本發(fā)明涉及一種調(diào)控葉片發(fā)育的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因及其應(yīng)用，尤其涉及一種調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因ptgrf1/2d及其應(yīng)用，屬于植物基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

葉片作為植物光合作用的主要器官，是植物的“綠色工廠”，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用。已有研究表明生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子(growth-regulatingfactor,grf)參與植物葉片的發(fā)育。grf作為一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控并發(fā)揮重要作用。大多數(shù)grf是mir396的靶基因，與mir396一起參與多種植物生長(zhǎng)發(fā)育過程，包括葉片的生長(zhǎng)發(fā)育。在葉片發(fā)育過程中，grf通過細(xì)胞周期途徑調(diào)控細(xì)胞分裂和/或細(xì)胞擴(kuò)展作用于細(xì)胞數(shù)目和/或細(xì)胞大小。另外，grf還通過與互作因子grf-interact-ingfactor(gif)的互作與葉片生長(zhǎng)發(fā)育過程密切關(guān)聯(lián)，進(jìn)而調(diào)控葉片發(fā)育過程中細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)展的轉(zhuǎn)變。而不同的grf基因在葉片分裂區(qū)與擴(kuò)展區(qū)存在差異表達(dá)的模式可能是它們影響葉片細(xì)胞分裂和/或擴(kuò)展的基礎(chǔ)。

楊樹作為在世界范圍分布廣泛的一種經(jīng)濟(jì)樹種，不僅是重要的木材原材料，也被認(rèn)為是一種重要的能源植物，具有早期速生、易雜交改良和繁殖、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于速生材栽培。另外，楊樹作為研究樹木生長(zhǎng)發(fā)育的模式樹種，還具有連年生長(zhǎng)及碳分配等特性，因此了解grf在木本植物器官發(fā)育中的作用有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

目前，grf的功能在木本植物研究甚少。分離調(diào)控葉片生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵grf基因，利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)鑒定其功能，通過遺傳改良促進(jìn)葉片生長(zhǎng)發(fā)育，獲取大葉木本植物，不僅對(duì)林木生長(zhǎng)發(fā)育研究有重要理論意義，而且在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和觀賞園藝生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的之一是提供一種調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因ptgrf1/2d。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

一種調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因ptgrf1/2d，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示(加粗單下劃線序列為mir396調(diào)控位點(diǎn))。

一種調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因ptgrf1/2d的不受mir396調(diào)控的突變形式mptgrf1/2d，其核苷酸序列如序列表中的序列2所示(雙下劃線序列為已突變的mir396調(diào)控位點(diǎn))。

本發(fā)明的另一目的是提供一種調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因ptgrf1/2d的表達(dá)蛋白。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案達(dá)到的：

一種調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因ptgrf1/2d的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列3所示。

一種含有調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因ptgrf1/2d的載體pmdc32-mptgrf1/2d，所述載體在ptgrf1/2d基因的5’端組裝組成型強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子p35s；在ptgrf1/2d基因的3’端組裝有強(qiáng)終止子nos。

一種由上述載體組裝的hpt基因可作為轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選標(biāo)記，用潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選，所述的載體上組裝有l(wèi)b序列和rb序列，lb序列和rb序列能促使組裝于其間的ptgrf1/2d基因整合至楊樹受體細(xì)胞染色體中。

一種調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因ptgrf1/2d的表達(dá)蛋白。

本發(fā)明的再一目的是提供一種調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因ptgrf1/2d的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案達(dá)到的：

一種調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因ptgrf1/2d在調(diào)控楊樹生長(zhǎng)發(fā)育過程中的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以銀腺楊(populusalba×p.glandulosa)為材料，克隆了ptgrf1/2d基因，并對(duì)其mir396靶位點(diǎn)核苷酸進(jìn)行6個(gè)堿基的同義突變，獲得突變形式的ptgrf1/2d(mptgrf1/2d，序列2)，通過將mptgrf1/2d基因轉(zhuǎn)入銀腺楊，過量表達(dá)mptgrf1/2d的轉(zhuǎn)基因楊樹與對(duì)照植株比較，葉片明顯變大，說明ptgrf1/2d基因是調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因，在林木基因工程領(lǐng)域有重要應(yīng)用價(jià)值。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但并不意味著對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

附圖說明

圖1是本發(fā)明植物表達(dá)載體pmdc32-mptgrf1/2d的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2-1是未轉(zhuǎn)基因銀腺楊與本發(fā)明過量表達(dá)mptgrf1/2d的轉(zhuǎn)基因銀腺楊的植株比較圖。

圖2-2是未轉(zhuǎn)基因銀腺楊與本發(fā)明過量表達(dá)mptgrf1/2d的轉(zhuǎn)基因銀腺楊的葉片比較圖。

圖3是本發(fā)明過量表達(dá)mptgrf1/2d的轉(zhuǎn)基因楊樹的轉(zhuǎn)錄水平定量檢測(cè)圖。

圖4是本發(fā)明測(cè)量的過量表達(dá)mptgrf1/2d的轉(zhuǎn)基因楊樹的葉面積圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中未進(jìn)行詳細(xì)說明的操作可參照分子克隆，相關(guān)試劑盒使用說明的操作實(shí)現(xiàn)。

實(shí)施例1克隆ptgrf1/2d基因

以銀腺楊為材料，使用rneasyplantmini試劑盒和rnase-freednasei試劑盒(qiagen，hilden，germany)提取扦插30天的銀腺楊組培苗總rna。每個(gè)樣品取約3.0μgrna，通過使用superscriptiiifirst-strandsynthesissystem(lifetechnologies，carlsbad，ca，usa)合成cdna第一鏈。參考已發(fā)表的毛果楊基因組序列，使用oligo軟件設(shè)計(jì)引物(擴(kuò)增子包含起始密碼子及終止密碼子)，進(jìn)行編碼區(qū)擴(kuò)增(引物中引入gateway接頭)。

其中，ptgrf1/2dcds正向引物為(如序列表中序列4)：

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatatggattttggggttcag，

ptgrf1/2dcds反向引物為(如序列表中序列5)：

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtattacatggcaggcaatgaa

ptgrf1/2dcds正向突變引物為(如序列表中序列6)：

ccgccatcgttctaggaaaccagtcgagggccaatcaggccattccg

ptgrf1/2dcds反向突變引物為(如序列表中序列7)：

ttggccctcgactggtttcctagaacgatggcggcccctgttcat

高保真pcr反應(yīng)體系如下：toyobo高保真擴(kuò)增酶kodplus1μl，正向引物(10μm)0.8μl，反向引物(10μm)0.8μl，模板(銀腺楊cdna)1μl，無菌ddh2o補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃，5min；94℃，30s；56℃，30s；68℃，2min，35個(gè)循環(huán)；68℃，10min。

最終獲得基因全長(zhǎng)cdna序列為1830bp，命名為ptgrf1/2d基因，序列如序列表中序列1所示。

ptgrf1/2d序列(加粗單下劃線序列為mir396調(diào)控位點(diǎn))：

atggattttggggttcaggtgggtttggatgggttggtgggttcagacacaagtaatagtggttttgcttctcttgctagctcagatcctgaagcaaagcagaagttgtacggatctgggttcttgaagcaagagagacctggcaacatcgatggtgattggaggagctctaaattgtccaaaactgagtcaatgctgcttgagcagagtaacacttcacttctgaaatctaactccaactttctcttcgctgatggacagcagcagcagcagcagatgctcagcttctcctatcccagatcagctccttcagcggaaagaagctcccaaaatggcacattgccgtactttcacctcacatcttctgctcataatagaaatacaggctacagctctggtatctacaatgctgccagcatgcatggggttttgaccgagaccagatggccattcactcaatcacaatggatggagcttgaacatcaggccttgatctacaagtatatagcagcaaatgtgcctataccatctaatctgctcattcccattagaaaagctcttgattctgctgggtttcctagcttttctgctggatttttcagacccaatacaatgccatggggtgctttccatatgggtttctccagcaacactgatccggagccaggacggtgtcgaaggacagatgggaagaaatggcggtgctcaagagatgcagttgccgatcagaagtattgtgagcggcatatgaacaggggccgccatcgtggccaatcaggccattccgctgcagccgccaccactgtaaagccagccaatggcacttcgtcttctacatcatcatcagtggtggggcttcgcagcactgtgtccgacagcctcactattgctcataatcagcagcaagcaacgagtccatctaatctttctgcctccaatacgctcagcaggatgttccttactaaagagaatgtaggtgagagaacgcaggatgcgacagccttgtccatgcttcgatccaccatggaccttaaatcgaaagaaactccattcgtcatatcaaaacagcagaactcatatggggaatccttacgaaatgagtttggacttgtcacctccgattccctcctcaatcactcacagaaaagctcatccttaatgagttgcagaaattttggatcgtctcaggacctcactaaccaggaatctgtttcacagcactccctccgccaattcatggatgattggcctaaaagtcagtctgatcgttctgctgtttcttggcctgaacttgatcagcaatctgagagaacccagctatcgatttcaatccccatggctcctgcagacttcatgtcatctacttcctccccaaacaatgaaaaagtcactctctccccattgagattatcacgagaatttgatccaatacagatgggactgggagtgggaggtggaggtggtagtattgccaacgaaccaaaccagaggcaagccaactggattcccatttcttggggaacatcaatgggtggtccgctcggggaggtcttgcacaacaccaataacaatgcagcagcagagtgcaagaccacgtcatcgctgaacctgatgacctatagatgggacaacagtcctcgtataggttcatctccaactggggttttacaaaagtcagcgtttgcttccctttcaaatagcagtgcgggaagcagcccaagagcagagaacaggaccaatgaaggtggcagtctctgcaatgacctccttggatcaactattgtgcattcttcttcattgcctgccatgtaa

實(shí)施例2mptgrf1/2d基因的獲得

在mir396調(diào)控區(qū)待突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)一條特異突變的正向突變上游引物及與該正向突變上游引物互補(bǔ)的反向突變下游引物，以ptgrf1/2d基因?yàn)槟０澹詐tgrf1/2dcds正向引物與反向突變下游引物組成的引物對(duì)及正向突變上游引物與ptgrf1/2dcds反向引物組成的引物對(duì)分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將得到的pcr產(chǎn)物凝膠回收并等量混合用作模板，再以ptgrf1/2dcds正向和反向引物組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測(cè)序，最終得到mptgrf1/2d基因，序列如序列表中序列2所示。

mptgrf1/2d序列(雙下劃線序列為已突變的mir396調(diào)控位點(diǎn))：atggattttggggttcaggtgggtttggatgggttggtgggttcagacacaagtaatagtggttttgcttctcttgctagctcagatcctgaagcaaagcagaagttgtacggatctgggttcttgaagcaagagagacctggcaacatcgatggtgattggaggagctctaaattgtccaaaactgagtcaatgctgcttgagcagagtaacacttcacttctgaaatctaactccaactttctcttcgctgatggacagcagcagcagcagcagatgctcagcttctcctatcccagatcagctccttcagcggaaagaagctcccaaaatggcacattgccgtactttcacctcacatcttctgctcataatagaaatacaggctacagctctggtatctacaatgctgccagcatgcatggggttttgaccgagaccagatggccattcactcaatcacaatggatggagcttgaacatcaggccttgatctacaagtatatagcagcaaatgtgcctataccatctaatctgctcattcccattagaaaagctcttgattctgctgggtttcctagcttttctgctggatttttcagacccaatacaatgccatggggtgctttccatatgggtttctccagcaacactgatccggagccaggacggtgtcgaaggacagatgggaagaaatggcggtgctcaagagatgcagttgccgatcagaagtattgtgagcggcatatgaacaggggccgccatcgtggccaatcaggccattccgctgcagccgccaccactgtaaagccagccaatggcacttcgtcttctacatcatcatcagtggtggggcttcgcagcactgtgtccgacagcctcactattgctcataatcagcagcaagcaacgagtccatctaatctttctgcctccaatacgctcagcaggatgttccttactaaagagaatgtaggtgagagaacgcaggatgcgacagccttgtccatgcttcgatccaccatggaccttaaatcgaaagaaactccattcgtcatatcaaaacagcagaactcatatggggaatccttacgaaatgagtttggacttgtcacctccgattccctcctcaatcactcacagaaaagctcatccttaatgagttgcagaaattttggatcgtctcaggacctcactaaccaggaatctgtttcacagcactccctccgccaattcatggatgattggcctaaaagtcagtctgatcgttctgctgtttcttggcctgaacttgatcagcaatctgagagaacccagctatcgatttcaatccccatggctcctgcagacttcatgtcatctacttcctccccaaacaatgaaaaagtcactctctccccattgagattatcacgagaatttgatccaatacagatgggactgggagtgggaggtggaggtggtagtattgccaacgaaccaaaccagaggcaagccaactggattcccatttcttggggaacatcaatgggtggtccgctcggggaggtcttgcacaacaccaataacaatgcagcagcagagtgcaagaccacgtcatcgctgaacctgatgacctatagatgggacaacagtcctcgtataggttcatctccaactggggttttacaaaagtcagcgtttgcttccctttcaaatagcagtgcgggaagcagcccaagagcagagaacaggaccaatgaaggtggcagtctctgcaatgacctccttggatcaactattgtgcattcttcttcattgcctgccatgtaa

實(shí)施例3ptgrf1/2d/mptgrf1/2d的表達(dá)蛋白

根據(jù)基因的核苷酸序列經(jīng)軟件預(yù)測(cè)得到ptgrf1/2d/mptgrf1/2d的表達(dá)蛋白氨基酸序列如序列表中序列3所示。

實(shí)施例4mptgrf1/2d基因植物表達(dá)載體構(gòu)建

利用克隆技術(shù)構(gòu)建mptgrf1/2d基因的過量表達(dá)載體。使用特異pcr引物(實(shí)施例1的ptgrf1/2dcds引物)，以銀腺楊cdna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將ptgrf1/2d基因cds構(gòu)建到入門載體。入門載體為pdnor222.1，序列如序列表中序列8所示。反應(yīng)體系為freshpcrproduct80ng；pdnor222.1vector160ng；bpclonaseⅱenzymemix0.6μl；無菌ddh2o補(bǔ)足至5μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃反應(yīng)大于5h。

從篩選培養(yǎng)板上挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行pcr檢測(cè)及測(cè)序驗(yàn)證，提取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，并作為模板，使用突變引物(ptgrf1/2dcds正向突變引物和ptgrf1/2dcds反向突變引物)分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將mptgrf1/2d基因構(gòu)建到入門載體。將帶有mptgrf1/2d基因的入門載體通過mlui限制性內(nèi)切酶線性化后，與市場(chǎng)購(gòu)買的植物表達(dá)載體pmdc32進(jìn)行l(wèi)r反應(yīng)。反應(yīng)體系為：linearizedentryclone75ng；purifieddestinationvector150ng；lrclonaseⅱenzymemix0.6μl；tebuffer(ph8.0)補(bǔ)足5μl。反應(yīng)條件：25℃反應(yīng)大于5h。lr反應(yīng)后，mptgrf1/2d基因?qū)胫参锉磉_(dá)載體pmdc32中，在mptgrf1/2d基因的5’端組裝組成型強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子p35s，能使不被mir396降解的mptgrf1/2d基因在楊樹體內(nèi)高效表達(dá)；在mptgrf1/2d基因的3’端組裝有強(qiáng)終止子nos，可有效終止mptgrf1/2d基因的轉(zhuǎn)錄，如圖1所示，為植物表達(dá)載體pmdc32-mptgrf1/2d的結(jié)構(gòu)示意圖。

在載體上組裝潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶hpt，作為轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選標(biāo)記，可以用潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選。在載體上組裝lb和rb序列，促使組裝于其間的mptrgrf1/2d基因表達(dá)框架和篩選標(biāo)記基因hpt整合至楊樹受體染色體中。通過pcr檢測(cè)及測(cè)序驗(yàn)證，確認(rèn)過量表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pmdc32-mptgrf1/2d。該基因位于啟動(dòng)子p35s之后，在啟動(dòng)子p35s的驅(qū)動(dòng)下，不被mir396降解的mptgrf1/2d基因可在楊樹體內(nèi)高效表達(dá)。

實(shí)施例5mptgrf1/2d基因的遺傳轉(zhuǎn)化

通過電擊法將所構(gòu)建的pmdc32-mptgrf1/2d過量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌gv-3101中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將mptgrf1/2d基因轉(zhuǎn)入楊樹，轉(zhuǎn)化步驟如下：用于遺傳轉(zhuǎn)化的銀腺楊組培苗在培養(yǎng)溫度為23-25℃、光照為16/8h(白天/黑夜)、光照強(qiáng)度為50μm·m^-2·s^-1的條件下培養(yǎng)。含有pmdc32-mptgrf1/2d表達(dá)載體的農(nóng)桿菌gv-3101在od600＝0.6～0.8時(shí)侵染銀腺楊葉盤。侵染后的葉盤在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基sim(murashige-skoog(ms)基本培養(yǎng)基添加0.5mg/l6-benzylaminopurine(6-ba)和0.05mg/lnaphthaleneaceticacid(naa))上，在溫度為23±2℃的黑暗條件下共培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)移至含有3mg/l潮霉素(hygromycin)b和200mg/l替門汀(timentin)的sim上，在培養(yǎng)溫度為23-25℃、光照為16/8h(白天/黑夜)、光照強(qiáng)度為50μm·m^-2·s^-1的條件下誘導(dǎo)和篩選抗性不定芽。經(jīng)過約30天的誘導(dǎo)培養(yǎng)，將抗性不定芽轉(zhuǎn)移至含有3mg/lhygromycinb和200mg/ltimentin的生根培養(yǎng)基中(rim，1/2ms基本培養(yǎng)基添加0.05mg/liba和0.02mg/lnaa)，直至誘導(dǎo)出不定根。提取已生根植株葉片dna，pcr驗(yàn)證。

實(shí)施例6mptgrf1/2d基因的應(yīng)用

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法(liuetal.,2014a)對(duì)84k楊進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。用于遺傳轉(zhuǎn)化的84k楊組培苗在溫度為23-26℃、光照條件為16h光照/8h黑暗、光照強(qiáng)度為50μm·m^-2·s^-1的培養(yǎng)室培養(yǎng)。用含有35s:ptgrf1/2d且od600＝0.6-0.8的農(nóng)桿菌侵染84k楊葉盤法。侵染后的葉盤在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基sim，即murashige-skoog(ms)基本培養(yǎng)基添加0.5mg/l6-ba(6-benzylaminopurine)和0.05mg/lnaa(naphthaleneaceticacid)的培養(yǎng)基上，于24±2℃的溫度條件下黑暗培養(yǎng)3天。暗培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)移至含有200mg/l特美汀(timentin)和3mg/l潮霉素b(hygromycinb)的sim培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度為23-26℃、光照條件為16h光照/8h黑暗以及光照強(qiáng)度為50μm·m^-2·s^-1的條件下誘導(dǎo)并篩選抗性不定芽。經(jīng)過大約一個(gè)月的誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)后，即可將抗性不定芽轉(zhuǎn)移至含有200mg/l特美汀(timentin)和3mg/l潮霉素b(hygromycinb)的rim生根培養(yǎng)基(1/2ms基本培養(yǎng)基添加0.05mg/liba和0.02mg/lnaa)中，直至誘導(dǎo)出不定根，得到過量表達(dá)mptgrf1/2d的轉(zhuǎn)基因銀腺楊，分別選擇#20轉(zhuǎn)基因銀腺楊和#23轉(zhuǎn)基因銀腺楊植株。

扦插6個(gè)月的對(duì)照組未轉(zhuǎn)基因銀腺楊(ck)、#20轉(zhuǎn)基因銀腺楊和#23轉(zhuǎn)基因銀腺楊植株，即扦插后在組培瓶中生長(zhǎng)1個(gè)月，再移栽至有營(yíng)養(yǎng)土的種植盆中生長(zhǎng)5個(gè)月。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2-1和圖2-2所示，為未轉(zhuǎn)基因銀腺楊和本發(fā)明過量表達(dá)mptgrf1/2d的轉(zhuǎn)基因銀腺楊的比較圖，分別為扦插6個(gè)月后株系的植株(圖2-1)及其葉片(圖2-2)的比較圖，采用普通的相機(jī)拍照；其中，圖2-1從左至右、圖2-2從上至下依次為未轉(zhuǎn)基因銀腺楊(ck)、轉(zhuǎn)基因銀腺楊#20、#23的照片。從圖2-1和圖2-2可以看出，與未轉(zhuǎn)基因銀腺楊(ck)相比，轉(zhuǎn)基因銀腺楊(#20、#23)的葉片明顯更大，說明mptgrf1/2d基因促進(jìn)葉片增大。

圖3為本發(fā)明過量表達(dá)mptgrf1/2d的轉(zhuǎn)基因楊樹的轉(zhuǎn)錄水平定量檢測(cè)圖，用1個(gè)月左右的組培苗作材料，提取rna并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用sybrpremixextaqtmkit(takara)試劑盒，以actin基因?yàn)閮?nèi)參，用lightcycler480(roche)實(shí)時(shí)定量?jī)x器完成)，圖中柱形圖顯示mptgrf1/2d基因分別在未轉(zhuǎn)基因銀腺楊(ck)和轉(zhuǎn)基因銀腺楊(#20、#23)(為過量表達(dá)mptgrf1/2d的轉(zhuǎn)基因楊樹的2個(gè)株系)中的表達(dá)量。從圖3可以看出，與未轉(zhuǎn)基因銀腺楊(ck)相比，轉(zhuǎn)基因銀腺楊(#20、#23)的mrna的水平明顯更高。

圖4是本發(fā)明測(cè)量的過量表達(dá)mptgrf1/2d的轉(zhuǎn)基因楊樹的葉面積圖，將葉片掃描成圖片，利用imagej軟件測(cè)量得到。

從圖4可以看出，與未轉(zhuǎn)基因銀腺楊(ck)相比，轉(zhuǎn)基因銀腺楊(#20、#23)的mrna的水平明顯更高。

從結(jié)果可以看出，本發(fā)明通過將mptgrf1/2d基因轉(zhuǎn)入楊樹，過量表達(dá)mptgrf1/2d的轉(zhuǎn)基因銀腺楊與未轉(zhuǎn)基因銀腺楊比較，葉片明顯變大，說明ptgrf-1/2d基因是調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因，在林木基因工程領(lǐng)域有重要應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明以銀腺楊為材料，克隆了ptgrf1/2d基因(序列1)，并對(duì)其mir396靶位點(diǎn)核苷酸進(jìn)行6個(gè)堿基的同義突變，獲得突變形式的ptgrf1/2d(mptgrf1/2d，序列2)；同時(shí)，構(gòu)建過量表達(dá)載體pmdc32-mptgrf1/2d，該基因位于啟動(dòng)子p35s之后，在啟動(dòng)子p35s的驅(qū)動(dòng)下，mptgrf1/2d可在楊樹體內(nèi)不被mir396降解而高效表達(dá)，從而調(diào)控楊樹葉片的發(fā)育。

sequencelisting

<110>中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所

<120>一種調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因及其應(yīng)用

<130>

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1830

<212>dna

<213>生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子ptgrf1/2d

<400>1

atggattttggggttcaggtgggtttggatgggttggtgggttcagacacaagtaatagt60

ggttttgcttctcttgctagctcagatcctgaagcaaagcagaagttgtacggatctggg120

ttcttgaagcaagagagacctggcaacatcgatggtgattggaggagctctaaattgtcc180

aaaactgagtcaatgctgcttgagcagagtaacacttcacttctgaaatctaactccaac240

tttctcttcgctgatggacagcagcagcagcagcagatgctcagcttctcctatcccaga300

tcagctccttcagcggaaagaagctcccaaaatggcacattgccgtactttcacctcaca360

tcttctgctcataatagaaatacaggctacagctctggtatctacaatgctgccagcatg420

catggggttttgaccgagaccagatggccattcactcaatcacaatggatggagcttgaa480

catcaggccttgatctacaagtatatagcagcaaatgtgcctataccatctaatctgctc540

attcccattagaaaagctcttgattctgctgggtttcctagcttttctgctggatttttc600

agacccaatacaatgccatggggtgctttccatatgggtttctccagcaacactgatccg660

gagccaggacggtgtcgaaggacagatgggaagaaatggcggtgctcaagagatgcagtt720

gccgatcagaagtattgtgagcggcatatgaacaggggccgccatcgttcaagaaagcct780

gtggaaggccaatcaggccattccgctgcagccgccaccactgtaaagccagccaatggc840

acttcgtcttctacatcatcatcagtggtggggcttcgcagcactgtgtccgacagcctc900

actattgctcataatcagcagcaagcaacgagtccatctaatctttctgcctccaatacg960

ctcagcaggatgttccttactaaagagaatgtaggtgagagaacgcaggatgcgacagcc1020

ttgtccatgcttcgatccaccatggaccttaaatcgaaagaaactccattcgtcatatca1080

aaacagcagaactcatatggggaatccttacgaaatgagtttggacttgtcacctccgat1140

tccctcctcaatcactcacagaaaagctcatccttaatgagttgcagaaattttggatcg1200

tctcaggacctcactaaccaggaatctgtttcacagcactccctccgccaattcatggat1260

gattggcctaaaagtcagtctgatcgttctgctgtttcttggcctgaacttgatcagcaa1320

tctgagagaacccagctatcgatttcaatccccatggctcctgcagacttcatgtcatct1380

acttcctccccaaacaatgaaaaagtcactctctccccattgagattatcacgagaattt1440

gatccaatacagatgggactgggagtgggaggtggaggtggtagtattgccaacgaacca1500

aaccagaggcaagccaactggattcccatttcttggggaacatcaatgggtggtccgctc1560

ggggaggtcttgcacaacaccaataacaatgcagcagcagagtgcaagaccacgtcatcg1620

ctgaacctgatgacctatagatgggacaacagtcctcgtataggttcatctccaactggg1680

gttttacaaaagtcagcgtttgcttccctttcaaatagcagtgcgggaagcagcccaaga1740

gcagagaacaggaccaatgaaggtggcagtctctgcaatgacctccttggatcaactatt1800

gtgcattcttcttcattgcctgccatgtaa1830

<210>2

<211>1830

<212>dna

<213>突變形式mptgrf1/2d

<400>2

atggattttggggttcaggtgggtttggatgggttggtgggttcagacacaagtaatagt60

ggttttgcttctcttgctagctcagatcctgaagcaaagcagaagttgtacggatctggg120

ttcttgaagcaagagagacctggcaacatcgatggtgattggaggagctctaaattgtcc180

aaaactgagtcaatgctgcttgagcagagtaacacttcacttctgaaatctaactccaac240

tttctcttcgctgatggacagcagcagcagcagcagatgctcagcttctcctatcccaga300

tcagctccttcagcggaaagaagctcccaaaatggcacattgccgtactttcacctcaca360

tcttctgctcataatagaaatacaggctacagctctggtatctacaatgctgccagcatg420

catggggttttgaccgagaccagatggccattcactcaatcacaatggatggagcttgaa480

catcaggccttgatctacaagtatatagcagcaaatgtgcctataccatctaatctgctc540

attcccattagaaaagctcttgattctgctgggtttcctagcttttctgctggatttttc600

agacccaatacaatgccatggggtgctttccatatgggtttctccagcaacactgatccg660

gagccaggacggtgtcgaaggacagatgggaagaaatggcggtgctcaagagatgcagtt720

gccgatcagaagtattgtgagcggcatatgaacaggggccgccatcgttctaggaaacca780

gtcgagggccaatcaggccattccgctgcagccgccaccactgtaaagccagccaatggc840

acttcgtcttctacatcatcatcagtggtggggcttcgcagcactgtgtccgacagcctc900

actattgctcataatcagcagcaagcaacgagtccatctaatctttctgcctccaatacg960

ctcagcaggatgttccttactaaagagaatgtaggtgagagaacgcaggatgcgacagcc1020

ttgtccatgcttcgatccaccatggaccttaaatcgaaagaaactccattcgtcatatca1080

aaacagcagaactcatatggggaatccttacgaaatgagtttggacttgtcacctccgat1140

tccctcctcaatcactcacagaaaagctcatccttaatgagttgcagaaattttggatcg1200

tctcaggacctcactaaccaggaatctgtttcacagcactccctccgccaattcatggat1260

gattggcctaaaagtcagtctgatcgttctgctgtttcttggcctgaacttgatcagcaa1320

tctgagagaacccagctatcgatttcaatccccatggctcctgcagacttcatgtcatct1380

acttcctccccaaacaatgaaaaagtcactctctccccattgagattatcacgagaattt1440

gatccaatacagatgggactgggagtgggaggtggaggtggtagtattgccaacgaacca1500

aaccagaggcaagccaactggattcccatttcttggggaacatcaatgggtggtccgctc1560

ggggaggtcttgcacaacaccaataacaatgcagcagcagagtgcaagaccacgtcatcg1620

ctgaacctgatgacctatagatgggacaacagtcctcgtataggttcatctccaactggg1680

gttttacaaaagtcagcgtttgcttccctttcaaatagcagtgcgggaagcagcccaaga1740

gcagagaacaggaccaatgaaggtggcagtctctgcaatgacctccttggatcaactatt1800

gtgcattcttcttcattgcctgccatgtaa1830

<210>3

<211>609

<212>prt

<213>ptgrf1/2d/mptgrf1/2d的表達(dá)蛋白

<400>3

metasppheglyvalglnvalglyleuaspglyleuvalglyserasp

151015

thrserasnserglyphealaserleualaserseraspprogluala

202530

lysglnlysleutyrglyserglypheleulysglngluargprogly

354045

asnileaspglyasptrpargserserlysleuserlysthrgluser

505560

metleuleugluglnserasnthrserleuleulysserasnserasn

65707580

pheleuphealaaspglyglnglnglnglnglnglnmetleuserphe

859095

sertyrproargseralaproseralagluargserserglnasngly

100105110

thrleuprotyrphehisleuthrserseralahisasnargasnthr

115120125

glytyrserserglyiletyrasnalaalasermethisglyvalleu

130135140

thrgluthrargtrpprophethrglnserglntrpmetgluleuglu

145150155160

hisglnalaleuiletyrlystyrilealaalaasnvalproilepro

165170175

serasnleuleuileproilearglysalaleuaspseralaglyphe

180185190

proserpheseralaglyphepheargproasnthrmetprotrpgly

195200205

alaphehismetglypheserserasnthraspprogluproglyarg

210215220

cysargargthraspglylyslystrpargcysserargaspalaval

225230235240

alaaspglnlystyrcysgluarghismetasnargglyarghisarg

245250255

serarglysprovalgluglyglnserglyhisseralaalaalaala

260265270

thrthrvallysproalaasnglythrserserserthrserserser

275280285

valvalglyleuargserthrvalseraspserleuthrilealahis

290295300

asnglnglnglnalathrserproserasnleuseralaserasnthr

305310315320

leuserargmetpheleuthrlysgluasnvalglygluargthrgln

325330335

aspalathralaleusermetleuargserthrmetaspleulysser

340345350

lysgluthrprophevalileserlysglnglnasnsertyrglyglu

355360365

serleuargasnglupheglyleuvalthrseraspserleuleuasn

370375380

hisserglnlysserserserleumetsercysargasnpheglyser

385390395400

serglnaspleuthrasnglngluservalserglnhisserleuarg

405410415

glnphemetaspasptrpprolysserglnseraspargseralaval

420425430

sertrpprogluleuaspglnglnsergluargthrglnleuserile

435440445

serileprometalaproalaaspphemetserserthrserserpro

450455460

asnasnglulysvalthrleuserproleuargleuserarggluphe

465470475480

aspproileglnmetglyleuglyvalglyglyglyglyglyserile

485490495

alaasngluproasnglnargglnalaasntrpileproilesertrp

500505510

glythrsermetglyglyproleuglygluvalleuhisasnthrasn

515520525

asnasnalaalaalaglucyslysthrthrserserleuasnleumet

530535540

thrtyrargtrpaspasnserproargileglyserserprothrgly

545550555560

valleuglnlysseralaphealaserleuserasnserseralagly

565570575

serserproargalagluasnargthrasngluglyglyserleucys

580585590

asnaspleuleuglyserthrilevalhisserserserleuproala

595600605

met

<210>4

<211>49

<212>dna

<213>ptgrf1/2dcds正向引物

<400>4

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatatggattttggggttcag49

<210>5

<211>49

<212>dna

<213>ptgrf1/2dcds反向引物

<400>5

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtattacatggcaggcaatgaa49

<210>6

<211>47

<212>dna

<213>ptgrf1/2d正向突變引物

<400>6

ccgccatcgttctaggaaaccagtcgagggccaatcaggccattccg47

<210>7

<211>45

<212>dna

<213>ptgrf1/2d反向突變引物

<400>7

ttggccctcgactggtttcctagaacgatggcggcccctgttcat45

<210>8

<211>4718

<212>dna

<213>入門載體pdnor222.1序列

<400>8

gtctgacgctcagggaacgacgcgtaccgctagccaggaagagtttgtagaaacgcaaaa60

aggccatccgtcaggatggccttctgcttagtttgatgcctggcagtttatggcgggcgt120

cctgcccgccaccctccgggccgttgcttcacaacgttcaaatccgctcccggcggattt180

gtcctactcaggagagcgttcaccgacaaacaacagataaaacgaaaggcccagtcttcc240

gactgagcctttcgttttatttgatgcctggcagttccctactctcgcgttaacgctagc300

atggatgttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtcttaagctcgggcccca360

aataatgattttattttgactgatagtgacctgttcgttgcaacaaattgatgagcaatg420

cttttttataatgccaactttgtacaaaaaagctgaacgagaaacgtaaaatgatataaa480

tatcaatatattaaattagattttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacaca540

acatatccagtcactatgaatcaactacttagatggtattagtgacctgtagtcgaccga600

cagccttccaaatgttcttcgggtgatgctgccaacttagtcgaccgacagccttccaaa660

tgttcttctcaaacggaatcgtcgtatccagcctactcgctattgtcctcaatgccgtat720

taaatcataaaaagaaataaggaaaagaggtgcgagcctcttttttgtgtgacaaaataa780

aaacatctacctattcatatacgctagtgtcatagtcctgaaaatcatctgcatcaagaa840

caatttcacaactcttatacttttctcttacaagtcgttcggcttcatctggattttcag900

cctctatacttactaaacgtgataaagtttctgtaatttctactgtatcgacctgcagac960

tggctgtgtataagggagcctgacatttatattccccagaacatcaggttaatggcgttt1020

ttgatgtcattttcgcggtggctgagatcagccacttcttccccgataacggagaccggc1080

acactggccatatcggtggtcatcatgcgccagctttcatccccgatatgcaccaccggg1140

taaagttcacgggagactttatctgacagcagacgtgcactggccagggggatcaccatc1200

cgtcgcccgggcgtgtcaataatatcactctgtacatccacaaacagacgataacggctc1260

tctcttttataggtgtaaaccttaaactgcatttcaccagcccctgttctcgtcagcaaa1320

agagccgttcatttcaataaaccgggcgacctcagccatcccttcctgattttccgcttt1380

ccagcgttcggcacgcagacgacgggcttcattctgcatggttgtgcttaccagaccgga1440

gatattgacatcatatatgccttgagcaactgatagctgtcgctgtcaactgtcactgta1500

atacgctgcttcatagcatacctctttttgacatacttcgggtatacatatcagtatata1560

ttcttataccgcaaaaatcagcgcgcaaatacgcatactgttatctggcttttagtaagc1620

cggatccacgcggcgtttacgccccccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcatt1680

aagcattctgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcgg1740

catcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaa1800

gttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctga1860

gacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaaca1920

cgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactcca1980

gagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatc2040

ccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacggaattccggatgagcattcatcag2100

gcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctt2160

taaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactg2220

aaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagt2280

gatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatac2340

gcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaac2400

gtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggacaccaggatt2460

tatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcggcgcaaagtgcgtcggg2520

tgatgctgccaacttagtcgactacaggtcactaataccatctaagtagttgattcatag2580

tgactggatatgttgtgttttacagtattatgtagtctgttttttatgcaaaatctaatt2640

taatatattgatatttatatcattttacgtttctcgttcagctttcttgtacaaagttgg2700

cattataagaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaacaggtcactatcagtcaaaa2760

taaaatcattatttgccatccagctgatatcccctatagtgagtcgtattacatggtcat2820

agctgtttcctggcagctctggcccgtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaaga2880

taaaaatatatcatcatgttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttatt2940

catatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaa3000

ctcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcg3060

tccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaa3120

atcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttcca3180

gacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaacc3240

gttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca3300

attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatatt3360

ttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagt3420

ggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcat3480

aaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacc3540

tttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgt3600

cgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccat3660

gttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcatagatct3720

tttctccatcactgatagggagtggtaaaataactccatcaatgatagagtgtcaacaac3780

atgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgtattaattgcgttgcgctcactgcccgct3840

ttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggaga3900

ggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtc3960

gttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaa4020

tcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgt4080

aaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaa4140

aatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgttt4200

ccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctg4260

tccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctc4320

agttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagccc4380

gaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgactta4440

tcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgct4500

acagagttcttgaagtggtggcctaactacggttacactagaagaacagtatttggtatc4560

tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaa4620

caaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaa4680

aaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggg4718

<210>9

<211>11752

<212>dna

<213>植物表達(dá)載體pmdc32

<400>9

aattcagtaacatagatgacaccgcgcgcgataatttatcctagtttgcgcgctatattt60

tgttttctatcgcgtattaaatgtataattgcgggactctaatcataaaaacccatctca120

taaataacgtcatgcattacatgttaattattacatgcttaacgtaattcaacagaaatt180

atatgataatcatcgcaagaccggcaacaggattcaatcttaagaaactttattgccaaa240

tgtttgaacgatcggggaaattcgagctccaccgcggtgggcggccgctctagaactagt300

taattaaggaattatcgaaccactttgtacaagaaagctgaacgagaaacgtaaaatgat360

ataaatatcaatatattaaattagattttgcataaaaaacagactacataatactgtaaa420

acacaacatatccagtcactatggtcgacctgcagactggctgtgtataagggagcctga480

catttatattccccagaacatcaggttaatggcgtttttgatgtcattttcgcggtggct540

gagatcagccacttcttccccgataacggagaccggcacactggccatatcggtggtcat600

catgcgccagctttcatccccgatatgcaccaccgggtaaagttcacgggagactttatc660

tgacagcagacgtgcactggccagggggatcaccatccgtcgcccgggcgtgtcaataat720

atcactctgtacatccacaaacagacgataacggctctctcttttataggtgtaaacctt780

aaactgcatttcaccagtccctgttctcgtcagcaaaagagccgttcatttcaataaacc840

gggcgacctcagccatcccttcctgattttccgctttccagcgttcggcacgcagacgac900

gggcttcattctgcatggttgtgcttaccagaccggagatattgacatcatatatgcctt960

gagcaactgatagctgtcgctgtcaactgtcactgtaatacgctgcttcatagcacacct1020

ctttttgacatacttcgggtatacatatcagtatatattcttataccgcaaaaatcagcg1080

cgcaaatacgcatactgttatctggcttttagtaagccggatcctctagattacgccccg1140

ccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagcca1200

tcacagacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgta1260

taatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaa1320

tcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaac1380

cctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgt1440

agaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgc1500

tcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttc1560

attgccatacggaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggcc1620

ggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctga1680

acggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacga1740

tgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttcc1800

ttagctcctgaaaatctcgccggatcctaactcaaaatccacacattatacgagccggaa1860

gcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgcggccgccatagtgactggatatgttgtg1920

ttttacagtattatgtagtctgttttttatgcaaaatctaatttaatatattgatattta1980

tatcattttacgtttctcgttcagcttttttgtacaaacttgtttgatagcttggcgcgc2040

ctcgagggggggcccggtacccggggatcctctagagtcgaggtcctctccaaatgaaat2100

gaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatccctt2160

acgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttct2220

ttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggca2280

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tttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtcca2580

tctttgggaccactgtcggcagaggcatcttcaacgatggcctttcctttatcgcaatga2640

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