本發(fā)明涉及一種生物降解聚酯納米粒及其制備方法和應(yīng)用，屬于高分子化合物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：眾所周知，聚合物膠體顆粒的拓?fù)浜涂臻g效應(yīng)在靜脈藥物遞送中起主要作用，而聚合物中的靜電電荷可引起血清蛋白的吸附(調(diào)理作用)和被單核巨噬細(xì)胞從體內(nèi)消除。合成聚合物具有低細(xì)胞毒性，良好的蛋白質(zhì)抗性，生物可降解性，這些特征在生物相容性聚乙二醇(peg)膠體顆粒的穩(wěn)定化中已基本滿足。通過(guò)peg的修飾導(dǎo)致電中性表面，與血清蛋白的最小相互作用，即“隱形樣”性質(zhì)，并因此延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)。由于這些原因，peg及其衍生物已經(jīng)成為藥物遞送研究中常用的親水材料，以增強(qiáng)治療劑的功效。中國(guó)專利200580021839.2將聚乙二醇與乙烯基甲基醚和馬來(lái)酸酐共聚物共孵化，制備聚乙二醇化的納米顆粒，并用于載藥。中國(guó)專利201110174751.1采用乳化/溶劑蒸發(fā)法制備紫杉醇peg-ptmc納米復(fù)合物，該復(fù)合物能有效增加紫杉醇的溶解度，且載體材料的peg長(zhǎng)鏈可起到“隱形”的作用，具有長(zhǎng)循環(huán)效果。然而，由于惰性ch2ch2o重復(fù)單元引入靶向結(jié)構(gòu)或染料標(biāo)記，也導(dǎo)致peg化缺乏足夠的官能化位點(diǎn)。由于其生物降解性差，在人體內(nèi)需較長(zhǎng)時(shí)間降解，peg在組織中的積累可能在某些體內(nèi)應(yīng)用中引起副作用。盡管peg化的藥物載體可以避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取，但是細(xì)胞內(nèi)化也由于載體和細(xì)胞膜之間的弱相互作用而減慢。peg在某些生物流體中也易于氧化。因此，研究者期望找到在藥物遞送應(yīng)用中可替代的生物相容性和生物可降解的聚合物。碳水化合物衍生物因?yàn)樗鼈兙哂袃?yōu)異的生物可降解性，生物相容性和生物粘附性等，近來(lái)在藥物遞送領(lǐng)域受到極大關(guān)注。它們衍生自多種具有用于許多化學(xué)修飾的官能團(tuán)的天然資源。通過(guò)綴合和修飾進(jìn)行的聚合物的糖基化還賦予了廣泛的優(yōu)點(diǎn)，包括降低毒性和免疫原性，改善血清穩(wěn)定性和促進(jìn)生物粘附。殼聚糖或淀粉具有適于與生物組織相互作用的多個(gè)親水性官能團(tuán)，因此，由殼聚糖制成的載體在某些組織中具有長(zhǎng)停留時(shí)間并且提高了裝載藥物的吸光度。中國(guó)專利201110423116.2選用生物可降解聚合物消旋聚乳酸pdlla，聚乳酸-羥基乙酸plga或聚己內(nèi)酯pcl通過(guò)乳化-溶劑揮發(fā)法制備納米粒子，應(yīng)用于生物成像、藥物傳輸?shù)妊芯肯嘟Y(jié)合的多功能生物可降解聚合物納米粒子領(lǐng)域。中國(guó)專利201010023101.2報(bào)道了一種生物可降解納米多孔聚l-谷氨酸/殼聚糖載藥微膠囊及其制備方法，將聚l-谷氨酸和殼聚糖作為水溶性藥物的負(fù)載材料，選用可除去的介孔二氧化硅為模板，制備內(nèi)部具網(wǎng)絡(luò)支撐結(jié)構(gòu)的納米多孔載藥微膠囊。然而對(duì)于如何實(shí)現(xiàn)可替代的生物相容性良好的聚合物制備納米粒與其作為藥物載體的應(yīng)用，仍然缺少措施與手段，報(bào)道也少?；诖耍龀霰旧暾?qǐng)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有負(fù)載藥物納米粒所存在的上述缺陷，本申請(qǐng)首先提供一種可生物降解的聚酯，該聚酯以葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(gdl)為單體，其結(jié)構(gòu)式為：反應(yīng)產(chǎn)物pgdl具有高度支化的結(jié)構(gòu)，作為藥物載體時(shí)，有助于對(duì)水溶性抗癌藥物的包覆負(fù)載。同時(shí)，本申請(qǐng)還提供了一種具有上述結(jié)構(gòu)聚酯納米粒的制備方法，其反應(yīng)式為：反應(yīng)所得聚酯經(jīng)反向乳化法制得納米粒。進(jìn)一步的，作為優(yōu)選：所述的引發(fā)劑為乙二醇，催化劑為鈦酸四丁酯。以gdl為原料，乙二醇引發(fā)、聚合后，經(jīng)洗滌、分離，得到純化pgdl；pgdl制備納米?？刹捎脟婌F干燥法、乳化法或溶劑蒸發(fā)法等，本申請(qǐng)以pgdl為載體材料通過(guò)反相乳化法制備納米粒，形成乳劑，洗滌，分離后，得到聚酯納米粒。所述的gdl與催化劑的質(zhì)量比為50:1-25:2，引發(fā)劑與催化劑等量添加。所述的開環(huán)聚合反應(yīng)條件為n2保護(hù)下，160℃下攪拌3h。所述的洗滌劑采用dmf與thf，dmf與thf依次洗滌。所述的分離后進(jìn)行干燥，干燥采用真空干燥得到純化pgdl。所述的反向乳化法的工藝為：將聚酯形成水相，液體石蠟為油相，司盤80為乳化劑加入油相中后，水相與油相攪拌混合回流形成乳劑，乳劑洗滌、離心干燥得到納米粒。更優(yōu)選的，所述的洗滌采用異丙醇和石油醚交互洗滌。同時(shí)，本申請(qǐng)還提供了一種上述pgdl的應(yīng)用，將聚酯形成水相，在水相中溶解負(fù)載物，液體石蠟為油相，司盤80為乳化劑加入油相中后，水相與油相攪拌混合回流形成乳劑，乳劑洗滌、離心干燥得到載藥pgdl納米粒，建立了負(fù)載抗癌藥物的方法。更優(yōu)選的，所述的洗滌采用異丙醇和石油醚交互洗滌，所述的負(fù)載物為5-fu。本申請(qǐng)?zhí)岢鲆环N新穎的碳水化合物衍生的聚合物，具有優(yōu)異的生物相容性。葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(gdl)是d-葡萄糖酸的環(huán)狀酯，通過(guò)葡萄糖的發(fā)酵制造。gdl作為“通常被認(rèn)為是安全的”(gras)物質(zhì)，廣泛用作食品添加劑并與一些葡萄糖酸鹽形式的藥物一起給藥。聚(葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯)(pgdl)適宜官能化，能呈現(xiàn)出很低的細(xì)胞毒性。對(duì)載藥pgdl納米粒能夠可控制釋放5-氟尿嘧啶(5-fu)說(shuō)明pgdl是有效治療卵巢腫瘤的有前景的平臺(tái)。本申請(qǐng)中，生物可降解聚酯納米粒的制備方法可描述為：(1)葡萄糖酸內(nèi)酯(gdl)在引發(fā)劑與催化劑條件下經(jīng)開環(huán)聚合生成聚葡萄糖酸內(nèi)酯(pgdl)；(2)n,n-二甲基甲酰胺(dmf)與四氫呋喃(thf)洗滌，真空干燥，得到純化聚合物；(3)將(2)中制備的聚合物以司盤80為乳化劑通過(guò)反向乳化法形成油包水型乳劑；(4)異丙醇與石油醚交互洗滌，離心，干燥，得到納米粒；(5)細(xì)胞毒性與親和性檢測(cè)試驗(yàn)證明此類納米粒安全無(wú)毒；(6)負(fù)載抗癌藥物5-氟尿嘧啶的pgdl納米粒對(duì)癌細(xì)胞有明顯的抑制效果。上述方法制備的聚酯pgdl（也可直接以gdl作為合成單體）與pcl（也可直接以cl作為合成單體）在鈦酸四丁酯、乙二醇作用下共聚合成兩親性嵌段共聚酯pgdl-cl，其結(jié)構(gòu)式為：。所述的共聚酯溶于水形成分散液，稱取負(fù)載物并溶二甲基亞砜中，逐滴加入到上述分散液中，繼續(xù)攪拌得載藥納米粒分散液，離心除去未負(fù)載上的利福平，冷凍干燥，得到載藥共聚酯納米粒。所述的負(fù)載物為利福平。本發(fā)明制備可生物降解的gdl為原料制備納米粒，具有制備方法簡(jiǎn)單，原料價(jià)廉易得，生物相容性好等特點(diǎn)，具體分析如下：1)制備方法簡(jiǎn)單。gdl安全無(wú)毒，可生物降解，gdl的開環(huán)聚合反應(yīng)在無(wú)溶劑條件下進(jìn)行；pgdl以本體聚合的方式合成，無(wú)溶劑參與，制備及純化方法簡(jiǎn)單，且原料來(lái)源豐富，價(jià)格低廉。納米粒是的制備采用反相乳化法，制備過(guò)程污染小，易操作。2)本申請(qǐng)可以適用于制備多種分子量規(guī)格的pgdl，該pgdl是高度支化的聚合物；通過(guò)反向乳化法制備聚酯納米粒，操作簡(jiǎn)單，粒子粒徑小，檢測(cè)所制備的聚酯納米粒的生物相容性，細(xì)胞毒性小，細(xì)胞親和性好，極易進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞吸收性好，安全無(wú)毒，為該納米粒應(yīng)用于臨床提供良好的參考。3)本申請(qǐng)檢測(cè)了所制備的負(fù)載抗癌藥物的釋放效果，藥物的釋放可控，實(shí)現(xiàn)了藥物的釋放可控。它對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有良好的抑制效果。負(fù)載5-氟尿嘧啶具有載藥量高的特點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1為本申請(qǐng)中聚酯的核磁共振（1hnmr）譜圖（其中，（a）為單體gdl的1hnmr分析，（b）為聚合物pgdl的1hnmr分析）；圖2為本申請(qǐng)中聚酯在3800-2600cm-1波段的紅外光譜（ftir）圖（其中，（a）為單體gdl的ftir分析，（b）為聚合物pgdl的ftir分析）；圖3是申請(qǐng)中聚酯在1900-800cm-1波段的紅外光譜（ftir）圖（其中，（a）為單體gdl的ftir分析，（b）為聚合物pgdl的ftir分析）；圖4是本申請(qǐng)中納米粒的掃描電子顯微鏡（sem）譜圖；圖5是本申請(qǐng)中納米粒的透射電子顯微鏡（tem）譜圖；圖6是本申請(qǐng)中納米粒負(fù)載5-氟尿嘧啶（5-fu）在ph7.4與ph6.5的釋放曲線圖；圖7是本申請(qǐng)中納米粒負(fù)載5-fu在ph7.4與ph6.5釋放曲線的釋放動(dòng)力學(xué)分析（peppas擬合）；圖8是本申請(qǐng)中納米粒對(duì)卵巢癌細(xì)胞（ovcar-3）的細(xì)胞毒性；圖9是本申請(qǐng)中納米粒被ovcar-3細(xì)胞攝入熒光顯微鏡圖（其中，（a）為未標(biāo)記納米粒與ovcar-3細(xì)胞共孵化，（b）為r-123標(biāo)記納米粒與ovcar-3細(xì)胞孵化0.5h，（c）為r-123標(biāo)記納米粒與ovcar-3細(xì)胞孵化1h，（d）為r-123標(biāo)記納米粒與ovcar-3細(xì)胞孵化2h）；圖10為本申請(qǐng)中pgdl共聚酯分子的gpc圖譜；圖11為本申請(qǐng)中pgdl(a)及共聚酯(b)的1hnmr譜圖(譜峰上的原子編號(hào)見其結(jié)構(gòu)式)；圖12為本申請(qǐng)中pcl(a)、pgdl(b)及共聚酯(c)的ftir分析；圖13為本申請(qǐng)中pgdl共聚酯納米粒載藥前后在水中分散的粒徑分布；圖14為本申請(qǐng)中pgdl共聚酯納米粒的tem照片；圖15為本申請(qǐng)中pgdl負(fù)載利福平的共聚酯納米粒體外釋放曲線；圖16為本申請(qǐng)中pgdl的peppas方程分析利福平釋放過(guò)程圖17為本申請(qǐng)中pgdl的higuchi方程分析利福平釋放過(guò)程。具體實(shí)施方式實(shí)施例1按照單體gdl與催化劑鈦酸四丁酯質(zhì)量比25:2，將10.0ggdl，0.8ml鈦酸四丁酯，0.8ml乙二醇混合加入到100ml三口圓底燒瓶中，加攪拌子后置于硅油浴中，中間接口接冷凝回流管，左口通入n2保護(hù)，右口密封，160℃下磁力攪拌3h。停止加熱與攪拌，產(chǎn)物在n2保護(hù)下冷卻，得紅褐色蠟狀固體。于三口瓶中加入20mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)，80℃加熱至完全溶解，冷卻至室溫，瓶中液體倒入250ml燒杯中，加入3-4倍量四氫呋喃(thf)沉淀，稍靜置，去除上層液體，再用thf連續(xù)洗滌3-4次，真空干燥除去thf，得終產(chǎn)品pgdl。上述反應(yīng)過(guò)程可表示為：，所制備的pgdl結(jié)構(gòu)為：。稱取100.0mgpgdl溶于5ml水中，配成2％(w/v)pgdl溶液，靜置，取上層清液4ml作為水相。40ml液體石蠟與5％(v/v)的乳化劑span-80均勻混合作為油相。在50℃，600r/min機(jī)械攪拌及回流條件下，將水相經(jīng)0.22μm針式過(guò)濾器逐滴加入油相，繼續(xù)攪拌4h后停止，傾入250ml燒杯中，加入等體積的石油醚，攪拌，靜置，棄去大部分上層液，剩下部分裝入離心管，3500r/min離心5min，棄上層液，然后按石油醚、異丙醇、異丙醇、石油醚、異丙醇的加入順序依次洗滌，離心，產(chǎn)物以異丙醇分散，常溫真空干燥，得到pgdl納米粒。實(shí)施例2-5實(shí)施例2-5與實(shí)施例1的制備條件相同，區(qū)別在于：分別對(duì)不同gdl與鈦酸四丁酯質(zhì)量比下所制備成品聚酯進(jìn)行試驗(yàn)，具體參見表1所示。實(shí)施例6：負(fù)載5-fu的pgdl的納米粒的制備負(fù)載5-fu的pgdl的納米粒的制備方法：利用上述實(shí)施例制備所得納米粒，負(fù)載5-fu后釋放，方法如下：稱取100.0mgpgdl(gdl與鈦酸四丁酯質(zhì)量比為25:1，引發(fā)劑與催化劑體積用量相同，具體參見實(shí)施例3)溶于5ml水中，配成2％(w/v)pgdl溶液，靜置，取上層清液4ml作為水相；在4ml水相中溶解10mg5-fu；40ml液體石蠟與5％(v/v)的乳化劑span-80均勻混合作為油相；在50℃，600r/min機(jī)械攪拌及回流條件下，將溶解有5-fu的水相經(jīng)0.22μm針式過(guò)濾器逐滴加入油相，繼續(xù)攪拌4h后停止，傾入250ml燒杯中，加入等體積的石油醚，攪拌，靜置，棄去大部分上層液，剩下部分裝入離心管，3500r/min離心5min，棄上層液，然后按石油醚、異丙醇、異丙醇、石油醚、異丙醇的加入順序依次洗滌，離心，產(chǎn)物以異丙醇分散，常溫真空干燥，制備載藥pgdl納米粒。實(shí)施例7：兩親性嵌段共聚物pgdl-cl及其在水中自組裝成納米粒給藥體系兩親性共聚物在水中自組裝形成的納米粒，具有疏水內(nèi)核與親水外殼。目前臨床上使用的一線抗結(jié)核藥需長(zhǎng)期和頻繁給藥，具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，通過(guò)納米粒子系統(tǒng)包埋一線抗結(jié)核藥制備的緩控釋制劑，能有效克服藥物的不良反應(yīng)，將有助于改善患者依從性和規(guī)避肝腎毒性、耳毒性等，并改善藥物的生物利用度，溶解性，穩(wěn)定性和生物相容性，使其成為遞送抗結(jié)核藥物的理想選擇。本實(shí)施例制備兩親性嵌段共聚物pgdl-cl及其在水中自組裝成納米粒給藥體系，ftir與1hnmr進(jìn)行表征，tem觀察粒徑形態(tài)，納米激光粒度儀測(cè)定粒徑分布。以利福平為模型藥物，研究了pgdl-cl納米粒負(fù)載藥物在37℃，ph7.4磷酸鹽緩沖液(含0.5％v/vtween-80)中的體外釋放，并對(duì)藥物釋放進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。其中，gdl與cl共聚的產(chǎn)物pgdl-cl的結(jié)構(gòu)示意圖為：。(1)儀器與試劑冷凍干燥機(jī)(型號(hào)：alpha1-2ldplus，生產(chǎn)廠家：德國(guó)christ公司)。ε-己內(nèi)酯(cl)(ar，上海阿拉丁試劑有限公司)；利福平(ar，上海阿拉丁試劑有限公司)；自配20mmph7.4磷酸鹽緩沖液加0.5％v/vtween-80(本文中簡(jiǎn)稱為緩沖液)；其余試劑均為分析純。(2)實(shí)驗(yàn)部分①pgdl-cl共聚酯的合成移液槍移取cl5.0ml、鈦酸四丁酯、乙二醇各0.8ml于100ml三口燒瓶中，加攪拌子后置于硅油浴中，中間接口接冷凝回流管，左口通入n2保護(hù)，右口密封，160℃磁力攪拌下反應(yīng)2h，稱取gdl16.0763g，用漏斗加入燒瓶中，繼續(xù)攪拌3h。停止加熱與攪拌，產(chǎn)物在n2保護(hù)下冷卻。于三口瓶中加入20mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)，70℃加熱至完全溶解，冷卻至室溫，瓶中液體倒入250ml燒杯中，加入3-4倍量四氫呋喃(thf)沉淀，稍靜置，去除上層液體，再用thf連續(xù)洗滌3-4次，真空干燥除去thf，得終產(chǎn)品，并對(duì)其進(jìn)行1hnmr與ftir表征及粒徑分布測(cè)定。②共聚酯載藥納米粒的制備稱取0.40g共聚酯，溶于20ml蒸餾水中，加入攪拌子，常溫下磁力攪拌5h，即得共聚酯納米粒分散液。tem觀察粒子形態(tài)，納米激光粒度儀測(cè)定納米粒粒徑分布。稱取20mg利福平，溶于3ml二甲基亞砜(dmso)中，逐滴加入到上述分散液中，繼續(xù)攪拌10h，得載藥納米粒分散液，納米激光粒度儀測(cè)定納米粒粒徑分布。3000r/min(rcf1018×g)離心5min，除去未負(fù)載上的利福平，冷凍干燥20h，得到載藥共聚酯納米粒。③共聚酯分子量測(cè)定共聚酯分子量測(cè)定與前述的gpc測(cè)定pgdl的分子量的方法一致。④載藥納米粒的體外釋放實(shí)驗(yàn)及動(dòng)力學(xué)模型分析(a)利福平標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱取30.0mg利福平，用少量0.020mph7.4磷酸鹽緩沖液(加入0.5％v/v的tween-80)(以下簡(jiǎn)稱緩沖液)溶解后，于500ml容量瓶中以緩沖液定容，配制成質(zhì)量濃度60μg/ml的利福平溶液。分別移取0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml上述溶液于10ml容量瓶中，以緩沖液定容，配制為3μg/ml、6μg/ml、9μg/ml、12μg/ml、15μg/ml的5-fu溶液。于258nm處測(cè)定吸光度a，并進(jìn)行回歸分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。y＝0.0592x-0.002，r2＝0.999。(b)藥物負(fù)載率及包封率測(cè)定稱取一定量載藥共聚酯納米粒，加二甲基亞砜(dmso)溶解后，10000r/min(rcf10280×g)離心30min，使納米粒破碎，藥物完全從納米粒中釋放出來(lái)，取上清液少許，稀釋后，測(cè)定吸光度a。負(fù)載利福平納米粒的負(fù)載率及包封率測(cè)定均在避光條件下進(jìn)行。根據(jù)公式(1)、公式(2)分別計(jì)算共聚酯納米粒的載藥率及包封率。(c)藥物的體外釋放精密稱取載藥共聚酯納米粒50mg于一端封口的透析袋(截留mw﹥1000)中，加入5ml緩沖液，密封夾封口，置于裝有150ml緩沖液的250ml燒杯中，37℃下攪拌，每隔一定時(shí)間取燒杯中透析袋外緩沖液5ml，再補(bǔ)加5ml新鮮緩沖液，取出的含利福平緩沖液2ml于比色皿中以緩沖液稀釋至3ml，測(cè)定吸光度a。利福平的體外釋放均在避光條件下進(jìn)行。利福平的累計(jì)釋放率按照公式(3)的方法計(jì)算。(d)動(dòng)力學(xué)模型分析peppas經(jīng)驗(yàn)方程，higuchi模型及平均釋放時(shí)間(mdt)均以動(dòng)力學(xué)模型分析公式計(jì)算。分析檢測(cè)結(jié)果(1)pgdl分子量分布用凝膠滲透色譜法(gpc)測(cè)定上述實(shí)施例1-15所制備聚酯的分子量分布，參見表1所示。表1不同實(shí)施條件下的產(chǎn)物分子量及多分散系數(shù)d實(shí)施例gdl與鈦酸四丁酯質(zhì)量比mnmwd125:22.42×1045.43×1042.24250:31.73×1044.19×1042.43325:11.40×1041.58×1041.13450:10.45×1040.65×1041.45510:10.90×1041.84×1042.05從表1中可以看出，不同配比的單體與催化劑條件下，所制備的產(chǎn)品分子量(mn、mw為例)以及多分散系數(shù)d也不相同，催化劑選用鈦酸四丁酯、引發(fā)劑選用乙二醇時(shí)，單體gdl可以通過(guò)接枝共聚反應(yīng)得到pgdl；而在聚合過(guò)程中，當(dāng)單體gdl添加量明顯高于催化劑量時(shí)，聚合度偏低，分散系數(shù)較大，以實(shí)施例4為例，可以看出，其分子量分布即多分散系數(shù)d雖然不是很大，但數(shù)均分子量和重均分子量低于1×104(參見實(shí)施例4)；對(duì)比實(shí)施例2和4、實(shí)施例1和3可以看出，相同單體添加量和反應(yīng)條件下，增加催化劑的含量，則數(shù)均分子量和重均分子量均得到明顯提高，但相應(yīng)的多分散系數(shù)d也增加顯著；對(duì)比實(shí)施例3-5可以看出，相同催化劑添加量和反應(yīng)條件下，當(dāng)單體gdl逐漸由低增高時(shí)，數(shù)均分子量逐漸增加，重均分子量和多分散系數(shù)則逐漸降低，當(dāng)單體添加量與催化劑量質(zhì)量比在15:1-30:1，尤其是當(dāng)單體添加量與催化劑量質(zhì)量比在25:1，數(shù)均分子量和重均分子量分布相對(duì)較為一致，其多分散系數(shù)在1.0左右；繼續(xù)增加單體量，則數(shù)均分子量和重均分子量差距再次加大，對(duì)應(yīng)的多分散系數(shù)也增大至2左右。pgdl-cl共聚酯分子量測(cè)定與前述的gpc測(cè)定pgdl的分子量的方法一致。(2)單體及共聚產(chǎn)物pgdl賀詞共振譜圖分析對(duì)單體及聚合產(chǎn)物pgdl進(jìn)行核磁共振h譜圖分析(1hnmr分析，以實(shí)施例3為例)，具體參見圖1，單體gdl的1hnmr中，δ4.7-6.0的三處波峰均歸屬為gdl游離氫，根據(jù)圖1中g(shù)dl上的c位標(biāo)號(hào)，c5(δ4.00，m，1h)，c2(δ3.79-3.77，d，1h)，c3(δ3.57-3.56，1h)，c4(δ3.67-3.64，1h)，c6(δ3.53-3.50，2h)。gdl聚合生成pgdl后，內(nèi)酯環(huán)打開，c5,c4,c6,c9(δ3.38)，c2,c8,c11(δ4.25-4.20)，c3(δ3.99)，c10,c12(δ3.91)，c14(δ5.58)，c15(δ5.44)，c16,c17(δ5.04)，c18(δ4.63)，thf溶劑峰(δ3.60)。(3)pgdl紅外光譜分析對(duì)單體以及制備的聚酯及其納米粒做紅外光譜分析(ftir分析)，檢測(cè)分析得圖2與圖3，結(jié)果表明：gdl開環(huán)聚合生成pgdl后，在高波數(shù)(圖2)區(qū)，gdl多個(gè)羥基峰消失，在3390cm-1處形成單一強(qiáng)寬峰，2965cm-1-2859cm-1峰強(qiáng)及位移相應(yīng)發(fā)生變化，合并為在2932cm-1處的峰；在低波數(shù)區(qū)(圖3)，出現(xiàn)在1727cm-1處的gdl羰基峰經(jīng)聚合后遷移到1744cm-1處，在1109cm-1-1025cm-1處的c-o峰合并為在1076cm-1的強(qiáng)峰。pgdl的ftir譜圖中出現(xiàn)在1646cm-1處的波峰為殘留dmf的羰基峰。(4)pgdl電鏡測(cè)試分析對(duì)所制備的納米粒進(jìn)行電鏡測(cè)試，參見圖4和圖5，結(jié)果表明：聚酯納米粒顆粒均勻，基本保持在5nm左右。(5)5-fu標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制5-fu標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取25.0mg5-fu用少量0.020mph7.4磷酸鹽緩沖液溶解后，于500ml容量瓶中以磷酸鹽緩沖液定容，配制成質(zhì)量濃度50μg/ml的5-fu溶液。分別移取0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml上述溶液于10ml容量瓶中，以磷酸鹽緩沖液定容，配制為2.5μg/ml、5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、12.5μg/ml、15μg/ml的5-fu溶液。于267nm處測(cè)定吸光度a，并進(jìn)行回歸分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。y＝0.0508x+0.0023，r2＝0.9997。(6)藥物釋放測(cè)試載藥率及包封率測(cè)試：稱取一定量載藥pgdl納米粒，乙醇溶解后，10000r/min離心30min，使納米粒破碎，5-fu完全從納米粒中釋放出來(lái)，取上清液少許，稀釋后，測(cè)定吸光度a。根據(jù)式(1)、式(2)分別計(jì)算pgdl納米粒的載藥率及包封率。載藥率＝納米粒中藥物量/載藥納米粒總量×100％(1)包封率＝納米粒中藥物量/投藥量×100％(2)藥物釋放動(dòng)力學(xué)測(cè)試：精密稱取載藥pgdl納米粒45.0mg于一端封口的透析袋(截留mw﹥1000)中，加入5mlph7.4磷酸緩沖液(pbs)，密封夾封口，置于裝有150mlpbs的250ml燒杯中，37℃下攪拌，每隔一定時(shí)間取燒杯中透析袋外pbs5ml，再補(bǔ)加5ml新鮮pbs，取出的pbs于比色皿中稀釋3倍后測(cè)定吸光度a。用以下公式用于計(jì)算5-fu的累計(jì)釋放量：mt為累積釋放量，v為釋放池中溶液的體積，ρn是第n次取緩釋溶液時(shí)所測(cè)得的吸光度對(duì)應(yīng)的濃度，ρi是第i次取緩釋溶液時(shí)所測(cè)得的吸光度對(duì)應(yīng)的濃度，vi是每次取緩釋溶液的體積。負(fù)載5-fu的pgdl納米粒在ph7.4與ph6.5的體外釋放結(jié)果參見圖6，結(jié)果表明：載藥pgdl納米粒在ph6.5磷酸緩沖液中的釋放操作與在ph7.4中的釋放一致。peppas經(jīng)驗(yàn)方程lnmt＝nlnt+c(4)可用于描述釋放機(jī)理未知的過(guò)程，以lnmt對(duì)lnt作圖，所得斜率為n。其中mt是藥物釋放時(shí)的累積釋放量，c是動(dòng)力學(xué)常數(shù)，t是釋放時(shí)間，n是藥物釋放指數(shù)。精密稱取載藥pgdl納米粒9mg在5ml乙醇中超聲分散30min，10000r/min離心30min，取上清液1ml用乙醇稀釋至10ml，測(cè)吸光度a。測(cè)得吸光度為0.71403，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝0.0508x+0.0023及式(1)與式(2)，得出載藥率為7.7836％，包封率為70.05％(參見圖7和表2)。表2peppas方程分析5-fu釋放過(guò)程peppas方程擬合曲線相關(guān)系數(shù)r2納米粒在ph6.5下的體外釋放y＝0.7769x+7.12380.9655納米粒在ph7.4下的體外釋放y＝0.6163x+6.62760.9915從圖7和表2可以看出，載藥納米粒在ph7.4中的釋放曲線較平緩，無(wú)明顯突釋現(xiàn)象，且釋放時(shí)間較長(zhǎng)。直線斜率即其釋放指數(shù)n為0.6163。根據(jù)peppas經(jīng)驗(yàn)公式，藥物釋放指數(shù)0.45<n<0.89，其輸送機(jī)理遵循非fick傳輸機(jī)理，釋放過(guò)程中存在著藥物的擴(kuò)散和聚合物鏈的弛豫的共同作用，且5-fu的釋放機(jī)制符合peppas方程。載藥納米粒在ph6.5中的釋放較快，納米粒的顏色在0.5h后逐漸變淡，說(shuō)明納米粒在此ph下可能存在降解。(7)負(fù)載5-fu載藥納米粒的生物相容性測(cè)試?yán)蒙鲜鰧?shí)施例制備所得納米粒，進(jìn)行生物相容性實(shí)驗(yàn)：①未標(biāo)記的空白納米粒的制備：選取狀態(tài)良好的ovcar-3細(xì)胞以4×104cell/ml接種于96孔板中，于37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，將聚酯納米粒以dmem培養(yǎng)基稀釋成具有一定梯度的濃度，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，各取200ul加入小孔中，平行樣品做六個(gè)，對(duì)照組加入200μldmem培養(yǎng)基，于37℃﹑5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取出后，每孔加入10μlmtt(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，去除上清，每孔加入150μldmso，100r/min震蕩10min，酶標(biāo)儀570nm測(cè)定吸光度a。根據(jù)式(5)計(jì)算納米粒的細(xì)胞活性。細(xì)胞活性(％)＝(a-a空白)/(a對(duì)照-a空白)×100％(5)根據(jù)改良寇氏法計(jì)算納米粒對(duì)ovcar-3細(xì)胞的50％抑制濃度(ic50)，如式(6)。lgic50＝xm-i(p-(3-pm-pn)/4)(6)xm＝lg(最大劑量)，i＝lg(最大劑量/相鄰劑量)，p＝陽(yáng)性反應(yīng)率之和，pm＝最大陽(yáng)性反應(yīng)率，pn＝最小陽(yáng)性反應(yīng)率。②熒光分子羅丹明123標(biāo)記的pgdl納米粒的制備：羅丹明123(r-123)溶于4ml水相中，其余操作與前述空白納米粒制備方法相同，制備得到r-123標(biāo)記pgdl納米粒。將制備的納米粒以dmem培養(yǎng)基稀釋，配成濃度為50μg/ml的溶液，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。選取狀態(tài)良好的ovcar-3細(xì)胞以4×104cell/ml接種于96孔板中，于37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，加入用dmem培養(yǎng)基分散的r-123標(biāo)記pgdl納米粒溶液，分別培養(yǎng)0.5h、1h、2h后，用pbs洗滌3次，熒光顯微鏡觀測(cè)。對(duì)比pgdl納米粒載藥前后的細(xì)胞活性，參見圖8，空白pgdl納米粒ic50為4587±58μg/ml，說(shuō)明pgdl納米粒的細(xì)胞毒性極小，生物相容性好，載藥pgdl納米粒ic50為1556±34μg/ml，負(fù)載5-fu后的pgdl納米粒對(duì)ovcar-3細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抑制作用。結(jié)合圖9，pgdl納米粒與ovcar-3細(xì)胞本身無(wú)熒光，熒光標(biāo)記的pgdl納米粒與ovcar-3細(xì)胞共孵化后，細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度與孵化時(shí)間相關(guān)，在0.5h-2h時(shí)間內(nèi)，孵化時(shí)間越長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，且在孵化0.5h時(shí)，細(xì)胞即表現(xiàn)出一定的熒光強(qiáng)度，表明ovcar-3細(xì)胞對(duì)pgdl納米粒有很強(qiáng)的親和性。細(xì)胞對(duì)納米粒的親和性強(qiáng)，說(shuō)明納米粒被ovcar-3細(xì)胞攝取幾率高，有利于藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放，提高藥物的生物利用率。(7)pgdl-cl共聚酯分子量測(cè)定（7）pgdl-cl共聚酯分子量測(cè)定本實(shí)施例所合成的gdl與cl共聚的產(chǎn)物pgdl-cl結(jié)構(gòu)式可表示為：。pgdl支鏈與pcl上開環(huán)出現(xiàn)的功能官能團(tuán)通過(guò)酯化接枝，達(dá)到共聚的目的。將均聚產(chǎn)物pgdl與共聚產(chǎn)物pgdl-cl以d6-dmso溶解后測(cè)定1hnmr。對(duì)圖10中樣品出峰區(qū)間進(jìn)行積分，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算數(shù)均分子量(mn)、重均分子量(mw)和多分散系數(shù)(d)，如表3所示。表3共聚酯分子量測(cè)定結(jié)果峰值/minmnmwd8.60522.63×1043.30×1041.26由圖10及表3，可知，共聚酯數(shù)均分子量(mn)為2.63×104，表明pgdl與pcl共聚后分子量較第二章中的均聚pgdl分子量增大，且gpc測(cè)定結(jié)果僅出現(xiàn)一個(gè)單峰，說(shuō)明共聚酯的分子量分布較均勻。(8)pgdl-cl共聚酯的1hnmr與ftir表征pgdl、pcl及pgdl-cl通過(guò)溴化鉀壓片法測(cè)定ftir，具體參見圖11和圖12，圖中，a表示pgdl，b表示pgdl-cl共聚酯。pgdl及共聚酯的1hnmr分析如圖11，gdl與cl共聚后，pgdl上的4、5、6、9位與24號(hào)位峰重合，峰增強(qiáng)，共聚酯的譜圖上在δ1.5及2.3左右出現(xiàn)cl的特征直鏈c-h峰，c20(δ2.28)，c21,23(δ1.50-1.54)，c22(δ1.29)，c4,5,6,9,24(δ3.36-3.38)。圖中標(biāo)有“﹡”的位移處為殘留溶劑峰，thf(δ1.76與δ3.60)，dmf(δ2.73與δ2.89)。pcl、pgdl及共聚酯的ftir分析如圖12，與pcl及前述pgdl的紅外譜圖對(duì)比，pgdl-pcl在2000cm-1以上高波數(shù)區(qū)，pgdl的3390cm-1處強(qiáng)寬峰遷移至3423cm-1處，2932cm-1甲基、亞甲基峰由于pcl的存在明顯增強(qiáng)，在2000cm-1以下低波數(shù)區(qū)，1207cm-1處峰增強(qiáng)，可歸屬到pcl的c-o峰。共聚酯ftir譜圖中出現(xiàn)在1652cm-1處的波峰為dmf的羰基峰。由1hnmr及ftir分析可得，gdl與cl發(fā)生了共聚，生成共聚產(chǎn)物pgdl-cl。(9)pgdl-cl共聚酯納米粒在水中分散時(shí)的粒徑測(cè)定共聚酯納米粒在水中的粒徑分布如圖13，載藥前納米粒粒徑分布x10＝127.15nm，x50＝150.52nm，x90＝177.48nm，多分散指數(shù)d＝(x90-x10)/x50＝0.334。載藥后納米粒粒徑分布x10＝149.28nm，x50＝174.00nm，x90＝202.55nm，多分散指數(shù)d＝0.306。由載藥前后粒徑分布狀態(tài)可知，納米粒粒徑分布較均勻，且載藥后粒徑略有所增大。(10)pgdl-cl共聚酯納米粒的tem表征由共聚酯納米粒的粒徑分布圖13及tem電鏡圖14，分析可得，納米粒冷凍干燥后，粒徑尺寸有一定程度的縮小，粒徑范圍在50-110nm，這是由于納米粒具有親水性較強(qiáng)的鏈段pgdl，使其在水中分布時(shí)出現(xiàn)吸水膨脹，粒徑增大。(11)載藥共聚酯納米粒的體外釋放及動(dòng)力學(xué)模型分析①載藥量與包封率的測(cè)定精密稱取載藥共聚酯納米粒10mg在5mldmso中超聲分散30min，10000r/min(rcf10280×g)離心30min，取上清液1ml用dmso稀釋至10ml，測(cè)吸光度a。測(cè)得吸光度為0.2933，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝0.0592x-0.002及公式(1)與式(2)，得出載藥率為2.494％，包封率為52.38％。②載藥共聚酯納米粒的體外釋放及動(dòng)力學(xué)模型分析如圖15、16與圖17，藥物的釋放曲線較平緩，且釋放時(shí)間較長(zhǎng)。peppas方程中，直線斜率即其釋放指數(shù)n為0.4867。由藥物釋放指數(shù)0.45<n<0.89，其輸送機(jī)理遵循非fick傳輸機(jī)理，釋放過(guò)程中存在著藥物的擴(kuò)散和聚合物鏈的弛豫的共同作用。對(duì)比peppas方程與higuchi方程對(duì)藥物體外釋放的模擬曲線，利福平的釋放機(jī)制更符合higuchi方程。③藥物的平均釋放時(shí)間(mdt)計(jì)算mdt是藥物分子在釋放之前停留在骨架片中的時(shí)間總和除以總分子數(shù)，其計(jì)算為公式(7)：其中，n和k是peppas方程的常數(shù)：ln(mt/m∞)＝nlnt+lnk公式(8)mt是藥物釋放在t時(shí)刻的累積釋放量，m∞是藥物釋放在t＝∞時(shí)的累積釋放量(最終的累積釋放量)。上述公式(8)可改寫為lnmt＝nlnt+ln(km∞)公式(9)因此，以lnmt對(duì)lnt作圖，所得截距c(動(dòng)力學(xué)常數(shù))＝ln(km∞)。利福平從共聚酯納米粒中的最終累積釋放量m∞＝2.38mg，平均釋放時(shí)間(mdt)、動(dòng)力學(xué)常數(shù)(c)和釋放指數(shù)(n)可以根據(jù)公式(7)、(4)、(9)計(jì)算得到，結(jié)果見表4。可見，利福平的平均釋放時(shí)間有35.66小時(shí)。表4利福平從共聚酯納米粒中的平均釋放時(shí)間(mdt)物理量cknmdt/h載藥共聚酯納米粒中利福平釋放5.48020.10080.489735.66本實(shí)施例在pgdl聚合的基礎(chǔ)上，引入可生物降解疏水鏈pcl鏈段，形成共聚酯，并在水中自組裝成納米粒，對(duì)制備的共聚酯及其納米粒進(jìn)行了表征，以利福平為模型藥物，研究了在緩沖液中的體外釋放動(dòng)力學(xué)。結(jié)果表明，pgdl-pcl共聚酯聚合成功，由其形成的納米粒粒徑在50-110nm范圍，負(fù)載利福平后，其體外釋放顯示出良好的緩釋性能，且平均釋放時(shí)間達(dá)到35h。說(shuō)明該共聚酯納米粒為負(fù)載難溶性藥物提供了較好的載藥平臺(tái)。以上內(nèi)容是結(jié)合本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)所提供技術(shù)方案所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明創(chuàng)造具體實(shí)施只局限于上述這些說(shuō)明，對(duì)于本發(fā)明創(chuàng)造所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12