vcf3h、vcrh8、vcans、vcufgt基因)在藍(lán)莓果皮和果肉中的表達(dá)量變化。以藍(lán)莓ubc28基因?yàn)閮?nèi)參基因，具體操作如步驟4所述，所用引物如表2所示：表2用于檢測(cè)花青素合成途徑中相關(guān)基因以及內(nèi)參基因ubc28的引物序列結(jié)果如圖5所示，表明vcmyb5基因vigs沉默后果肉中vcpal、vcc4h、vc4cl、vcchs基因的表達(dá)量顯著上升。6、利用液相色譜法檢測(cè)vcmyb5基因在藍(lán)莓果實(shí)中vigs沉默后，藍(lán)莓果皮和果肉中的花青素含量變化。具體操作如下：樣品處理：選取10個(gè)完全成熟且成熟度一致的藍(lán)莓果實(shí)，切片后放于液氮中，然后于磨樣儀進(jìn)行粉碎。稱取1g左右的粉末，加入5ml1％的hcl-甲醇，于4℃黑暗條件下浸提過(guò)夜，離心，殘?jiān)儆?ml1％的hcl-甲醇浸提2次，合并上清液，定容至20ml，經(jīng)微孔濾膜(0.22μm有機(jī)濾膜)過(guò)濾后，進(jìn)行液相檢測(cè)。液相檢測(cè)：所用儀器為agilent產(chǎn)品1200系列液相色譜儀，采用waterssymmetryc18色譜柱(5μm，4.6mm×150mm)，流動(dòng)相a為10％甲酸，流動(dòng)相b為乙腈。線性梯度洗脫設(shè)計(jì)為:0～13min，乙腈為0～20％；20min，乙腈為40％；25min，乙腈為0。檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm，進(jìn)樣量為每針20μl，柱溫25℃，流速為1ml·min-1?；ㄇ嗨乜偭恳詷?biāo)樣天竺葵-3-葡萄糖苷的相應(yīng)面積計(jì)算濃度，所述藍(lán)莓花青素總量以矢車菊定-3-葡萄糖苷的相應(yīng)面積計(jì)算濃度，其中標(biāo)樣購(gòu)買于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。結(jié)果如圖6所示，藍(lán)莓基因vcmyb5vigs沉默后，藍(lán)莓果皮中的花青素含量有上升的趨勢(shì)但不顯著，而藍(lán)莓果肉中的花青素含量顯著增加。上述結(jié)果表明，vcmyb5基因或其編碼的蛋白具備負(fù)調(diào)控藍(lán)莓果實(shí)中花青素生物合成的功能。<110>北京林業(yè)大學(xué)<120>調(diào)控藍(lán)莓果實(shí)中花青素含量的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用<130>gncln170824<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>213<212>prt<213>藍(lán)莓<400>1metasntyrleuargproaspilelysargglyasnilethrproasp151015gluaspaspleuileileargmethisalaleuleuglyasnargtrp202530serleuilealaglyargleuproglyargthraspasngluilelys354045asntyrtrpasnthrhisleuserlysargleuargaspglnglythr505560aspproserthrhislyslysleuserglutyrproasnaspglnpro65707580prolyslysargargasnasnasnarglyslysasnlysserasnleu859095glualaarglysglnlysvalhisasnprolysprolysargilethr100105110serleuserserleusermetserargasnserserpheaspcyspro115120125prolysgluglyleuaspvalglnleuserlyspheaspglyasngly130135140aspglyaspglyvalglypheleuvalglyasnaspglnaspproasp145150155160metvalasnglyseraspileglnargglnserglyleuprovalval165170175serasphisasnasnthrglulysleutyrgluglutyrleuglnleu180185190leuileargthrgluaspleuaspleuleuglnleuaspserpheala195200205gluserleuleuile210<210>2<211>642<212>dna<213>藍(lán)莓<400>2atgaattatctgagaccagatattaagaggggaaacatcacccctgacgaggatgacctc60attataagaatgcatgcccttctaggcaatcgatggtctctaattgcgggaagattacca120ggtcgaaccgataacgagataaagaactactggaacactcatcttagcaaaagactccga180gaccaaggaaccgacccgagtacccacaaaaaattatcggaatatcctaacgaccaacca240ccaaagaagaggaggaacaacaatagaaagaagaacaagtcaaatttggaggcccgaaag300cagaaagtccataacccaaagcccaaaaggatcacttctttgagttctttgtcaatgtca360aggaatagtagctttgattgccctcctaaagaaggtttagatgttcaattgtctaaattc420gatggcaatggcgatggcgatggcgttgggtttcttgttggtaatgatcaagatccggat480atggttaatgggtcggacattcaacgccaatctggtttaccagtagtgtctgatcacaac540aatacagagaagctatatgaagagtatcttcaacttctaatcagaacggaagatcttgac600ctacttcagttggattcctttgccgaatcattgttgatttga642<210>3<211>654<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3gaattcatgaattatctgagaccagatattaagaggggaaacatcacccctgacgaggat60gacctcattataagaatgcatgcccttctaggcaatcgatggtctctaattgcgggaaga120ttaccaggtcgaaccgataacgagataaagaactactggaacactcatcttagcaaaaga180ctccgagaccaaggaaccgacccgagtacccacaaaaaattatcggaatatcctaacgac240caaccaccaaagaagaggaggaacaacaatagaaagaagaacaagtcaaatttggaggcc300cgaaagcagaaagtccataacccaaagcccaaaaggatcacttctttgagttctttgtca360atgtcaaggaatagtagctttgattgccctcctaaagaaggtttagatgttcaattgtct420aaattcgatggcaatggcgatggcgatggcgttgggtttcttgttggtaatgatcaagat480ccggatatggttaatgggtcggacattcaacgccaatctggtttaccagtagtgtctgat540cacaacaatacagagaagctatatgaagagtatcttcaacttctaatcagaacggaagat600cttgacctacttcagttggattcctttgccgaatcattgttgatttgaggatcc654當(dāng)前第1頁(yè)12