本發(fā)明屬于核酸擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測感染性腹瀉病原體的引物組合物，以及基于微流控芯片系統(tǒng)的檢測感染性腹瀉病原體的試劑盒及其方法。

背景技術(shù)：

感染性腹瀉是全球最常見的一類疾病，每年全世界估計(jì)有320萬≤5歲的兒童死于腹瀉，占同齡兒童死因的24.8％；在發(fā)展中國家，每年每兒童患病1-12次，發(fā)達(dá)國家，每年每兒童患病1-5次，由此可見，感染性腹瀉仍是當(dāng)前一類重要的疾病。感染性腹瀉是指各種急性、慢性的細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲感染引起腸道炎癥所致的腹瀉。我們也把除霍亂、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉，稱為感染性腹瀉，是《中華人民共和國傳染病防治法》中規(guī)定的丙類傳染病。

感染性腹瀉的病原體有細(xì)菌、病毒、寄生蟲、真菌等。目前，在我國主要以細(xì)菌和病毒為主，病毒類有輪狀病毒、諾如病毒、腺病毒和柯薩奇病毒等，細(xì)菌類主要為沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌等；具文獻(xiàn)報(bào)告，病毒性感染占感染性腹瀉90％左右，細(xì)菌占10％左右；病毒中有95％以上為輪狀病毒和(或)腺病毒、諾如病毒引起，細(xì)菌以沙門氏菌、空腸彎曲菌和志賀氏菌為主，占90％以上。感染性腹瀉是我國臨床上最常見的疾病之一，重癥患者若不能及時、正確用藥，容易危及生命。然而，臨床常規(guī)的生化指標(biāo)分析無法對患者所感染的病原體做出準(zhǔn)確鑒定，大多數(shù)臨床治療仍處于經(jīng)驗(yàn)用藥階段，在使用高級抗生素方面存在較大的盲目性。目前臨床上流行使用的鑒定病原體的方法主要是依靠細(xì)菌培養(yǎng)檢測法，但是細(xì)菌培養(yǎng)檢測法存在較大的缺陷：檢測時間長(一般2-3天左右)、準(zhǔn)確率低(假陰性率和假陽性率都較高)、難以檢測出難培養(yǎng)的病原體等。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loopmediatedisothermalamplification，以下簡稱lamp法)lamp是2000年開發(fā)的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換dna聚合酶在等溫條件(60-65℃)保溫30-60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。lamp具有簡便、快速、靈敏、特異的優(yōu)勢，尤其適合在基層開展lamp試劑盒的應(yīng)用推廣。lamp技術(shù)中，引物是決定檢測結(jié)果靈敏度和特異性的關(guān)鍵因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種用于檢測感染性腹瀉病原體的引物組合物及其試劑盒，以用于快速準(zhǔn)確地鑒定感染性腹瀉病原體的種類。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測感染性腹瀉病原體的引物組合物，其包括包括輪狀病毒引物組、腸道腺病毒引物組、諾如病毒引物組、沙門氏菌引物組、志賀氏菌引物組和空腸彎曲菌引物組中的至少一組；

其中，所述輪狀病毒引物組包括seqidno：1所示的輪狀病毒引物f3、seqidno：2所示的輪狀病毒引物b3、seqidno：3所示的輪狀病毒引物fip和seqidno：4所示的輪狀病毒引物bip；

其中，所述腸道腺病毒引物組包括seqidno：5所示的腸道腺病毒引物f3、seqidno：6所示的腸道腺病毒引物b3、seqidno：7所示的腸道腺病毒引物fip和seqidno：8所示的腸道腺病毒引物bip；

其中，所述諾如病毒引物組包括seqidno：9所示的諾如病毒引物f3、seqidno：10所示的諾如病毒引物b3、seqidno：11所示的諾如病毒引物fip和seqidno：12所示的諾如病毒引物bip

其中，所述沙門氏菌引物組包括seqidno：13所示的沙門氏菌引物f3、seqidno：14所示的沙門氏菌引物b3、seqidno：15所示的沙門氏菌引物fip和seqidno：16所示的沙門氏菌引物bip；

其中，所述志賀氏菌引物組包括seqidno：17所示的志賀氏菌引物f3、seqidno：18所示的志賀氏菌引物b3、seqidno：19所示的志賀氏菌引物fip和seqidno：20所示的志賀氏菌引物bip；

其中，所述空腸彎曲菌引物組包括seqidno：21所示的空腸彎曲菌引物f3、seqidno：22所示的空腸彎曲菌引物b3、seqidno：23所示的空腸彎曲菌引物fip和seqidno：24所示的空腸彎曲菌引物bip。

為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：

優(yōu)選地，該引物組合物進(jìn)一步包括內(nèi)對照引物組，所述內(nèi)對照引物組用于擴(kuò)增人血紅蛋白-β鏈(hemoglobinbeta-chain，hbb)；

其中，所述內(nèi)對照引物組包括seqidno：25所示的內(nèi)對照引物f3、seqidno：26所示的內(nèi)對照引物b3、seqidno：27所示的內(nèi)對照引物fip和seqidno：28所示的內(nèi)對照引物bip。

上述感染性腹瀉病原體引物組的引物序列及內(nèi)對照引物組的序列如表1所示。

表1擴(kuò)增引物序列表

另一方面，本發(fā)明提供一種含有上述引物組合的試劑盒，其還包括微流控芯片，所述微流控芯片設(shè)有互不連通的4個反應(yīng)檢測區(qū)，每一反應(yīng)檢測區(qū)均包括依次連通的進(jìn)樣池、分配池、毛細(xì)管微閥和擴(kuò)增池，每個反應(yīng)檢測區(qū)具有8個擴(kuò)增池，所述引物組合物中的每一引物組分別包被于對應(yīng)的擴(kuò)增池中。

為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：

優(yōu)選地，所述微流控芯片為圓盤形微流控芯片。

優(yōu)選地，在每一擴(kuò)增池中，每一引物組中引物f3的濃度為1～4μm，引物b3的濃度為1～4μm，引物fip的濃度為8～15μm，引物bip的濃度為8～15μm。

優(yōu)選地，所述試劑盒進(jìn)一步包括恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液、陰性對照物。

優(yōu)選地，所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液包括200～250mmtris-hcl、300～400mmkcl、8～10mmdntp、100～120mmmgso4、1％～5％(w/v)tween-20、40％～50％(w/v)甘油、1～5％(w/v)peg8000和10～20mm指示劑；所述恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液包括10～12u/μldna聚合酶和20～30u/μl逆轉(zhuǎn)錄酶。

優(yōu)選地，所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液包括250mmtris-hcl、300mmkcl、10mmdntp、100mmmgso4、5％(w/v)tween-20、50％(w/v)甘油、5％(w/v)peg8000和10mm指示劑。

優(yōu)選地，所述指示劑包括hnb、calcein、甲酚紅、酚紅、間甲酚紫、溴甲酚紫、中性紅、萘酚酞、百里酚藍(lán)。

優(yōu)選地，所述指示劑為中性紅，濃度為10～20mm，更優(yōu)選為10mm。中性紅(neutralred)，學(xué)名“3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪鹽酸鹽”，是一種弱堿性ph指示劑，變色范圍ph6.4～8.0之間(由紅變黃)，酸性條件下為紅色，堿性條件下為黃色；恒溫?cái)U(kuò)增發(fā)生反應(yīng)前，由于反應(yīng)液呈堿性，因此顏色為黃色，當(dāng)有擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生時，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的不斷積累，溶液ph環(huán)境變?yōu)樗嵝?，因此顏色會由黃色變?yōu)榧t色。

優(yōu)選地，所述dna聚合酶為bstdna聚合酶，所述逆轉(zhuǎn)錄酶為m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶；更優(yōu)選為濃度為10u/μl的bstdna聚合酶和濃度為20u/μl的m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶。

優(yōu)選地，所述陰性對照物為無rna酶的水。

最后，本發(fā)明還提供一種采用上述引物組合物來檢測感染性腹瀉病原體的用于非診斷目的的方法，其包括如下步驟：

步驟1)引物組合物的包被：將所述引物組合物中的每一引物組分別包被在相應(yīng)的擴(kuò)增池內(nèi)，經(jīng)過真空干燥固定在擴(kuò)增池中；

步驟2)待檢樣品核酸提?。翰捎么胖榉ㄌ崛〈龣z樣品的核酸；

步驟3)lamp反應(yīng)：取恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液和dna聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶溶液，與待檢樣品的核酸混合好后，轉(zhuǎn)移至包被引物組的微流控芯片的進(jìn)樣池，液體在離心力作用下流入擴(kuò)增池內(nèi)，然后進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；

步驟4)結(jié)果判讀：根據(jù)擴(kuò)增結(jié)束后擴(kuò)增池中的顏色變化進(jìn)行直接肉眼判讀或者采用設(shè)備進(jìn)行顏色判讀。

優(yōu)選地，步驟1)所述的引物組合物的包被的具體步驟如下：將所述引物組合物的每一引物組分別與蔗糖混合，配制成相應(yīng)的混合溶液，所述引物組和蔗糖在所述混合溶液中的終濃度分別為0.15μm和1.0％(質(zhì)量百分比)；取1μl混合溶液點(diǎn)入微流控芯片相應(yīng)的擴(kuò)增池內(nèi)，于37℃烘箱內(nèi)干燥，壓片封膜，沖壓抽真空后，引物組被包被于相應(yīng)的擴(kuò)增池中；更具體地說，所述微流控芯片中每一反應(yīng)檢測區(qū)的8個擴(kuò)增池分別包被如下引物組：輪狀病毒lmap引物組、腸道腺病毒lamp引物組、諾如病毒lamp引物組、沙門氏菌lamp引物組、志賀氏菌lamp引物組、空腸彎曲菌lamp引物組、陰性對照品、內(nèi)對照引物組。

優(yōu)選地，步驟3)所述的lamp反應(yīng)的具體步驟如下：取25μl恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液和10μldna聚合酶、10μl逆轉(zhuǎn)錄酶溶液，與40μl待檢樣品的核酸混合好后，轉(zhuǎn)移至包被引物組微流控芯片的進(jìn)樣池，在所述離心機(jī)中，液體在離心力作用下流入擴(kuò)增池內(nèi)，在50°℃恒溫反應(yīng)10分鐘，在60～63℃恒溫反應(yīng)50分鐘；其中恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液和dna聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶溶液均采用上述試劑盒中的試劑。

優(yōu)選地，步驟4)所述的直接肉眼判讀具體如下：若顏色發(fā)生變化，則所述待檢樣本中含有感染性腹瀉病原體基因組核酸；若顏色未發(fā)生變化，則所述待檢樣本中不含有感染性腹瀉病原體基因組核酸。

優(yōu)選地，所述待測樣本包括糞便；相應(yīng)的，所述待測樣本核酸包括從糞便中提取的dna或rna。

本發(fā)明所述引物組或引物組組合物或試劑盒在檢測或輔助檢測感染性腹瀉病原體中的非診斷目的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

在本發(fā)明中，所述感染性腹瀉病原體可為如下中的至少一種：輪狀病毒、腸道腺病毒、諾如病毒、沙門氏菌、志賀氏菌和空腸彎曲菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供的試劑盒提供高通量的檢測方法，可快速、準(zhǔn)確地檢測常見感染性腹瀉病原體感染，對于臨床而言，能夠在1小時內(nèi)獲得6種病原體指標(biāo)的檢測結(jié)果，不僅快于目前較為普遍采用的實(shí)時熒光定量pcr方法，而且對于快速輔助指導(dǎo)治療和用藥也具有重要意義；同時，多指標(biāo)的檢測也可以用于地域性的流行病學(xué)調(diào)研和疫情監(jiān)控，以研究感染性腹瀉在中國的流行情況。

附圖說明

圖1為本發(fā)明采用的微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2和圖3為本發(fā)明一實(shí)施例的微流控芯片中引物組的包被示意圖；

圖4和圖5為6種感染性腹瀉病原體樣品的微流控芯片的檢測結(jié)果圖；

圖中附圖標(biāo)記為：

11、反應(yīng)檢測區(qū)；12、進(jìn)樣池；13、分配池；14、擴(kuò)增池；15、毛細(xì)管微閥。

a～h：反應(yīng)檢測區(qū)；1～8：包被引物組的擴(kuò)增池。

在下文中，反應(yīng)檢測區(qū)a的擴(kuò)增池1以a-1表示，反應(yīng)檢測區(qū)a的擴(kuò)增池2以a-2表示，依次類推。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種用于檢測感染性腹瀉病原體的引物組合物及其試劑盒和檢測方法，其中所述感染性腹瀉病原體包括輪狀病毒、腸道腺病毒、諾如病毒、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌中的至少一種，所述引物組合物包括上述感染性腹瀉病原體對應(yīng)的引物組中的至少一組。

本發(fā)明采用的輪狀病毒、腸道腺病毒、諾如病毒、腸道病毒ev71、腸道病毒ca16、腺病毒3型為臨床樣本，取自上海復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院；沙門氏菌來源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心(cmcc)，菌株號為cmcc50115；志賀氏菌來源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心(cmcc)，菌株號為cmcc51592；空腸彎曲菌來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(cicc)，菌株號為cicc22936；霍亂弧菌來源于美國模式培養(yǎng)物保藏所(atcc)，菌株號為atcc27070；溶藻弧菌來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(cicc)，菌株號為cicc21664；大腸埃希氏菌來源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心(cmcc)，菌株號為cmcc44103；本發(fā)明采用的內(nèi)對照為含hbb目的擴(kuò)增片段的假病毒。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例一

本實(shí)施例描述了本發(fā)明所采用的微流控芯片。

如圖1所示，本發(fā)明采用的微流控芯片為圓盤形微流控芯片，其包括4個反應(yīng)檢測區(qū)11，每一反應(yīng)檢測區(qū)11包括依次連通的進(jìn)樣池12、分配池13、毛細(xì)管微閥15和擴(kuò)增池16，進(jìn)樣池12通過一弧形通道與分配池13連通，進(jìn)樣池中設(shè)有進(jìn)樣孔，分配池13通過一弧形通道與廢液池和排氣孔連通；每一反應(yīng)檢測區(qū)11均設(shè)有8個擴(kuò)增池16。

其中進(jìn)樣池12的主要功能為裝載反應(yīng)液；分配池13的主要作用為均勻分配反應(yīng)液至擴(kuò)增池中；擴(kuò)增池15具體實(shí)現(xiàn)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(lamp)；毛細(xì)管微閥14主要利用毛細(xì)管對液體的阻滯作用，來控制微流控芯片中流體的運(yùn)動。

如圖2～3所示，本發(fā)明采用2個微流控芯片，進(jìn)行感染性腹瀉病原體的檢測。a為含有輪狀病毒核酸的反應(yīng)檢測區(qū)；b為含有腸道腺病毒核酸的反應(yīng)檢測區(qū)；c為含有諾如病毒核酸的反應(yīng)檢測區(qū)；d為含有沙門氏菌核酸的反應(yīng)檢測區(qū)；e為含有志賀氏菌核酸的反應(yīng)檢測區(qū)；f為含有空腸彎曲菌核酸的反應(yīng)檢測區(qū)；g為含有六種病原體核酸的反應(yīng)檢測區(qū)；h為陰性樣本核酸的反應(yīng)檢測區(qū)；在上述反應(yīng)檢測區(qū)a～h中的擴(kuò)增池1、2、3、4、5、6、8中分別包被輪狀病毒引物組、腸道腺病毒引物組、諾如病毒引物組、沙門氏菌引物組、志賀氏菌引物組、空腸彎曲菌引物組、內(nèi)對照引物組；在上述反應(yīng)檢測區(qū)a～f中的擴(kuò)增池7中均存放無rna酶水的陰性對照。

實(shí)施例二

本實(shí)施例為本發(fā)明所采用的用于檢測感染性腹瀉病原體的引物組合物及其試劑盒。

本發(fā)明所述的引物組合物包括獨(dú)立包裝的6個引物組中至少一個。所述感染性腹瀉病原體包括下述六種病原體中的至少一種：輪狀病毒、腸道腺病毒、諾如病毒、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌。上述病原體對應(yīng)的6個引物組分別為輪狀病毒引物組、腸道腺病毒引物組、諾如病毒引物組、沙門氏菌引物組、志賀氏菌引物組和空腸彎曲菌引物組，該引物組合還包括包括內(nèi)對照引物組，所述內(nèi)對照引物組用于擴(kuò)增人血紅蛋白-β鏈。上述其各引物組的各引物序列詳見表1。

本發(fā)明涉及一種含有上述引物組合物的試劑盒，其還包括如實(shí)施例一所述的包被上述引物組的微流控芯片、恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液和陰性對照物。在包被引物組的微流控芯片中，每個引物組中的4種引物的摩爾比如下：3μm名稱中帶“f3”的引物，3μm名稱中帶“b3”的引物，12μm名稱中帶“fip”的引物，12μm名稱中帶“bip”的引物。試劑盒中的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的體積為25μl，含有0.5μl250mmoltris-hcl、0.5μl300mmolkcl、15μl10mmdntp、0.5μl120mmmgso4、0.25μl1％(w/v)tween-20、0.5μl50％(w/v)甘油和0.25μl1％(w/v)peg8000、1.0μl10mm中性紅，用無rna酶水補(bǔ)足25μl。試劑盒中的恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液包括10μl10u/μldna聚合酶、10μl20u/μl逆轉(zhuǎn)錄酶溶液。

上述bstdna聚合酶為neb公司產(chǎn)品，tris-hcl、kcl、mgso4、tween-20、甘油、peg8000、中性紅為sigma公司產(chǎn)品，dntp為takara公司產(chǎn)品，m-mlv反轉(zhuǎn)錄酶為promega公司產(chǎn)品。

實(shí)施例三

本實(shí)施例為采用實(shí)施二所述的引物組合物和試劑盒進(jìn)行檢測感染性腹瀉病原體的方法，其包括如下步驟：

1.引物組合物的包被；

如圖2和圖3所示，將輪狀病毒引物組、腸道腺病毒引物組、諾如病毒引物組、沙門氏菌引物組、志賀氏菌引物組、空腸彎曲菌引物組、內(nèi)對照引物組分別與蔗糖混合，配制成相應(yīng)的混合溶液，各引物組和蔗糖在所述混合溶液中的終濃度分別為0.15μm和1.0％(質(zhì)量百分比)；取1μl混合溶液點(diǎn)入微流控芯片相應(yīng)的擴(kuò)增池(擴(kuò)增池1、2、3、4、5、6、8)內(nèi)，擴(kuò)增池7存放無rna酶水，將微流控芯片于37℃烘箱內(nèi)干燥，壓片封膜，沖壓抽真空后，引物組被包被于各擴(kuò)增池。

2.待檢樣品核酸提?。翰捎么胖榉ㄌ崛〈龣z樣品的核酸；

用核酸提取試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)提取輪狀病毒、腸道腺病毒、諾如病毒、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌，操作步驟按核酸提取試劑盒自帶說明書進(jìn)行，得到輪狀病毒、腸道腺病毒、諾如病毒、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌核酸樣品；

將上述得到的輪狀病毒、腸道腺病毒、諾如病毒、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌核酸按1：1：1：1：1：1比例混合，得到多重陽性核酸樣品；

用核酸提取試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)提取腸道病毒ev71、腸道病毒ca16、腺病毒3型、霍亂弧菌、溶藻弧菌、大腸埃希氏菌，操作步驟按核酸提取試劑盒自帶說明書進(jìn)行，將腸道病毒ev71、腸道病毒ca16、腺病毒3型、霍亂弧菌、溶藻弧菌、大腸埃希氏菌核酸按1：1：1：1：1：1比例混合，得到陰性核酸樣品；

用核酸提取試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)提取內(nèi)對照核酸；

上述得到的陽性核酸樣品濃度均為10³拷貝/μl，陰性核酸樣品濃度為10⁶拷貝/μl，內(nèi)對照核酸濃度為10⁴td/μl。

3.lamp反應(yīng)

取25μl恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液和20μl所述恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液，與30μl輪狀病毒核酸和10μl內(nèi)對照核酸樣品混合，注射入圓盤微流控芯片的反應(yīng)檢測區(qū)a的進(jìn)樣池中；

取25μl恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液和20μl所述恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液，與30μl腸道腺病毒核酸和10μl內(nèi)對照核酸樣品混合，注射入圓盤微流控芯片的反應(yīng)檢測區(qū)b的進(jìn)樣池中；

取25μl恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液和20μl所述恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液，與30μl副溶血性弧菌核酸和10μl內(nèi)對照核酸樣品混合，注射入圓盤微流控芯片的反應(yīng)檢測區(qū)c的進(jìn)樣池中；

取25μl恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液和20μl所述恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液，與30μl沙門氏菌核酸和10μl內(nèi)對照核酸樣品混合，注射入圓盤微流控芯片的反應(yīng)檢測區(qū)d的進(jìn)樣池中；

取25μl恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液和20μl所述恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液，與30μl志賀氏菌核酸和10μl內(nèi)對照核酸樣品混合，注射入圓盤微流控芯片的反應(yīng)檢測區(qū)e的進(jìn)樣池中；

取25μl恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液和20μl所述恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液，與30μl空腸彎曲菌核酸和10μl內(nèi)對照核酸樣品混合，注射入圓盤微流控芯片的反應(yīng)檢測區(qū)f的進(jìn)樣池中；

取25μl恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液和20μl所述恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液，與30μl多重陽性核酸和10μl內(nèi)對照核酸樣品混合，注射入圓盤微流控芯片的反應(yīng)檢測區(qū)g的進(jìn)樣池中；

取25μl恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液和20μl所述恒溫?cái)U(kuò)增酶溶液，與30μl混合陰性樣品核酸和10μl內(nèi)對照核酸樣品混合，注射入圓盤微流控芯片的反應(yīng)檢測區(qū)h的進(jìn)樣池中；

將上述微流控芯片的進(jìn)樣池貼膜封閉，置于離心機(jī)中，3000rpm離心1min；50℃恒溫箱反應(yīng)10min；63℃恒溫箱反應(yīng)50min。

4.結(jié)果判讀；

如圖4和圖5所示，其lamp反應(yīng)結(jié)果如下：包埋有輪狀病毒引物組、注射入輪狀病毒核酸樣品的擴(kuò)增池a-1和g-1顏色為粉紅色，說明a-1和g-1兩個擴(kuò)增池中含有輪狀病毒核酸且發(fā)生恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；包埋有腸道腺病毒引物組、注射入腸道腺病毒核酸樣品的擴(kuò)增池b-2和g-2顏色為粉紅色，說明b-2和g-2兩個擴(kuò)增池中含有腸道腺病毒核酸，且發(fā)生恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；包埋有諾如病毒引物組、注射入諾如病毒核酸樣品的擴(kuò)增池c-3和g-3顏色為粉紅色，說明c-3和g-3兩個擴(kuò)增池中含有諾如病毒核酸且發(fā)生恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；包埋有沙門氏菌引物組、注射入沙門氏菌核酸樣品的擴(kuò)增池d-4和g-4顏色為粉紅色，說明d-4和g-4兩個擴(kuò)增池中含有沙門氏菌核酸且發(fā)生恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；包埋有志賀氏菌引物組、注射入志賀氏菌核酸樣品的擴(kuò)增池e-5和g-5顏色為粉紅色，說明e-5和g-5兩個擴(kuò)增池中含有志賀氏菌核酸且發(fā)生恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；包埋有空腸彎曲菌引物組、注射入空腸彎曲菌核酸樣品的擴(kuò)增池f-6和g-6顏色為粉紅色，說明f-6和g-6兩個擴(kuò)增池中含有空腸彎曲菌核酸且發(fā)生恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；包埋有內(nèi)對照引物組、注射入內(nèi)對照核酸的擴(kuò)增池a-8、b-8、c-8、d-8、e-8、f-8、g-8、h-8顏色為粉紅色，說明a-8、b-8、c-8、d-8、e-8、f-8、g-8、h-8八個擴(kuò)增池中含有內(nèi)對照的核酸且發(fā)生恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；而其他擴(kuò)增池顏色均為淡黃色，說明沒有發(fā)生恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。

也可采用相關(guān)設(shè)備進(jìn)行微流控芯片擴(kuò)增池中的顏色判讀。

上述結(jié)果表明，本發(fā)明所述的檢測感染性腹瀉的試劑盒及其使用方法能夠準(zhǔn)確的檢測在1小時內(nèi)獲得輪狀病毒、腸道腺病毒、諾如病毒、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌6種病原體指標(biāo)的檢測結(jié)果，有效提高了檢測效率，。

以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對該實(shí)用進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司

<120>一種檢測感染性腹瀉病原體的引物組合物及其試劑盒

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