本發(fā)明涉及農(nóng)作物植株不同部位的rna提取方法，具體涉及一種蕎麥rna的優(yōu)化提取方法。
背景技術(shù)：
：十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethyammoniumbromide，簡(jiǎn)稱(chēng)ctab）是一種離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和和膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使rna得以游離出來(lái)，與其他提取方法相比可以更有效地去除多糖和酚類(lèi)等物質(zhì)。而且提取的rna濃度和純度都高，可以支持后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。目前，現(xiàn)有技術(shù)中有很多提取rna的試劑盒，takaraminibestplantrnaextractionkit和takararnaisoplus（totalrna提取試劑）。但是，前者提取的濃度和回收量達(dá)不到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用要求，而且費(fèi)用較高；后者，價(jià)格雖然便宜，但是比較適用于一些內(nèi)含物質(zhì)較少的草本植物和微生物及動(dòng)物組織細(xì)胞；而蕎麥組織中富含蛋白質(zhì)、酚類(lèi)、多糖，目前，還沒(méi)有一種提取蕎麥植株不同器官rna方法的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種提取rna濃度高、純度高、操作成本低、安全快捷的蕎麥rna的提取優(yōu)化方法。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：一種蕎麥rna的優(yōu)化提取方法，它包括以下步驟：（1）滅菌處理：對(duì)所用的器皿和器具進(jìn)行高壓濕熱滅菌消毒；（2）配制tris-hcl緩沖溶液和ctab提取溶液，所述ctab提取液包含質(zhì)量比為3%ctab、質(zhì)量比為2%pvp、25mmol/ledta、2mol/lnacl，用ph8.0的tris-hcl緩沖液配制；（3）研磨樣品：將蕎麥的待提取材料放入ep管中，置液氮環(huán)境下研磨直至研磨成粉末；（4）提取液浸提：加入預(yù)熱的所述ctab提取液于樣品中，快速混勻，再加入β-巰基乙醇，快速混勻，再加入氯仿-異戊醇萃取，混勻后靜置，離心后取上清液；（5）重復(fù)步驟（4）萃取，向上清液中加入氯仿-異戊醇，混勻后靜置，4℃離心，取上清液；（6）然后向上清液中加入4℃異丙醇溶液，混勻后置于-20℃下10~30min沉淀rna，4℃離心，ep管底部為rna沉淀，倒掉上清液，乙醇清洗兩次，4℃離心；（7）向沉淀中加雙蒸水，50~60℃溫浴后震蕩混勻獲得蕎麥rna，做電泳定性檢測(cè)或定量測(cè)定rna濃度。進(jìn)一步的：所述步驟（1）中高壓濕熱滅菌消毒為在121℃、0.2mpa壓力下進(jìn)行。進(jìn)一步的：所述步驟（3）中待提取材料為蕎麥的根、莖和葉。進(jìn)一步的：所述待提取材料中根選取靠近根尖3~5cm的部分；莖選取接近根部的2~3cm的部分；葉選取第2片真葉。進(jìn)一步的：所述步驟（3）中用酒精火焰燒融對(duì)槍頭進(jìn)行滅菌，用燒融槍頭的封口端快速研磨樣品，每次間隔5~10s放入液氮速凍。進(jìn)一步的：所述步驟（4）中加入β-巰基乙醇，快速混勻后，置65℃水浴鍋中溫浴，立即放入冰盒中靜置5min，取出加氯仿-異戊醇萃取，混勻后靜置，4℃離心，取上清液。進(jìn)一步的：所述步驟（6）中加入的異丙醇溶液與上清液體積相同。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果是：本發(fā)明具體采用十六烷基三甲基溴化銨優(yōu)化提取蕎麥根、莖和葉rna；采用ctab去除多糖和酚類(lèi)等物質(zhì)，聚乙烯吡咯烷酮和β-巰基乙醇去除酚類(lèi)物質(zhì)，異丙醇沉淀rna效果明顯，tris-hcl緩沖液和nacl起到防止rna降解作用。本發(fā)明通過(guò)ctab法的優(yōu)化，改licl沉淀為異丙醇沉淀，減少了licl沉淀的后續(xù)抽提工作。本發(fā)明技術(shù)方案可分別提取蕎麥根、莖和葉不同部位rna，提取濃度達(dá)到100~500ng/μl，可用于rt-qpcr和race等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便快捷，成本低，獲得rna的濃度和純度較高。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明提取的rna濃度和定性檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1本發(fā)明所述蕎麥rna的提取優(yōu)化方法具體包括以下步驟：1、滅菌處理：用高壓鍋在高壓（0.2mpa）濕熱（121℃）對(duì)所用的玻璃器皿和塑料制品滅菌1h。所述玻璃器皿和塑料制品包括250ml量筒，250ml燒杯，400ml錐形瓶，去離子水，細(xì)口瓶，ep管，槍頭等。2、配制溶液：配制溶液所需容器均為步驟（1）中滅菌處理后的容器。（1）、配制tris-hcl緩沖溶液：量取200ml滅菌去離子水，加入tris0.605g，溶解后，用hcl（200μl）調(diào)節(jié)ph值至8.0。（2）、配制ctab提取溶液：稱(chēng)取ctab6g，pvp4g，edta1.46125g，nacl23.376g，放入燒杯加入150mltris-hcl超聲波震蕩至溶解，用量筒定容至200ml，放入細(xì)口瓶中，用錫箔紙封蓋；（3）、氯仿：異戊醇=24:1（v/v）；（4）、冷藏保存的異丙醇（分析純級(jí)別）。3、研磨樣品：稱(chēng)取蕎麥植株不同器官（包括根、莖和葉）的待提取材料約0.1g于滅菌ep管中，并做標(biāo)記，放于液氮中速凍，備用或放入-80℃冰箱中待用。所述待提取材料中根選取靠近根尖3~5cm的部分；莖選取接近根部的2~3cm的部分；葉選取第2片真葉。用滅菌處理后經(jīng)酒精火焰燒融封口的藍(lán)色槍頭，在液氮環(huán)境下研磨待提取材料，間隔5~10s再放入液氮速凍，直至研磨成粉末；葉片容易研磨，根和莖因?yàn)槔w維較多，應(yīng)適當(dāng)增加研磨時(shí)間。4、提取液浸提：取650μl65℃預(yù)熱的所述提取液，立即再次加入20μl的β-巰基乙醇，迅速震蕩，混勻，后放入65℃水浴鍋中，溫浴20min，期間間隔5min搖晃10s。然后迅速放入冰盒中5min，然后加入等體積（680μl）的氯仿-異戊醇（體積比24:1），混勻后靜置2min，4℃離心（12000r/min）15min，取上清液于另一滅菌ep管。5、重復(fù)步驟4萃取兩次，向上清液中添加等體積氯仿-異戊醇，混勻后靜置2min，4℃離心（12000r/min）15min，取上清液于另一滅菌并標(biāo)記的ep管。6、加入與上清液等體積的（500μl）4℃放置異丙醇溶液，混勻后置于-20℃冰箱30min~1h，沉淀rna，4℃離心（12000r/min）15min，ep管底部有rna沉淀，如果沒(méi)有看到沉淀可以繼續(xù)放入-20℃冰箱適當(dāng)延長(zhǎng)沉淀時(shí)間。倒掉上清液，75%乙醇（滅菌水配制）清洗兩次，每次750μl。7、加15~30μl雙蒸水，50~60℃溫浴5min后震蕩混勻，然后做電泳定性檢測(cè)或定量測(cè)定rna濃度。按照以上操作步驟獲得的rna濃度和純度較高，蕎麥根部rna濃度100~500ng/μl，莖部rna濃度100~500ng/μl，葉片rna濃度100~1000ng/μl。序號(hào)1~6為takararnaisoplus（totalrna提取試劑）試劑盒提取rna的結(jié)果，7~12為利用本發(fā)明優(yōu)化后的ctab法提取rna的結(jié)果，提取的rna濃度和定性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。表1提取的rna濃度序號(hào)名稱(chēng)濃度/（ng/μl）260/280260/2301莖147.21.560.932莖92.61.772.163根45.71.712.074根90.61.812.165葉117.11.891.756葉221.11.881.797根175.32.042.248根123.82.012.229莖285.01.932.2310莖464.71.962.2511葉554.02.012.1712葉512.41.922.12以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12