本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花基因ntmyb15及其克隆方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

低溫是限制農(nóng)作物生產(chǎn)的最主要的環(huán)境因素之一，低溫脅迫可以改變植物的花期，從而影響作物產(chǎn)量及一些花卉植物的經(jīng)濟(jì)價值。在我國南部地區(qū)，低溫脅迫誘導(dǎo)的煙草早花現(xiàn)象現(xiàn)象嚴(yán)重影響煙葉生產(chǎn)和農(nóng)民增收。

煙草起源于南美洲，是典型喜溫短日作物，生長發(fā)育適溫為25-28℃，在零下2-3℃時，煙株就會死亡，地下部最適宜的生長溫度是31℃。煙草在6-7葉齡時，如果受到兩周左右的12℃低溫脅迫就會發(fā)生早花現(xiàn)象（項目組田間數(shù)據(jù)）。煙草早花指煙草植株未能達(dá)到正常生長應(yīng)具有的高度和葉數(shù)，花芽就提早分化，現(xiàn)蕾開花的現(xiàn)象。發(fā)生早花的煙株過早地從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)入生殖生長，導(dǎo)致生長勢弱，葉片數(shù)減少，葉片窄小，葉片的產(chǎn)量和質(zhì)量降低。因此，煙草早花將給煙農(nóng)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失，影響邊遠(yuǎn)山區(qū)農(nóng)民收入。

目前生產(chǎn)上主要通過農(nóng)藝措施（如打頂留杈）來解決低溫脅迫誘導(dǎo)花芽提前分化的問題，但這僅是一種極為耗費人力的補救措施。解決低溫脅迫誘導(dǎo)早花的根本途徑是通過對低溫脅迫誘導(dǎo)煙草早花的分子機理研究，培育出耐低溫抗早花的煙草新品種。

目前可供參考借鑒的關(guān)于低溫脅迫影響植物花期的研究主要集中在擬南芥上。擬南芥（arabidopsisthaliana）是重要的模式植物，起源于高緯度地區(qū)及高山地區(qū)，生活環(huán)境以濕冷為主，因此具有明顯的低溫促進(jìn)開花（春化）現(xiàn)象。

大量的研究表明模式植物擬南芥存在至少五種成花途徑：春化作用（營養(yǎng)生長初期低溫脅迫）、溫度因素（營養(yǎng)期低溫脅迫）、光周期、赤霉素和自主開花途徑。這五種途徑都通過調(diào)控開花途徑關(guān)鍵基因floweringlocust(ft)、suppressorofoverexpressionofconstans1(soc1)及l(fā)eafy（lfy）來控制開花的精確時間。constant(co）在這些基因上游起正調(diào)控作用，與此同時，flooweringlocusc(flc）在ft、soc1、lfy的上游起負(fù)調(diào)控作用。

在非誘導(dǎo)性短日照條件下，赤霉素是擬南芥開花的必要條件，擬南芥ga1突變體（對映貝殼杉烯突變體）在短日照條件下外施赤霉素能夠開花，否者不能開花，但在長日照的條件下ga1-3表現(xiàn)為延遲開花。赤霉素能夠與赤霉素受體gid1結(jié)合然后與della結(jié)合形成ga-gid1-della三聚體，通過泛素26s蛋白酶體降解della蛋白。當(dāng)ga不存在的情況下，della蛋白能夠通過抑制lfy及soc1的表達(dá)從而抑制開花，而當(dāng)ga存在的時候，della蛋白降解，lfy及soc1表達(dá)上調(diào)從而促進(jìn)開花。目前關(guān)于赤霉素調(diào)控植物開花的研究主要集中在長日植物擬南芥，而對于短日植物則沒有涉及。并且低溫脅迫與赤霉素是否存在著互作進(jìn)而協(xié)同促進(jìn)植物開花目前沒有相關(guān)報道。

植物在營養(yǎng)生長的初期，經(jīng)過一段時間的低溫處理誘導(dǎo)成花作用被稱為春化作用，此過程主要由幾個mads轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控。低溫脅迫主要影響擬南芥fri（frigida）和flc基因的表達(dá)。fri位于flc基因的上游，促進(jìn)flc的表達(dá)，通過flc蛋白介導(dǎo)春化過程。flc基因編碼一個mads轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)自主開花/春化途徑，是開花路徑的負(fù)調(diào)控因子。flc蛋白通過結(jié)合soc1基因及ft基因啟動子上cargbox直接抑制soc1和ft基因的轉(zhuǎn)錄，soc1蛋白又能夠調(diào)控lfy基因的轉(zhuǎn)錄。過表達(dá)flc基因能夠抑制植物中soc1和ft基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制開花。春化作用導(dǎo)致flc基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均顯著降低，因此春化作用通過抑制莖頂端分生組織中flc基因的表達(dá)促進(jìn)開花。

春化作用是影響植物開花時期的重要因素，研究表明春化作用主要受到表觀遺傳修飾調(diào)控，表觀修飾能夠影響flc基因的表達(dá)，flc基因除了受fri基因調(diào)控，還存在h2b單泛素化、去乙?；?、h3k27三甲基化、h2a.z的富集。vin3(vernalizationinsensitive3)、vrn5(vernalization5)兩個基因與春化作用直接相關(guān)。vin3蛋白編碼1個phd結(jié)構(gòu)域蛋白,該基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，在春化初期能夠使flc基因組蛋白發(fā)生去乙?；?從而抑制flc基因的表達(dá)。vin3蛋白還能夠與另一個phd結(jié)構(gòu)域蛋白vrn5發(fā)生互作形成prc2復(fù)合物,該復(fù)合體參與flc染色質(zhì)的h3k27三甲基化和組蛋白去乙?；?使flc基因在表觀遺傳學(xué)水平沉默。另外ubc1(ubiquitin-conjugatingenzyme1)、ubc2(ubiquitin-conjugatingenzyme2)、hub1(histonemonoubiquitination1)和hub2(histonemonoubiquitination2)介導(dǎo)的flc染色質(zhì)h2b單泛素化、swr1c(swr1complex)能夠介導(dǎo)h2a.z在flc染色體上的富集等。

春化作用是植物在營養(yǎng)生長初期受到低溫脅迫誘導(dǎo)開花的現(xiàn)象，但在營養(yǎng)生長中期溫度高低對植物開花的影響卻呈現(xiàn)出與春化作用相反的態(tài)勢，即呈現(xiàn)高溫促進(jìn)、低溫抑制開花的趨勢。當(dāng)溫度為25-27℃時,即使在短日照條件下，擬南芥開花時間也與23℃長日照相似。一些開花調(diào)控基因的突變體如phyb、cry2、fri和flc等表現(xiàn)出比野生型更強的溫度依賴性。flc同源基因flm基因編碼一個mads-box結(jié)構(gòu)域蛋白，flm基因突變后擬南芥在23℃短日照情況下早花。在高溫條件下flm基因剪切形式發(fā)生變化，這種剪切能夠產(chǎn)生兩種變異體flm-β和flm-δ，這兩種變異結(jié)構(gòu)蛋白能夠競爭性地與開花抑制因子svp(shortvegetativepahse)蛋白互作。高溫條件下svp蛋白水平下降,同時svp-flm-β阻遏減少，促進(jìn)植物開花，在低溫條件下flm-β蛋白水平升高,形成svp-flm-β阻遏物,抑制開花。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種煙草抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花基因ntmyb15；第二目的在于提供所述的煙草抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花基因ntmyb15的克隆方法，第三目的在于提供所述的煙草抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花基因ntmyb15的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一目的是這樣實現(xiàn)的，所述的煙草抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花基因ntmyb15的核苷酸序列如seqidno：1所示。

本發(fā)明的第二目的是這樣實現(xiàn)的，包括以下步驟：

a、煙草葉片cdna合成：提取煙草葉片總rna，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cdna；

b、ntmyb15基因的pcr擴(kuò)增：以煙草葉片cdna為模板，根據(jù)ntmyb15基因序列設(shè)計引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，回收和純化pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，并測序。

本發(fā)明的第三目的是這樣實現(xiàn)的，所述的煙草抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花基因ntmyb15在獲得抗抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花轉(zhuǎn)基因煙草植株中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種新的控制植物開花時期相關(guān)蛋白及其編碼基因。

本發(fā)明所提供的植物開花時期調(diào)控相關(guān)蛋白，名稱為ntmyb15，其來源于k326栽培煙草，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)：

1)序列表中的seqidno：2；

2)將序列表中seqidno：2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物開花時期調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)。

序列表中的序列2由281個氨基酸組成。

所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

ntmyb15的編碼基因(ntmyb15)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

ntmyb15的編碼基因，可具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中seqidno：1的dna序列；2)編碼序列表中seqidno：2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中seqidno：1限定的dna序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中seqidno：1限定的dna序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna序列。

含有本發(fā)明ntmyb15的表達(dá)載體，細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增ntmyb15中任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明還提供了利用該基因增強植物開花時期調(diào)控的方法，是在植物中過量表達(dá)上述植物開花時期調(diào)控相關(guān)蛋白編碼基因。

過量表達(dá)上述植物開花時期調(diào)控相關(guān)蛋白編碼基因ntmyb15可通過多種方法實現(xiàn)，如植物病毒載體介導(dǎo)基因過表達(dá)的方法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化過表達(dá)載體，對基因編碼匡進(jìn)行優(yōu)化修改，對該基因啟動子進(jìn)行優(yōu)化以達(dá)到過表達(dá)效果等方法實現(xiàn)。本發(fā)明過量表達(dá)基因的方法并不限于上述幾種方法，只要能過量表達(dá)ntmyb15即可。

利用任何基因過表達(dá)或者基因修飾方法該ntmyb15使植物表現(xiàn)為抗低溫脅迫處理后不表現(xiàn)出開花時期提前的現(xiàn)象；利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的ntmyb15干擾載體轉(zhuǎn)入植物中，植物就表現(xiàn)出煙草低溫脅迫處理后開花時期延遲的現(xiàn)象。

本發(fā)明的ntmyb15基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(gus基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素，卡那霉素等)。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如：煙草、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草或苜宿等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以植物苗期葉片失水程度來篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明ntmyb15基因的表達(dá)載體可通過使用ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物經(jīng)組織培育成植株。

本發(fā)明的植物開花時期調(diào)控相關(guān)蛋白及其編碼基因為農(nóng)作物尤其是煙草優(yōu)化開花時期育種提供基因與技術(shù)的支持。

附圖說明

圖1為低溫脅迫處理及正常溫度下煙草開花表型與開花所需天數(shù)示意圖；

圖2為ntmyb15的rnai干擾片段pcr產(chǎn)物電泳圖；；

圖3為pdonr-zeo載體圖；

圖4為ntmyb15基因植物表達(dá)載體pb2gw7圖；

圖5為轉(zhuǎn)ntmyb15基因rnai干擾載體的煙草株系ntmyb15表達(dá)水平柱狀圖；

圖6為ntmyb15基因rnai干擾煙植株低溫脅迫后開花時期生長表型照片；

圖7為ntmyb15基因rnai干擾煙植株低溫脅迫后開花時期箱線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明所述的煙草抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花基因ntmyb15的核苷酸序列如seqidno：1所示。

所述的煙草抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花基因ntmyb15編碼的氨基酸序列如seqidno：2所示。

本發(fā)明所述的煙草抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花基因ntmyb15的克隆方法，包括以下步驟：

a、煙草葉片cdna合成：提取煙草葉片總rna，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cdna；

b、ntmyb15基因的pcr擴(kuò)增：以煙草葉片cdna為模板，根據(jù)ntmyb15基因序列設(shè)計引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，回收和純化pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，并測序。

b步驟中所述的引物為：

正向引物：5’-ccacttgaaaaagaggcttaaaaat-3’

反向引物：5’-taaaattttcagacgagtccatctc-3’。

b步驟中所述的pcr反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件如下：

b步驟中所述的回收和純化pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的具體操作如下：凝膠電泳后，用干凈的刀片將帶有目的片段的膠切割下來，放入到離心管中，膠不要切得過大，以避免回收時dna片段溶液含有大量的雜質(zhì)；向離心管中加入3倍體積的qg溶液后，在50℃條件下溫浴10min，直到膠完全融化；將離心管中的溶液移到2ml的吸附柱中，離心1min，棄去液相；再次向吸附柱中加入0.5ml的qg溶液，離心1min，棄去液相；向吸附柱加入0.75ml的pe溶液，離心1min，棄去液相；再次離心1min后，將吸附柱放置在一個新的離心管上，加入50μl的溶解液，靜置1min，最后離心1min，得到的液相即為回收的dna溶液。

本發(fā)明所述的煙草抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花基因ntmyb15的應(yīng)用為所述的煙草ntmyb15在抗低溫脅迫誘導(dǎo)煙草早花育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的煙草抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花基因ntmyb15的應(yīng)用為所述的煙草抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花基因ntmyb15在獲得抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花轉(zhuǎn)基因煙草植株中的應(yīng)用。

所述獲得抗低溫脅迫誘導(dǎo)煙草早花轉(zhuǎn)基因煙草植株的方法包括以下步驟：

a、構(gòu)建載體：

根據(jù)煙草基因組中篩選出的ntmyb15基因序列設(shè)計引物，并根據(jù)gateway系統(tǒng)中的bp反應(yīng)要求，在正向引物前加上5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgc3’序列，在反向引物前加5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtc3’序列。pcr反應(yīng)均采用phusion高保真聚合酶進(jìn)行pcr克隆。通過bp反應(yīng)將這些片段克隆到pdonr-zeocin載體中，然后通過lr反應(yīng)將這些片段分別克隆到各自目的載體中。

采用gateway?技術(shù)構(gòu)建載體，其原理可簡述如下：

attb1-gene-attb2×attp1-ccdb-attp2?attl1-gene-attl2×attr1-ccdb-attr2

(expressionclone)(pdonr?)(entryclone)(destinationvector)

bp反應(yīng)

（1）在200μl離心管中準(zhǔn)備8μl的反應(yīng)體系，包括：1-7μl的attb-pcr產(chǎn)物（約15-150ng，濃度≥10ng/μl）、1μl的pdonr載體（150ng/μl）和適量的te緩沖液（ph8.0），在室溫下混勻；

（2）將bpclonase?ii酶混合物在冰上靜置2min融化，輕輕震蕩2次，混勻待用；

（3）向（1）準(zhǔn)備的樣品中加入2μl的bpclonase?ii酶混合物，輕輕地將體系混勻；

（4）將bpclonase?ii酶混合物放回到-20°c或者-80°c保存；

（5）將反應(yīng)體系放在25°c溫浴1h；

（6）向反應(yīng)體系中加入1μl的蛋白酶k溶液，輕輕震蕩，然后將樣品放在37°c溫浴10min，以便終止bp反應(yīng)；

（7）將混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，取轉(zhuǎn)化菌液涂在含zeacin抗性的lb平板上，挑取菌落至含相應(yīng)抗生素培養(yǎng)基溶液中搖菌培養(yǎng)，確認(rèn)后提取陽性克隆的質(zhì)粒備用。

lr反應(yīng)

（1）在200μl離心管中準(zhǔn)備8μl的反應(yīng)物，包括：1-7μl的2.2.10.1獲得的pdonr-zeocin質(zhì)粒（50-150ng）、1μl的目的載體（150ng/μl）和適量的te緩沖液（ph8.0），在室溫下混勻；

（2）將lrclonase?ii酶混合物靜置在冰上2min融化，輕輕震蕩2次以混勻；

（3）加入2μl的lrclonase?ii酶混合物，輕輕震蕩將體系混勻；

（4）將lrclonase?ii酶混合物放回到-20°c或者-80°c冰箱保存；

（5）將反應(yīng)體系放在25°c溫浴反應(yīng)1h；

（6）向反應(yīng)體系中加入1μl的蛋白酶k溶液以終止lr反應(yīng)，輕輕震蕩后，將樣品放在37°c靜置10min；

（7）將lr反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后涂板、篩選陽性克隆、提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行酵母雙雜和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化等實驗。

b、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：

將1μg（200ng/μl）目的質(zhì)粒加入到100μl感受態(tài)農(nóng)桿菌中，混勻后在冰上靜置5min，放入液氮中冷凍5min，然后從液氮中取出，放入37℃水浴鍋中水浴5min，再在冰上靜置5min后，加入500μllb溶液，在28℃、充分震蕩條件下恢復(fù)培養(yǎng)4h，最后將菌液均勻涂抹于選擇性平板培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)48h。

c、培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株：

(1)無菌條件下，將煙草種子放入ep管中用無菌水沖洗2-3次；

(2)于75%的酒精中浸泡30-60sec；

(3)再用0.1%的升汞處理5min，最后用無菌水沖洗5次；

(4)播種于ms培養(yǎng)基上，培養(yǎng)在云南煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院組織培養(yǎng)室中，暗培養(yǎng)4天。25℃光照培養(yǎng)20-30天。

(5)待煙草苗長至3-5cm時（20-30天），取頂芽放于ms+ba0.2mg/l（壯芽，使其快速成長）培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)。

(6)繼代培養(yǎng)14天后（有小葉片即可），取葉片，大小1cmx1cm，切去葉柄，葉片表面及葉邊緣劃傷，放入ms+ba1.0mg/lph6.0-6.5的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，正面朝下緊貼培養(yǎng)基放置，于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2-3天。

(7)然后取出預(yù)培養(yǎng)的葉片或莖段，放入侵染液中進(jìn)行侵染。侵染前一天晚上，搖菌農(nóng)桿菌2瓶。將2ml離心管裝滿菌液，4000rpm離心5min，用懸菌液清洗兩次。以1:10比例（10ml懸菌液放1管1.5ml菌體）放入懸菌液，加入as25mg/l（40ml中加40ulas）不斷搖晃侵染液，使其與葉片及莖段切口處充分接觸，10min后，取出，放于滅過菌的干燥濾紙上吸干菌液；

(8)將葉片及莖段放回到預(yù)培養(yǎng)基上，28℃黑暗條件下共培養(yǎng)2-3天，至葉片切口周圍有微菌斑形成；

(9)洗菌，取出共培養(yǎng)的煙草葉片及莖段，用添加500mg/lcef的無菌水沖洗5次，第一次放置于搖床搖30min，后面每次5min，以洗去外植體表面的農(nóng)桿菌；

(10)取出后，用濾紙吸干，轉(zhuǎn)移到煙草誘芽培養(yǎng)基上，誘芽培養(yǎng)基為ms+ba1.0mg/l+hyg25mg/l+cef500mg/lph5.8；過2周觀察，如果發(fā)現(xiàn)不長菌，則降低cef濃度。如果長菌，則繼續(xù)保持cef濃度。

(11)每兩周更換一次培養(yǎng)基，直至長出不定芽（一般情況為2周）。切下再生的小苗（1cm左右），轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基ms+ba0.2-0.1mg/l+hyg25mg/l+cef500mg/lph5.8；

(12)至小苗長至2cm長時（有小芽即可），轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基ms+naa0.2-0.1mg/l上，24士1℃、12h光照、1500lx培養(yǎng)三周左右即可長出粗壯根系。

(13)對生根的植株進(jìn)行pcr初步檢測，將結(jié)果呈陽性的植株經(jīng)過煉苗后移到泥炭：蛭石=7:1的基質(zhì)中，放入人工氣候室進(jìn)行培養(yǎng)，并對其生長情況進(jìn)行觀察、記錄。

農(nóng)桿菌侵染液的制備

(1)取-80℃冰箱保存的含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，劃平板培養(yǎng)，lb固體平板中加入50mg/lkan和50mg/lrif；

(2)挑取單菌斑到含50mg/lkan和50mg/lrif的5mllb液體培養(yǎng)基中，放入搖床中28℃、200rpm培養(yǎng)過夜（12h-16h）；

(3)保存菌種，750ul菌液加入滅過菌的甘油250ul，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)搖菌，lb液體培養(yǎng)基10ml加kan（所需濃度50mg/l）10ul、rif（所需濃度50mg/l）10ul及菌液10ul，28℃、200rpm過夜培養(yǎng)（12h-16h）。

(5)當(dāng)菌液濃度達(dá)到od600=1.5左右時，取2ml菌液加入到離心管中，4000rpm離心5min；

(6)倒掉上清液，吸1ml新的ms液體培養(yǎng)基，重懸農(nóng)桿菌，4000rpm離心5min。

(7)重復(fù)步驟（6）一次；

(8)用1ml的ms液體培養(yǎng)基重懸菌后，再加入到40ml的ms的液體培養(yǎng)基中（含40ul25mg/l的as），即為侵染液。放置2h以上，再侵染。

下面以具體實施案例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明：

實施例1

低溫脅迫會使煙草早花

將6-7葉期煙株在12℃低溫脅迫下處理14天，設(shè)置正常溫度生長煙株為對照，12℃低溫脅迫下處理14天移至正常溫度下生長直至開花為低溫誘導(dǎo)煙草早花的實驗條件。早花表型能夠穩(wěn)定重現(xiàn)，經(jīng)低溫脅迫處理的煙草開花時間平均提前15天（圖1）。

實施例2

1.煙草葉片cdna合成

采用trizol(invitrogen，usa)試劑提取煙草葉片總rna，將煙草葉片總rna定量1μg于1.5ml離心管中，按照invitrogen公司的firststrandcdnasynthesiskit產(chǎn)品說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,最終獲得煙草葉片cdna。

2.ntmyb15基因的rnai片段pcr擴(kuò)增

以煙草葉片cdna為模板，根據(jù)煙草基因組數(shù)據(jù)庫信息設(shè)計引物，進(jìn)行ntmyb15基因的rnai載體片段pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

引物為：

正向引物：5’-ccacttgaaaaagaggcttaaaaat-3’

反向引物：5’-taaaattttcagacgagtccatctc-3’

將擴(kuò)增獲得的pcr產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳結(jié)果為(如圖2所示)，獲得293bp大小的片段。

電泳結(jié)束后，采用qiagen公司pcr產(chǎn)物純化試劑盒，按照產(chǎn)品說明回收純化所述的pcr產(chǎn)物，并送invitrogen測序，驗證序列結(jié)果，結(jié)果表明該序列與基因組數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)完全相同。

實施例3

1.植物rnai干擾載體的構(gòu)建

以實施例2中ntmyb15rnai干擾載體片段為模板，用含有g(shù)ateway接頭序列的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)pcr產(chǎn)物純化后，經(jīng)過bp反應(yīng)插入到invitrogen公司pdonr-zeo載體中（圖3）。將構(gòu)建好的bp反應(yīng)載體通過lr反應(yīng)將ntmyb15片段置換到phellsgate12（圖4）載體中。

gateway反應(yīng)引物序列如下：

ntmyb15_f

5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgcccacttgaaaaagaggcttaaaaat-3’

ntmyb15_r

5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaaaattttcagacgagtccatctc-3’。

2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

將經(jīng)過pcr反應(yīng)及測序，鑒定正確的重組質(zhì)粒利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌lba4404，通過菌落pcr確定陽性農(nóng)桿菌菌株，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草品種k326。

具體方法如下:

(1)無菌條件下，將煙草種子放入ep管中用無菌水沖洗2-3次；

(2)于75%的酒精中浸泡30-60sec；

(3)再用0.1%的升汞處理5min，最后用無菌水沖洗5次；

(4)播種于ms培養(yǎng)基上，培養(yǎng)在云南煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院組織培養(yǎng)室中，暗培養(yǎng)4天。25℃光照培養(yǎng)20-30天；

(5)待煙草苗長至3-5cm時（20-30天），取頂芽放于ms+ba0.2mg/l（壯芽，使其快速成長）培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)；

(6)繼代培養(yǎng)14天后（有小葉片即可），取葉片，大小1cmx1cm，切去葉柄，葉片表面及葉邊緣劃傷，放入ms+ba1.0mg/lph6.0-6.5的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，正面朝下緊貼培養(yǎng)基放置，于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2-3天；

(7)然后取出預(yù)培養(yǎng)的葉片或莖段，放入侵染液中進(jìn)行侵染。侵染前一天晚上，搖菌農(nóng)桿菌2瓶。將2ml離心管裝滿菌液，4000rpm離心5min，用懸菌液清洗兩次。以1:10比例（10ml懸菌液放1管1.5ml菌體）放入懸菌液，加入as25mg/l（40ml中加40ulas）不斷搖晃侵染液，使其與葉片及莖段切口處充分接觸，10min后，取出，放于滅過菌的干燥濾紙上吸干菌液；

(8)將葉片及莖段放回到預(yù)培養(yǎng)基上，28℃黑暗條件下共培養(yǎng)2-3天，至葉片切口周圍有微菌斑形成；

(9)洗菌，取出共培養(yǎng)的煙草葉片及莖段，用添加500mg/lcef的無菌水沖洗5次，第一次放置于搖床搖30min，后面每次5min，以洗去外植體表面的農(nóng)桿菌；

(10)取出后，用濾紙吸干，轉(zhuǎn)移到煙草誘芽培養(yǎng)基上，誘芽培養(yǎng)基為ms+ba1.0mg/l+hyg25mg/l+cef500mg/lph5.8；過2周觀察，如果發(fā)現(xiàn)不長菌，則降低cef濃度。如果長菌，則繼續(xù)保持cef濃度；

(11)每兩周更換一次培養(yǎng)基，直至長出不定芽（一般情況為2周）。切下再生的小苗（1cm左右），轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基ms+ba0.2-0.1mg/l+hyg25mg/l+cef500mg/lph5.8；

(12)至小苗長至2cm長時（有小芽即可），轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基ms+naa0.2-0.1mg/l上，24士1℃、12h光照、1500流明。培養(yǎng)三周左右即可長出粗壯根系；

(13)待根生長至2-3cm。苗高7-10cm左右時，移出三角瓶洗去根部培養(yǎng)基，移栽于花盆中，溫室培養(yǎng)。

采用qiagen公司dna提取試劑盒，提取轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的基因組dna，設(shè)計kan抗性基因引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，篩選陽性植株,檢測到25株陽性植株。

按照實例2中所述方法提取野生型植株和25株轉(zhuǎn)ntmyb15_基因t0代植株的總rna,進(jìn)行realtime-pcr分析，內(nèi)參基因為26s，分析不同株系的表達(dá)情況。選取表達(dá)量最低的兩株植株（圖5）。單株收取種子分別播種，用kan抗生素篩選tl代植株的分離情況，如此重復(fù)直至t3代獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系。

ntmyb15_qrt引物

ntmyb15__qrt_f：5’-tggagagccctccctaaact-3’

ntmyb15__qrt_r：5’-tttcaagtgggtgtgccata-3’

26s內(nèi)參基因引物

26s_f：5’-gaagaaggtcccaagggttc-3’

26s_r：5’-tctccctttaacaccaacgg-3’

實施例3

將野生型煙草k326植株和2個獨立的rnai干擾轉(zhuǎn)基因系(rnai_1及rnai_2)轉(zhuǎn)基因煙草種子均勻播于含營養(yǎng)土的小盆中，置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。待幼苗長至6-7片葉時(47天)，12℃低溫脅迫處理14天，同時設(shè)置在正常溫度下生長的煙株為對照。低溫脅迫處理14天后移至正常溫度下生長觀察低溫脅迫植株及對照煙株開花情況，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

rnai干擾ntmyb15基因表達(dá)后，rnai_1轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出低溫脅迫條件下開花較非轉(zhuǎn)基因植株及轉(zhuǎn)基因植株延遲，低溫脅迫和常溫生長非轉(zhuǎn)基因煙草基因現(xiàn)蕾，但rnai干擾煙株沒有現(xiàn)蕾（圖6）。同時統(tǒng)計2個rnai干擾轉(zhuǎn)基因系(rnai-1及rnai_2)單株的開花時期箱線圖，轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出低溫脅迫條件下開花較非轉(zhuǎn)基因植株及轉(zhuǎn)基因植株延遲，延遲時間比非轉(zhuǎn)基因煙株晚大約為5-6天（圖7）。

sequencelisting

<110>云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院

<120>一種煙草抗低溫脅迫誘導(dǎo)早花基因ntmyb15及其克隆方法與應(yīng)用

<130>2017

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>846

<212>dna

<213>ntmyb15核苷酸

<400>1

atggtgagagctccttgttgtgagaagatggggttgaaaaaaggaccatggactcctgaa60

gaagatcaaattcttgtttcttatattcaaacaaatggccatggcaattggagagccctc120

cctaaactagctggacttttgagatgtgggaagagttgcagattgcgttggactaactat180

ttgcgtccagatataaagaggggaaactttactagagaagaagaagactccattattcag240

ttacatgaaatgcttggcaatagatggtctgcaatagcagcgagattaccgggacgaacg300

gacaatgaaattaaaaatgtatggcacacccacttgaaaaagaggcttaaaaattaccag360

cctcctcaaaactccaaaagacactccaaaaacaaccttgattccaaagctcctagtact420

tctcaaaccttcaataattcagacaattttagcaatatccaagaagatattaatgggccc480

gtgaccggcccgaactcgccacaacgatcgtctagtgagatgtcgactgtcacggttgat540

tcaacagccatgacgaccatcacaatcgatgatcagaatatgtttaagcaattagatgag600

atggactcgtctgaaaattttattccagagattgatgagagtttttggacggatgattta660

tccacaagcgataactcgacttttggtatggagggtaccggtggagaattacaagtccaa720

tttccattttcttcggtgaagcaagaaagtatggacatggttggagcaaaattagaggac780

gacatggacttttggtacaatgttttcataaagtccggggacttactagatttaccggaa840

ttttga846

<210>2

<211>281

<212>prt

<213>ntmyb15氨基酸

<400>2

metvalargalaprocyscysglulysmetglyleulyslysglypro

151015

trpthrproglugluaspglnileleuvalsertyrileglnthrasn

202530

glyhisglyasntrpargalaleuprolysleualaglyleuleuarg

354045

cysglylyssercysargleuargtrpthrasntyrleuargproasp

505560

ilelysargglyasnphethrarggluglugluaspserileilegln

65707580

leuhisglumetleuglyasnargtrpseralailealaalaargleu

859095

proglyargthraspasngluilelysasnvaltrphisthrhisleu

100105110

lyslysargleulysasntyrglnproproglnasnserlysarghis

115120125

serlysasnasnleuaspserlysalaproserthrserglnthrphe

130135140

asnasnseraspasnpheserasnileglngluaspileasnglypro

145150155160

valthrglyproasnserproglnargserserserglumetserthr

165170175

valthrvalaspserthralametthrthrilethrileaspaspgln

180185190

asnmetphelysglnleuaspglumetaspsersergluasnpheile

195200205

progluileaspgluserphetrpthraspaspleuserthrserasp

210215220

asnserthrpheglymetgluglythrglyglygluleuglnvalgln

225230235240

phepropheserservallysglnglusermetaspmetvalglyala

245250255

lysleugluaspaspmetaspphetrptyrasnvalpheilelysser

260265270

glyaspleuleuaspleuprogluphe

275280

<210>3

<211>31

<212>dna

<213>bp_f

<400>3

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgc31

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>bp_r

<400>4

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtc30

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>ntmyb15_f

<400>5

ccacttgaaaaagaggcttaaaaat25

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>ntmyb15_r

<400>6

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<210>7

<211>56

<212>dna

<213>gatewany反應(yīng)正向引物ntmyb15_f

<400>7

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgcccacttgaaaaagaggcttaaaaat56

<210>8

<211>55

<212>dna

<213>gatewany反應(yīng)正向引物ntmyb15_f

<400>8

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaaaattttcagacgagtccatctc55

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>ntmyb15__qrt_f

<400>9

tggagagccctccctaaact20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>ntmyb15__qrt_r

<400>10

tttcaagtgggtgtgccata20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>26s_f

<400>11

gaagaaggtcccaagggttc20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>26s_r

<400>12

tctccctttaacaccaacgg20