本發(fā)明涉及病原體檢測和診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測泌尿生殖道致病微生物的lamp引物組合物及其相關(guān)應(yīng)用。

背景技術(shù)：

性傳播感染(sexuallytransmittedinfections,sti)是世界上最常見的公共衛(wèi)生問題之一。世界衛(wèi)生組織目前估計全世界每年新發(fā)sti病例2.5億。在我國，以性傳播泌尿生殖道感染(sexuallytransmittedurogenitalinfections,stui)為主要表現(xiàn)的sti逐年增加。隨著艾滋病全球性的傳播蔓延，目前hiv感染在中國呈現(xiàn)快速增長的趨勢。非常值得注意的是，sti可以促進(jìn)hiv/aids的異性間傳播。stui的防治是預(yù)防和控制hiv/aids的重要環(huán)節(jié)，已引起人們的高度重視。尤其非淋菌性尿道炎(nongonococcalurethritis,ngu),由于病原菌種類多，可單獨(dú)或混合感染(包括其它sti)，潛伏期長，臨床表現(xiàn)差異較大，可引起合并癥，治療效果比淋病差，所以流行甚廣，發(fā)病率逐年升高。近年來各種報道顯示，淋菌性尿道炎發(fā)病率下降，而ngu發(fā)病率卻不斷上升，在西方國家和國內(nèi)部分地區(qū)ngu已超過淋病，居sti的首位。80年代美國每年新發(fā)生的ngu病例達(dá)300-1000萬人，其中1.1萬名婦女因本病導(dǎo)致不孕而要治療。

研究已證實淋球菌、解脲脲原體、沙眼衣原體、人型支原體、生殖支原體、單純皰疹病毒ii(hsv-2)、白念珠菌以及陰道毛滴蟲為引起stui的最常見病原體。其中淋球菌引起淋病，40％-50％的ngu由沙眼衣原體引起，30％的ngu由解脲脲原體為主的支原體所引起，10％-20％的ngu由其它病原體所引起，如白念珠菌、陰道毛滴蟲、單純皰疹病毒ii等。

傳統(tǒng)的病因?qū)W實驗室診斷方法大多耗時長、敏感性低及操作技術(shù)要求高。淋球菌實驗室檢查包括涂片檢查、培養(yǎng)檢查、抗原檢測和基因診斷等。(1)涂片檢查：對有大量膿性分泌物的單純淋球菌性前尿道炎患者，此法陽性率在90％左右，可以初步判斷。女性宮頸分泌物中雜菌多，敏感性和特異性較差，陽性率僅為50-60％，且有假陽性。(2)培養(yǎng)檢查：淋病雙球菌培養(yǎng)是目前診斷淋病的金標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)陽性率男性80-95％，女性80-90％。(3)抗原檢測：敏感性不高，特異性差，受實驗人員判斷水平的影響較大。(4)基因診斷：包括基因探針診斷和基因擴(kuò)增檢測。探針技術(shù)檢測淋球菌，雖然比培養(yǎng)方法在靈敏度、特異性和方便上有了很大提高，但仍有一定的局限性。pcr技術(shù)的反應(yīng)出現(xiàn)進(jìn)一步提高了檢測淋球菌的靈敏性。

沙眼衣原體感染常用的實驗室診斷方法包括標(biāo)本涂片染色直接鏡檢、沙眼衣原體細(xì)胞培養(yǎng)、沙眼衣原體抗原檢測、血清學(xué)試驗和pcr技術(shù)。(1)標(biāo)本涂片染色直接鏡檢可用于新生兒眼結(jié)膜刮片的檢查，但它不適宜用于泌尿生殖道沙眼衣原體感染的診斷。(2)細(xì)胞培養(yǎng)法是目前檢測沙眼衣原體感染最為敏感和特異的方法。但是該方法操作繁瑣、費(fèi)時，設(shè)備昂貴，技術(shù)性強(qiáng)，且不易進(jìn)行血清學(xué)分型，臨床不易推廣。(3)抗原檢測試驗診斷沙眼衣原體的敏感性僅為70-90％，特異性為83-99％，缺點是在低感染率的人群中敏感性差，受實驗人員的主觀影響大。(4)血清學(xué)試驗對于診斷無并發(fā)癥的泌尿生殖道感染價值不大。(5)pcr技術(shù)具有很高的敏感性，若引物篩選得當(dāng)，反應(yīng)條件適合，操作中嚴(yán)防污染，特異性較好，已被廣泛應(yīng)用于對多種致病微生物的鑒定和檢測。支原體感染的實驗室檢查包括支原體培養(yǎng)、支原體血清學(xué)檢測和基因診斷等。用細(xì)胞培養(yǎng)的方法分離支原體是較特異性的方法，但該方法復(fù)雜、花費(fèi)高、時間長，阻礙了它在臨床的推廣應(yīng)用?；蛟\斷目前只要應(yīng)用dna探針及pcr技術(shù)。前者敏感性較差，后者具有高度的敏感性和特異性，又有快速和簡便等優(yōu)點。白念珠菌的實驗室檢查包括直接鏡檢、染色檢查和分離培養(yǎng)。染色檢查的陽性率比直接鏡檢法高。念珠菌培養(yǎng)敏感性和特異性均高，缺點是費(fèi)時較長。診斷單純皰疹病毒2型感染，有各種不同的實驗室方法。實驗室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍是單純皰疹病毒2型分離培養(yǎng)法，通過抗體中和實驗、dna雜交實驗、酶免疫試驗等發(fā)發(fā)對培養(yǎng)結(jié)果作鑒定。這種傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測方法敏感性欠佳，費(fèi)時費(fèi)力且設(shè)備和技術(shù)條件要求高。細(xì)胞學(xué)檢查敏感性為40-60％，而且特異性差。酶免疫試驗法可直接快速檢測單純皰疹病毒，但敏感性和特異性亦相對較低。目前多種血清學(xué)試驗用于檢查單純皰疹病毒抗體，但在感染早期檢測敏感性低，對臨床診斷意義不大，常用于流行病學(xué)調(diào)查。檢查陰道毛滴蟲最簡單的方法是懸滴法，陽性率可達(dá)80-90％。陰道毛滴蟲由于費(fèi)時、操作復(fù)雜臨床不常用，且臨床一般不采用免疫學(xué)方法檢查。近年來，許多學(xué)者將pcr應(yīng)用于陰道毛滴蟲病的檢測，并認(rèn)為該方法診斷滴蟲感染敏感而特異。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為性傳播泌尿生殖道感染的早期診斷創(chuàng)造了條件，目前應(yīng)用于臨床診斷的主要是pcr技術(shù)。包括以pcr為基礎(chǔ)衍生出的多種技術(shù)：包括反轉(zhuǎn)錄pcr(rt-pcr)、多重pcr、巢式pcr、rapd技術(shù)、實時熒光定量pcr等。然而，上述檢測方法存在檢測周期長、檢測體系和操作過程比較復(fù)雜，難以實行現(xiàn)場檢測等問題，且需要專業(yè)人員操作。另外，pcr儀價格昂貴，擴(kuò)增時間較長。因此，在科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐中均需要一種快速簡便、容易普及、安全可靠且適用于現(xiàn)場操作的檢測方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification，以下簡稱lamp法)是日本榮研化學(xué)株式會社于2000年前后開發(fā)出的基因擴(kuò)增技術(shù)，其具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點。另外，微流控芯片作為一種病原體分子檢測技術(shù)具有高通量、快速、準(zhǔn)確、可靠的特點，能夠?qū)崿F(xiàn)對組群樣品、多目標(biāo)同時檢測，極大的提高了檢測效率，且目前尚未有將lamp法應(yīng)用于快速檢測性傳播泌尿生殖道致病微生物的微流控芯片和試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出的一種用于檢測泌尿生殖道致病微生物的lamp引物組合物及其相關(guān)應(yīng)用，具體地，本發(fā)明的技術(shù)方案包括：

第一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測泌尿生殖道致病微生物的lamp引物組合物，包括沙眼衣原體引物組、淋球菌引物組、解脲脲原體引物組、人型支原體引物組、生殖支原體引物組、單純皰疹病毒2型引物組、白念珠菌引物組、陰道毛滴蟲引物組中的任意一組或幾組，其中：

所述沙眼衣原體引物組正向外引物f3序列如seqidno.5所示，反向外引物b3序列如seqidno.6所示，正向內(nèi)引物fip序列如seqidno.7所示，反向內(nèi)引物bip序列如seqidno.8所示；

所述淋球菌引物組正向外引物f3序列如seqidno.9所示，反向外引物b3序列如seqidno.10所示，正向內(nèi)引物fip序列如seqidno.11所示，反向內(nèi)引物bip序列如seqidno.12所示；

所述解脲脲原體引物組正向外引物f3序列如seqidno.13所示，反向外引物b3序列如seqidno.14所示，正向內(nèi)引物fip序列如seqidno.15所示，反向內(nèi)引物bip序列如seqidno.16所示；

所述人型支原體引物組正向外引物f3序列如seqidno.17所示，反向外引物b3序列如seqidno.18所示，正向內(nèi)引物fip序列如seqidno.19所示，反向內(nèi)引物bip序列如seqidno.20所示；

所述生殖支原體引物組正向外引物f3序列如seqidno.21所示，反向外引物b3序列如seqidno.22所示，正向內(nèi)引物fip序列如seqidno.23所示，反向內(nèi)引物bip序列如seqidno.24所示；

所述單純皰疹病毒2型引物組正向外引物f3序列如seqidno.25所示，反向外引物b3序列如seqidno.26所示，正向內(nèi)引物fip序列如seqidno.27所示，反向內(nèi)引物bip序列如seqidno.28所示；

所述白念珠菌引物組正向外引物f3序列如seqidno.29所示，反向外引物b3序列如seqidno.30所示，正向內(nèi)引物fip序列如seqidno.31所示，反向內(nèi)引物bip序列如seqidno.32所示；

所述陰道毛滴蟲引物組正向外引物f3序列如seqidno.33所示，反向外引物b3序列如seqidno.34所示，正向內(nèi)引物fip序列如seqidno.35所示，反向內(nèi)引物bip序列如seqidno.36所示。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的lamp引物組合物，還包括內(nèi)參引物組，所述內(nèi)參引物組正向外引物f3序列如seqidno.1所示，反向外引物b3序列如seqidno.2所示，正向內(nèi)引物fip序列如seqidno.3所示，反向內(nèi)引物bip序列如seqidno.4所示。

第二方面，本發(fā)明還提供上述的lamp引物組合物在制備檢測泌尿生殖道致病微生物的試劑或試劑盒的相關(guān)應(yīng)用。

第三個方面，本發(fā)明還提供一種檢測泌尿生殖道致病微生物的芯片，所述芯片固定有上述的lamp引物組合物，優(yōu)選地，所述芯片為恒溫擴(kuò)增微流控芯片。

第四個方面，本發(fā)明還提供一種用于檢測泌尿生殖道致病微生物的試劑盒，，所述試劑盒包括上述的lamp引物組合物；進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括bstdna聚合酶、顯色染料；優(yōu)選地，所述顯色染料選自hnb、calcein、甲酚紅、酚紅、間甲酚紫、溴甲酚紫、中性紅、萘酚酞、百里酚藍(lán)任意一種或幾種；更進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括udg酶和/或dutp。

本發(fā)明最后一方面還包括一種非診斷和治療目的的檢測泌尿生殖道致病微生物的方法，包括步驟：

提取待測樣本的核酸，用上述的lamp引物組合物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，確定待測樣本是否含有相應(yīng)引物組對應(yīng)的泌尿生殖道致病微生物。

本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：

本發(fā)明將特異核酸序列與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性強(qiáng)的沙眼衣原體、淋球菌、解脲脲原體、人型支原體、生殖支原體、單純皰疹病毒2型、白念珠菌、陰道毛滴蟲檢測微流控芯片及其檢測方法。本發(fā)明提供的8個引物組能特異性地檢測上述8個致病微生物，而且與其他病原微生物無交叉反應(yīng)，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌。同時，本發(fā)明提供的8個引物組對沙眼衣原體dna、淋球菌dna、解脲脲原體dna、人型支原體dna、生殖支原體dna、單純皰疹病毒2型dna、白念珠菌dna、陰道毛滴蟲dna的最低檢測限均為5×10²拷貝/μl。

本發(fā)明提供的檢測性傳播泌尿生殖道相關(guān)致病微生物的試劑盒，可快速、準(zhǔn)確地檢測沙眼衣原體、淋球菌、解脲脲原體、人型支原體、生殖支原體、ii型單純皰疹病毒、白念珠菌、陰道毛滴蟲，以彌補(bǔ)針對上述致病微生物檢測技術(shù)存在的費(fèi)時耗力的缺陷，擴(kuò)展病原菌檢測范圍，提高檢測靈敏度和特異性，降低勞動強(qiáng)度，縮短檢測周期。本發(fā)明還可以肉眼可視化判定檢測結(jié)果，擺脫昂貴的pcr檢測儀器，使本發(fā)明在科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐中快速簡便、容易普及、安全可靠且適用于現(xiàn)場操作。本發(fā)明的檢測試劑盒還加入了防污染體系，能有效的防止擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。對于臨床而言，能夠在1h內(nèi)獲得8種致病微生物指標(biāo)的檢測結(jié)果不僅快于目前較為普遍采用的實時熒光定量pcr方法，而且對于快速輔助指導(dǎo)治療和用藥也具有重要意義。同時，多指標(biāo)的檢測也可以用于地域性的流行病學(xué)調(diào)研和疫情監(jiān)控，以研究性傳播泌尿生殖道感染在中國的流行情況。

附圖說明

圖1為實施例中應(yīng)用的圓盤式微流控芯片及引物點樣池示意圖，圖中標(biāo)號非附圖標(biāo)記，而為1-32#反應(yīng)池；

圖2為實施例二中8種性傳播泌尿生殖道感染圓盤式微流控芯片檢測結(jié)果圖。其中，1為沙眼衣原體臨床樣本在1#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；2為淋球菌臨床樣本在2#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；3為解脲脲原體臨床樣本在3#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；4為人型支原體臨床樣本在4#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；5為內(nèi)參hbb在5#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；6-8為陰性對照在6-8#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；9為生殖衣原體臨床樣本在9#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；10為單純皰疹病毒2型臨床樣本在10#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；11為白念珠菌臨床樣本在11#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；12為陰道毛滴蟲臨床樣本在12#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；13為內(nèi)參hbb在13#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；14-16為陰性對照在14-16#反應(yīng)池的肉眼可視化檢測結(jié)果；17為沙眼衣原體臨床樣本在17#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；18為淋球菌臨床樣本在18#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；19為解脲脲原體臨床樣本在19#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；20為人型支原體臨床樣本在20#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；21為內(nèi)參hbb在21#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；22-24為陰性對照在22-24#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；25為生殖衣原體臨床樣本在25#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；26為單純皰疹病毒2型臨床樣本在26#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；27為白念珠菌臨床樣本在27#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；28為陰道毛滴蟲臨床樣本在28#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；29為內(nèi)參hbb在29#反應(yīng)池的檢測結(jié)果；30-32為陰性對照在30-32#反應(yīng)池的肉眼可視化檢測結(jié)果；

圖3為實施例三中以淋病病人的生殖道分泌物樣本中粗提核酸作為模板，在以分別固定8種性傳播泌尿生殖道感染病原微生物的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物的反應(yīng)池1-4、9-12、17-20以及25-27，內(nèi)參引物的反應(yīng)池5、13、21以及29和無固定引物的反應(yīng)池6-8、14-16、22-24以及30-32進(jìn)行恒溫擴(kuò)增反應(yīng)得到肉眼可視化檢測結(jié)果。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但是下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。

實施例一用于檢測泌尿生殖道致病微生物的lamp引物組合物的設(shè)計和制備

核糖體dna序列存在于所有的生物體內(nèi)，在進(jìn)化過程中具有相同的起源與功能，可以反映物種間具有可比性的進(jìn)化史。16srrna基因是細(xì)菌上編碼rrna相對應(yīng)的dna序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中。16srrna具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長。隨著pcr技術(shù)的出現(xiàn)及核酸研究技術(shù)的不斷完善，16srrna基因檢測技術(shù)已成為病原菌檢測和鑒定的一種強(qiáng)有力工具。rdna的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacer，its)是真核細(xì)胞rdna中18s和28srdna基因拷貝區(qū)之間的一段區(qū)域，其中5.8srdna位于its1、its2之間。5.8srdna的核苷酸序列保守性很強(qiáng)，而its1和its2進(jìn)化較快，但種間同源性非常小，而種內(nèi)同源性很高，可用于種間的鑒定。單純皰疹病毒兩種型別的基因結(jié)構(gòu)相似，序列同源性達(dá)到40％，因此要特異地檢測單純皰疹病毒2型，則需選擇一段單純皰疹病毒2型特異性基因作為靶基因。單純皰疹病毒的gg基因位于us4基因區(qū)，分析單純皰疹病毒兩種型別us4dna序列表明，它們之間有較大差別，是迄今所知單純皰疹病毒1型和單純皰疹病毒2型差異最大的區(qū)段，因此選擇gg基因區(qū)作為靶基因。

1.1序列獲得：

(1)16srrna基因序列的獲得：從genebank公共數(shù)據(jù)庫分別下載沙眼衣原體16srrna基因序列(如seqidno.38所示)、淋球菌16srrna基因序列(如seqidno.39所示)、解脲脲原體16srrna基因序列(如seqidno.40所示)、人型支原體16srrna基因序列(如seqidno.41所示)、生殖支原體的16srrna基因序列(如seqidno.42所示)。

(2)5.8srdna基因序列的獲得：從genebank公共數(shù)據(jù)庫分別下載白念珠菌的5.8srdna基因序列(如seqidno.44所示)、陰道毛滴蟲的5.8srdna基因序列(如seqidno.45所示)。

(3)單純皰疹病毒2型基因gg基因序列的獲得：從genebank公共數(shù)據(jù)庫下載hsv-ii基因gg的基因序列(如seqidno.43所示)。

(4)內(nèi)參hbb基因序列的獲得：從genebank公共數(shù)據(jù)庫分別下載hbb基因序列(如seqidno.37所示)。

1.2引物設(shè)計

(1)特異性基因引物：將上述從genebank公共數(shù)據(jù)庫下載得到的特異基因序列用序列對比軟件dnaman比對，找到該基因的保守區(qū)段，將該保守區(qū)段導(dǎo)入引物設(shè)計軟件中，選取f1c和b1c的tm值相近、f3/b3/f2/b2的tm值相近，且f1c和b1c的tm值比f3/b3/f2/b2的tm值大5℃，5’dg和3’dg的絕對值小于4的dna序列作為候選引物。

(2)內(nèi)參hbb引物：將上述從genebank公共數(shù)據(jù)庫下載得到的特異基因序列用序列對比軟件dnaman比對，找到該基因的保守區(qū)段，將該保守區(qū)段導(dǎo)入軟件中，選取f1c和b1c的tm值相近、f3/b3/f2/b2的tm值相近，且f1c和b1c的tm值比f3/b3/f2/b2的tm值大5℃，5’dg和3’dg的絕對值小于4的dna序列作為候選引物。

(3)引物合成：將下表1中的引物序列委托英濰捷基公司合成，備用。

(4)引物篩選：將合成好的引物溶解并適量稀釋后進(jìn)行引物篩選，最終得到用于制備本發(fā)明微流控芯片所需要的特異、靈敏的引物，將篩選好的引物連同反應(yīng)液一起冷凍干燥在微流控芯片的反應(yīng)池中。

在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，篩選好的36條引物如表1所示。其中，編號no.1-4(seqidno:1-seqidno:4)的引物序列選自hbb基因的mrna序列，作為內(nèi)參用。編號no.5-8(seqidno:5-seqidno:8)的引物選自沙眼衣原體的16srrna基因序列，編號no.9-12(seqidno:9-seqidno:12)的引物選自淋球菌的16srrna基因序列，編號no.13-16(seqidno:13-seqidno:16)的引物選自解脲脲原體的16srrna基因序列，編號no.17-20(seqidno:17-seqidno:20)的引物選自人型支原體的16srrna基因序列，編號no.21-24(seqidno:21-seqidno:24)的引物選自生殖支原體的16srrna基因序列，編號no.25-28(seqidno:25-seqidno:28)的引物選自單純皰疹病毒2型的gg基因序列，編號no.29-30(seqidno:29-seqidno:30)的引物選自白念珠菌的5.8srdna基因序列，編號no.31-36(seqidno:31-seqidno:36)的引物選自陰道毛滴蟲的5.8srdna基因序列，編號

37的引物為陰性對照。

表1：引物組合物中的引物序列

實施例二用于檢測泌尿生殖道治病微生物的試劑盒的制備及其使用

本實施例中的沙眼衣原體、淋球菌、解脲脲原體、人型支原體、生殖支原體、單純皰疹病毒2型、白念珠菌、陰道毛滴蟲、人巨細(xì)胞病毒、梅毒、普通變形桿菌、乳酸桿菌、陰道加德納菌、腸球菌的臨床樣本以及淋病病人的生殖道分泌物拭子來源于上海市東方醫(yī)院。

2.1用于檢測泌尿生殖道治病微生物的試劑盒的制備

本發(fā)明所提供的用于檢測泌尿生殖道治病微生物的試劑盒組成如下：

2.1.1恒溫擴(kuò)增緩沖液

恒溫擴(kuò)增緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：12mmdntps、10×isothermalamplification反應(yīng)緩沖液、150mmmgso4水溶液、150μmhnb。

2.1.2恒溫擴(kuò)增酶溶液

恒溫擴(kuò)增酶溶液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：bst酶1u/μl，udg酶0.2u/μl。

2.1.3裝載有引物對的32反應(yīng)池圓盤式微流控芯片

所述32反應(yīng)池圓盤式微流控芯片為上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的，其型號為4x8，示意圖如圖1所示。

所述4x8反應(yīng)池圓盤式微流控芯片的1#至32#反應(yīng)池分別存放上述實施例1的引物對。其中，所述引物對1用于擴(kuò)增人基因組中管家基因hbbmrna，由序列表中序列1-4所示的四條單鏈dna分子組成，包埋于反應(yīng)池5、反應(yīng)池13、反應(yīng)池21以及反應(yīng)池29；所述引物對2用于擴(kuò)增沙眼衣原體，由序列表中序列5-8所示的四條單鏈dna分子組成，包埋于反應(yīng)池1和反應(yīng)池17；所述引物對3用于擴(kuò)增淋球菌，由序列表中序列9-12所示的四條單鏈dna分子組成，包埋于反應(yīng)池2和反應(yīng)池18；所述引物對4用于擴(kuò)增解脲脲原體，由序列表中序列13-16所示的四條單鏈dna分子組成，包埋于反應(yīng)池3和反應(yīng)池19；所述引物對5用于擴(kuò)增人型支原體，由序列表中序列17-20所示的四條單鏈dna分子組成，包埋于反應(yīng)池4和反應(yīng)池20；所述引物對6用于擴(kuò)增生殖支原體，由序列表中序列21-24所示的四條單鏈dna分子組成，包埋于反應(yīng)池9和反應(yīng)池25；所述引物對7用于擴(kuò)增單純皰疹病毒2型，由序列表中序列25-28所示的四條單鏈dna分子組成，包埋于反應(yīng)池10和反應(yīng)池26；所述引物對8用于擴(kuò)增白念珠菌，由序列表中序列29-32所示的四條單鏈dna分子組成，包埋于反應(yīng)池11和反應(yīng)池27；所述引物對9用于擴(kuò)增陰道毛滴蟲，由序列表中序列33-36所示的四條單鏈dna分子組成，包埋于反應(yīng)池12和反應(yīng)池28；所述陰性對照的反應(yīng)池為6-8、反應(yīng)池14-16、反應(yīng)池22-24以及反應(yīng)池30-32，不包埋任何引物。其中，將引物包埋入圓盤式微流控芯片的方法為：將引物與瓊脂糖混合，配制成混合溶液，使所述引物和所述瓊脂糖在所述混合液中的終濃度分別為0.2μm和0.1％(質(zhì)量百分比)；取0.5μl所述混合液點入相應(yīng)的圓盤式微流控芯片反應(yīng)池，于潔凈超凈臺內(nèi)晾干后，沖壓抽真空干燥2小時，備用。

2.2用于檢測性傳播泌尿生殖道治病微生物的試劑盒的使用方法

2.2.1提取基因組

用核酸(dna)提取試劑盒(玻璃珠法)提取沙眼衣原體、淋球菌、解脲脲原體、人型支原體、生殖支原體、單純皰疹病毒2型、白念珠菌、陰道毛滴蟲dna，操作步驟如下：

核酸提取純化準(zhǔn)備

a.加入1ml生理鹽水(保證生理鹽水能沒過無菌拭子取樣部位)，將標(biāo)本管用強(qiáng)力振蕩器(如vortex-genie)高速振蕩2min制成標(biāo)本懸浮液。

b.取出全部懸浮液放入1.5ml離心管中，12000rpm離心2min后棄上清。

核酸提取純化步驟

a.向上述1.5ml離心管中加入0.2ml核酸提取液(使用前一定要振蕩混勻)以及1管提取固形物(盡量將固形物倒凈)，用強(qiáng)力振蕩器高速渦旋振蕩5min。

b.瞬時離心后100℃干浴5min，然后12000rpm離心2min，上清液用于恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增。

2.2.2反應(yīng)體系配制

取288μl恒溫擴(kuò)增緩沖液(見2.1.1)、16μl恒溫擴(kuò)增酶溶液(見2.1.2)、上述每種病原體12μldna組成的96μldna混合體系1混合成400μl反應(yīng)溶液，旋渦震蕩均勻后取80μl反應(yīng)溶液注入4個1x8加樣孔中(2.1.3)，貼封口膜后迅速離心1200rpm/min15s，3200rpm/min30s。

2.2.3恒溫擴(kuò)增反應(yīng)與檢測

將圓盤式微流控芯片置于干燥箱中，設(shè)置37℃反應(yīng)5min，61℃反應(yīng)1h。

2.2.4結(jié)果判斷

結(jié)果見圖2，固定有沙眼衣原體、淋球菌、解脲脲原體、人型支原體、生殖支原體、單純皰疹病毒2型、白念珠菌、陰道毛滴蟲、內(nèi)參的引物組的反應(yīng)池1和17、反應(yīng)池2和18、反應(yīng)池3和19、反應(yīng)池4和20、反應(yīng)池9和25、反應(yīng)池10和26、反應(yīng)池11和27、反應(yīng)池12和28、反應(yīng)池5、13、21和29所對應(yīng)的顏色為天藍(lán)色，不固定引物的反應(yīng)池6-8、反應(yīng)池14-16、反應(yīng)池22-24以及反應(yīng)池30-32所對應(yīng)的顏色為紫羅蘭色。說明混合物dna含有沙眼衣原體、淋球菌、解脲脲原體、人型支原體、生殖支原體、單純皰疹病毒2型、白念珠菌、陰道毛滴蟲dna。

結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測性傳播泌尿生殖道感染相關(guān)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的成套引物和試劑可準(zhǔn)確的檢測沙眼衣原體、淋球菌、解脲脲原體、人型支原體、生殖支原體、單純皰疹病毒2型、白念珠菌和陰道毛滴蟲。

實施例三利用恒溫擴(kuò)增微流控芯片檢測人的生殖道分泌物拭子樣本

3.1采用實施例二中2.1.3的方法，將實施例1中用于檢測沙眼衣原體的引物組、用于檢測淋球菌的引物組、用于檢測解脲脲原體的引物組、用于檢測人型支原體的引物組、用于檢測生殖支原體的引物組、用于檢測單純皰疹病毒2型的引物組、用于檢測白念珠菌的引物組、用于檢測陰道毛滴蟲的引物組、監(jiān)控整個反應(yīng)的內(nèi)參的引物組中的各個引物分別固定在恒溫擴(kuò)增微流控芯片的反應(yīng)池1和17、反應(yīng)池2和18、反應(yīng)池3和19、反應(yīng)池4和20、反應(yīng)池9和25、反應(yīng)池10和26、反應(yīng)池11和27、反應(yīng)池12和28、反應(yīng)池5、13、21和29；不固定引物的反應(yīng)池6-8、反應(yīng)池14-16、反應(yīng)池22-24以及反應(yīng)池30-32，作為陰性對照。

3.2將用核酸(dna)提取試劑(玻璃珠法)(上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品)提取淋病患者的生殖道分泌物樣本中的核酸與恒溫擴(kuò)增體系混勻，然后進(jìn)樣至3.1的恒溫擴(kuò)增微流控芯片中，按照37℃5min，61℃1h進(jìn)行恒溫擴(kuò)增反應(yīng)。

結(jié)果見附圖3，固定有淋球菌和內(nèi)參的引物組的反應(yīng)池2、反應(yīng)池5、反應(yīng)池13、反應(yīng)池18、反應(yīng)池21、反應(yīng)池29所對應(yīng)的反應(yīng)池的顏色為天藍(lán)色，固定沙眼衣原體、解脲脲原體、人型支原體、生殖支原體、單純皰疹病毒2型、白念珠菌、陰道毛滴蟲引物的引物組的反應(yīng)池1、反應(yīng)池3、反應(yīng)池4、反應(yīng)池9、反應(yīng)池10、反應(yīng)池11、反應(yīng)池12、反應(yīng)池17、反應(yīng)池19、反應(yīng)池20、反應(yīng)池25、反應(yīng)池26、反應(yīng)池27、反應(yīng)池28所對應(yīng)的反應(yīng)池的顏色為紫羅蘭色；不固定引物的反應(yīng)池6-8、反應(yīng)池14-16、反應(yīng)池22-24、反應(yīng)池30-32所對應(yīng)的反應(yīng)池的顏色也為紫羅蘭色。說明該人的臨床生殖道分泌物樣本中含有淋球菌，進(jìn)一步說明該淋病患者的生殖道感染淋球菌。

實施例四：檢測恒溫擴(kuò)增微流控芯片的特異性

利用實施例二中2.1制備的恒溫擴(kuò)增微流控芯片進(jìn)行特異性實驗

4.1用核酸(dna)提取試劑盒(玻璃珠法)(上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司)提取普通變形桿菌dna，操作步驟按dna提取試劑盒自帶說明書進(jìn)行，得到普通變形桿菌dna。

按照上述方法，將普通變形桿菌分別替換成人巨細(xì)胞病毒、梅毒、乳酸桿菌、陰道加德納菌、腸球菌，其它步驟均不變，分別得到人巨細(xì)胞病毒dna、梅毒dna、乳酸桿菌dna、陰道加德納菌dna和腸球菌dna。

4.2將普通變形桿菌dna、人巨細(xì)胞病毒dna、梅毒dna、乳酸桿菌dna、陰道加德納菌dna、腸球菌dna、沙眼衣原體dna、淋球菌dna、解脲脲原體dna、人型支原體dna、生殖支原體dna、單純皰疹病毒2型dna、白念珠菌dna、陰道毛滴蟲dna與擴(kuò)增體系混勻，然后進(jìn)樣至步驟2.1.3的恒溫擴(kuò)增微流控芯片中，按照37℃5min，61℃1h進(jìn)行恒溫擴(kuò)增反應(yīng)。

反應(yīng)池中所對應(yīng)的顏色為天藍(lán)色，即為陽性；反應(yīng)池中所對應(yīng)的顏色問紫羅蘭色，即為陰性。檢測結(jié)果見下表2。

表2.lamp特異性檢測

結(jié)果表明本發(fā)明能特異性地檢測沙眼衣原體、淋球菌、解脲脲原體、人型支原體、生殖支原體、單純皰疹病毒2型、白念珠菌、陰道毛滴蟲，而與其他病原微生物無交叉反應(yīng)，如普通變形桿菌、人巨細(xì)胞病毒、梅毒、乳酸桿菌、陰道加德納菌、腸球菌。

實施例五：檢測恒溫擴(kuò)增微流控芯片的靈敏度

利用實施例二中2.1制備的恒溫擴(kuò)增微流控芯片進(jìn)行靈敏度實驗

將實施例二中2.2.2制備的沙眼衣原體dna、淋球菌dna、解脲脲原體dna、人型支原體dna、生殖支原體dna、單純皰疹病毒2型dna、白念珠菌dna、陰道毛滴蟲dna分別稀釋后混合得到混合體系2?；旌象w系2中沙眼衣原體dna、淋球菌dna、解脲脲原體dna、人型支原體dna、生殖支原體dna、單純皰疹病毒2型dna、白念珠菌dna、陰道毛滴蟲dna的濃度均為5×102拷貝/μl，將得到的混合體系2中的dna命名為混合dna2。

將混合dna2與恒溫擴(kuò)增體系混勻，然后進(jìn)樣至步驟3.1的恒溫擴(kuò)增微流控芯片中，按照37℃5min，61℃1h進(jìn)行恒溫擴(kuò)增反應(yīng)。

檢測結(jié)果顯示，固定有檢測沙眼衣原體、檢測淋球菌、檢測解脲脲原體、檢測人型支原體、檢測生殖支原體、檢測單純皰疹病毒2型、檢測白念珠菌、檢測陰道毛滴蟲、檢測內(nèi)參的引物組對應(yīng)的反應(yīng)池的顏色為天藍(lán)色，不固定引物的反應(yīng)池所對應(yīng)的顏色為紫羅蘭色?？梢姡景l(fā)明對沙眼衣原體dna、淋球菌dna、解脲脲原體dna、人型支原體dna、生殖支原體dna、單純皰疹病毒2型dna、白念珠菌dna和陰道毛滴蟲dna的最低檢測限均為5x10²拷貝/μl。

通過上述實施例能夠知曉，本發(fā)明不但提供了一種用于檢測泌尿生殖道致病微生物的lamp引物組合物，還將特異核酸序列與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性強(qiáng)的沙眼衣原體、淋球菌、解脲脲原體、人型支原體、生殖支原體、單純皰疹病毒2型、白念珠菌、陰道毛滴蟲檢測微流控芯片及其檢測方法。本發(fā)明提供的8個引物組能特異性地檢測上述8個致病菌，而且與其他病原微生物無交叉反應(yīng)，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌。同時，本發(fā)明提供的8個引物組對沙眼衣原體dna、淋球菌dna、解脲脲原體dna、人型支原體dna、生殖支原體dna、單純皰疹病毒2型dna、白念珠菌dna、陰道毛滴蟲dna的最低檢測限均為5×10²拷貝/μl。

本發(fā)明提供的檢測性傳播泌尿生殖道相關(guān)致病菌的試劑盒，可快速、準(zhǔn)確地檢測沙眼衣原體、淋球菌、解脲脲原體、人型支原體、生殖支原體、ii型單純皰疹病毒、白念珠菌、陰道毛滴蟲，以彌補(bǔ)針對上述致病菌檢測技術(shù)存在的費(fèi)時耗力的缺陷，擴(kuò)展病原菌檢測范圍，提高檢測靈敏度和特異性，降低勞動強(qiáng)度，縮短檢測周期。本發(fā)明還可以肉眼可視化判定檢測結(jié)果，擺脫昂貴的pcr檢測儀器，使本發(fā)明在科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐中快速簡便、容易普及、安全可靠且適用于現(xiàn)場操作。本發(fā)明的檢測試劑盒還加入了防污染體系，能有效的防止擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。對于臨床而言，能夠在1h內(nèi)獲得8種致病菌指標(biāo)的檢測結(jié)果不僅快于目前較為普遍采用的實時熒光定量pcr方法，而且對于快速輔助指導(dǎo)治療和用藥也具有重要意義。同時，多指標(biāo)的檢測也可以用于地域性的流行病學(xué)調(diào)研和疫情監(jiān)控，以研究性傳播泌尿生殖道感染在中國的流行情況。

以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司

<120>一種用于檢測泌尿生殖道致病微生物的lamp引物組合物及其相關(guān)應(yīng)用

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gctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagctcctgggca120

acgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattcaccccaccagtgcagg180

ctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggctaatgccctggcccacaagtatcactaa239

<210>38

<211>206

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>沙眼衣原體16srrna基因序列

<400>38

gattggccgccaacactgggactgagacactgcccagactcctacgggaggctgcagtcg60

agaatctttcgcaatggacggaagtctgacgaagcgacgccgcgtgtgtgatgaaggctc120

tagggttgtaaagcactttcgcttgggaataagagaagacggttaatacccgctggattt180

gagcgtaccaggtaaagaagcaccgg206

<210>39

<211>217

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<213>artificialsequence

<220>

<223>淋球菌16srrna基因序列

<400>39

acgatcagtagcgggtctgagaggatgatccgccacactgggactgagacacggcccaga60

ctcctacgggaggcagcagtggggaattttggacaatgggcgcaagcctgatccagccat120

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gttgccaatatcggcggccgatgacggtacctgaaga217

<210>40

<211>227

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<220>

<223>解脲脲原體16srrna基因序列

<400>40

cgaaagattagctaataccgaataataacatcaatatcgcatgagaagatgtagaaagtc60

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ggctcaccaagtcaatgacgcgtagctgtactgagaggtagaacagccacaatgggactg180

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<210>41

<211>238

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<220>

<223>人型支原體16srrna基因序列

<400>41

aagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccaaaggcgaaggcagcttactgggtc60

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cacgccgtaaacgatgatcattagtcggtggagaatcactgacgcagctaacgcattaaa180

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<210>42

<211>214

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<220>

<223>生殖支原體的16srrna基因序列

<400>42

gacctgcaagggttcgttatttgatgagggtgcgccatatcagctagttggtagggtaat60

ggcctaccaaggcaatgacgtgtagctatgctgagaagtagaatagccacaatgggactg120

agacacggcccatactcctacgggaggcagcagtagggaatttttcacaatgagcgaaag180

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<210>43

<211>214

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<213>artificialsequence

<220>

<223>hsv-ii基因gg的基因序列

<400>43

gacctgcaagggttcgttatttgatgagggtgcgccatatcagctagttggtagggtaat60

ggcctaccaaggcaatgacgtgtagctatgctgagaagtagaatagccacaatgggactg120

agacacggcccatactcctacgggaggcagcagtagggaatttttcacaatgagcgaaag180

cttgatggagcaatgccgcgtgaacgatgaaggt214

<210>44

<211>204

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>白念珠菌的5.8srdna基因序列

<400>44

atcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatatgaattgcagatattcgtgaatca60

tcgaatctttgaacgcacattgcgccctctggtattccggagggcatgcctgtttgagcg120

tcgtttctccctcaaaccgctgggtttggtgttgagcaatacgacttgggtttgcttgaa180

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<210>45

<211>225

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>陰道毛滴蟲的5.8srdna基因序列

<400>45

ttggtactgtggataggggtacggttttccaccgtaccgaaacctagcagagggccagtc60

tggtgccagcagctgcggtaattccagctctgcgagtttgctcccatattgttgcagtta120

aaacgcccgtagtctgaattggccagcaatggtcgtacgtatttttacgttcactgtgaa180

caaatcaggacgcttagagtatggctacatgaatgactcagcgca225