本發(fā)明涉及一種用于培養(yǎng)干細(xì)胞的試劑盒，尤其是涉及一種用于原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,mscs)是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在一定的條件下可分化成脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。mscs起源于中胚層和外胚層，最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)研究證實(shí)，脂肪、肌肉、真皮、外周血、臍帶血、胎盤中也發(fā)現(xiàn)mscs。除此之外，mscs還具有支持造血、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)的功能，其獨(dú)特的生物學(xué)特性及其臨床應(yīng)用越來越受到人們的重視，現(xiàn)在已成為多種疾病細(xì)胞治療的首選。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells,uc-mscs)是從臍帶的不同部位如靜脈內(nèi)皮、內(nèi)皮下層、華通膠、血管及周圍組織分離得到的一種間充質(zhì)干細(xì)胞。臍帶mscs存在很多優(yōu)勢：1、取材方便，臍帶為分娩后的廢棄物，不涉及社會、倫理及法律方面的諸多爭論；2、由于臍帶免疫系統(tǒng)的原始性，降低了臍帶mscs移植后受體的排斥反應(yīng)。3、自我更新能力強(qiáng)；4、臍帶mscs能夠分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，具有良好的可塑性。5、臍帶mscs具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以抑制抗原遞呈細(xì)胞的成熟和反應(yīng)性t淋巴細(xì)胞的增殖。因此，臍帶mscs是未來細(xì)胞治療及基因治療最具潛力的種子細(xì)胞。因此，如何獲得符合臨床治療標(biāo)準(zhǔn)的臍帶mscs是目前研究的重點(diǎn)。

目前市面上在售的臍帶mscs的培養(yǎng)基很多，主要是含有胎牛血清的培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。胎牛血清成分較復(fù)雜，批次間不穩(wěn)定，不容易質(zhì)控，容易引入外源病毒污染，培養(yǎng)的細(xì)胞容易老化，成本也較高。雖然市面上有在售的無血清培養(yǎng)基，但是存在原代增殖慢，細(xì)胞數(shù)量少，容易老化的問題，這些都嚴(yán)重影響了臍帶mscs的研究和臨床應(yīng)用。因此，開發(fā)一種方便、安全、增殖快、成本較低且用于原代培養(yǎng)臍帶mscs的無血清培養(yǎng)基迫在眉睫并有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種用于原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒。

本發(fā)明所述的用于原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒包括臍帶洗滌液、包被液和細(xì)胞原代培養(yǎng)基；其特征在于：所述臍帶洗滌液是含有100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的生理鹽水或ph7.4的pbs緩沖液；所述包被液是含0.1～1.5g/100ml纖粘連蛋白的生理鹽水溶液或含0.1～0.5g/100mliv型膠原的生理鹽水溶液；所述細(xì)胞原代培養(yǎng)基是以含有1～4mml-谷氨酰胺的α-mem培養(yǎng)基為基液添加5～50μg/ml人胰島素、0.1～5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、0.5～5mg/ml人血清白蛋白、100～1000μg/ml維生素c、0.1～10μg/ml海藻糖、10～200ng/ml表皮生長因子(egf)、10～200ng/ml血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、1～100ng/ml人重組白細(xì)胞介素-3(il-3)的培養(yǎng)液。

上述用于原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒中：所述包被液優(yōu)選是含0.5g/100ml纖粘連蛋白的生理鹽水溶液或含0.2g/100mliv型膠原的生理鹽水溶液；所述細(xì)胞原代培養(yǎng)基優(yōu)選是以含有2mml-谷氨酰胺的α-mem培養(yǎng)基為基液添加10～30μg/ml人胰島素、0.2～1μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、1～3mg/ml人血清白蛋白、200～800μg/ml維生素c、1～5μg/ml海藻糖、20～100ng/ml表皮生長因子(egf)、20～100ng/ml血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、5～50ng/ml人重組白細(xì)胞介素-3(il-3)的培養(yǎng)液。

進(jìn)一步的，上述細(xì)胞原代培養(yǎng)基優(yōu)選是以含有2mml-谷氨酰胺的α-mem培養(yǎng)基為基液添加15μg/ml人胰島素、0.5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、2mg/ml人血清白蛋白、500μg/ml維生素c、2μg/ml海藻糖、50ng/ml表皮生長因子(egf)、50ng/ml血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、25ng/ml人重組白細(xì)胞介素-3(il-3)的培養(yǎng)液。

上述的用于原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒中，所述包被液的使用方法是：培養(yǎng)前先將包被液加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，鋪滿培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的底壁，37℃孵育30～60分鐘，細(xì)胞接種前5分鐘吸出棄掉包被液。

本發(fā)明所述的用于原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒在組織塊貼壁法分離并原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用。

本發(fā)明公開的用于原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，包括了臍帶洗滌液、包被液和細(xì)胞原代培養(yǎng)基，可以完成從臍帶預(yù)處理到分離、接種、培養(yǎng)的一系列過程，操作方便、安全、增殖快、成本較低。與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)勢和效果：

(1)細(xì)胞原代培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)體系，培養(yǎng)出的臍帶mscs增殖快、不易老化，傳代30代以上仍能保持干細(xì)胞的分化能力和增殖能力。無血清培養(yǎng)避免了引入動物來源的血清，減少了外源病毒的污染。

(2)細(xì)胞原代培養(yǎng)基中各成分穩(wěn)定，組成和來源明確，便于質(zhì)控；不添加任何抗生素，更加符合臨床試驗(yàn)和治療標(biāo)準(zhǔn)。

(3)細(xì)胞原代培養(yǎng)基中添加了人重組白細(xì)胞介素-3，可以明顯促進(jìn)臍帶mscs的增殖活性。

(4)包被液的應(yīng)用，使臍帶mscs貼壁效果更好，利于臍帶mscs的生長和增殖。

附圖說明

圖1為不同無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代臍帶mscs的形態(tài)比較。

其中：a為試劑盒一培養(yǎng)的原代臍帶mscs的形態(tài)；b為試劑盒二培養(yǎng)的原代臍帶mscs的形態(tài)；c為市面上在售的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代臍帶mscs的形態(tài)。

圖2為不同無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代臍帶mscs的生長曲線。

其中：a為試劑盒一培養(yǎng)的原代臍帶mscs的生長曲線；b為試劑盒二培養(yǎng)的原代臍帶mscs的生長曲線；c為市面上在售的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代臍帶mscs的生長曲線。

具體實(shí)施方式

說明：如下實(shí)施例α-mem培養(yǎng)基(改良型，含l-谷氨酰胺)購自hyclone公司，產(chǎn)品貨號sh30265.01b；青霉素-鏈霉素溶液購自碧云天生物，產(chǎn)品貨號c0222。試劑如未規(guī)定廠家，均為常規(guī)市售產(chǎn)品。

實(shí)施例1：試劑盒一的制備

1.臍帶洗滌液：取99體積份(單位：ml)的生理鹽水，1體積份(單位：ml)的100×的青霉素-鏈霉素溶液(終濃度分別為100u/ml和100μg/ml)，混勻。配制完常溫保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.包被液：稱取0.5g纖粘連蛋白溶于100ml生理鹽水，充分溶解，0.22μm過濾除菌，分裝，4℃保存。細(xì)胞鋪板前，每個t75cm²瓶加入5ml配制好的0.5g/100ml的纖粘連蛋白，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使溶液覆蓋整個培養(yǎng)瓶的底部，放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱放置30～60分鐘。細(xì)胞接種前5分鐘，將培養(yǎng)瓶的包被液吸出，棄掉。

3.細(xì)胞原代培養(yǎng)基：

(1)按照說明書方法溶解人胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、人血清白蛋白、維生素c、海藻糖、表皮生長因子(egf)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、人重組白細(xì)胞介素-3(il-3)，配制儲存液，-20℃保存。

(2)培養(yǎng)基配制：向α-mem基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終濃度10μg/ml人胰島素、5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、5mg/ml人血清白蛋白、300μg/ml維生素c、0.1μg/ml海藻糖、10ng/ml表皮生長因子(egf)、10ng/ml血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、100ng/ml人重組白細(xì)胞介素-3(il-3)，混勻，0.22μm過濾除菌，4℃保存。

實(shí)施例2：試劑盒二的制備

1.臍帶洗滌液：99體積份(單位：ml)的ph7.4的pbs緩沖液，1體積份(單位：ml)的100×的青霉素-鏈霉素溶液(終濃度分別為100u/ml和100μg/ml)，混勻。配制完常溫保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.包被液：稱取0.2giv型膠原溶于100ml生理鹽水，充分溶解，0.22μm過濾除菌，分裝，4℃保存。細(xì)胞鋪板前，每個t75cm²瓶加入5ml配制好的0.2g/100ml的iv型膠原，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使溶液覆蓋整個培養(yǎng)瓶的底部，放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱放置30～60分鐘。細(xì)胞接種前5分鐘，將培養(yǎng)瓶的包被液吸出，棄掉。

3.細(xì)胞原代培養(yǎng)基：

(1)按照說明書方法溶解人胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、人血清白蛋白、維生素c、海藻糖、表皮生長因子(egf)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、人重組白細(xì)胞介素-3(il-3)，配制儲存液，-20℃保存。

(2)培養(yǎng)基配制：向α-mem基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終濃度15μg/ml人胰島素、0.5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、2mg/ml人血清白蛋白、500μg/ml維生素c、2μg/ml海藻糖、50ng/ml表皮生長因子(egf)、50ng/ml血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、25ng/ml人重組白細(xì)胞介素-3(il-3)，混勻，0.22μm過濾除菌，4℃保存。

實(shí)施例3：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)

1.取三個新的t75cm²培養(yǎng)瓶，一個瓶子包被試劑盒一的包被液，標(biāo)記為a；一個瓶子包被試劑盒二的包被液，標(biāo)記為b；一個瓶子不做任何處理，標(biāo)記為c。將三個瓶子放置到37℃、5％co2培養(yǎng)箱放置30分鐘。細(xì)胞接種前5分鐘，將培養(yǎng)瓶的包被液吸出，棄掉。

2.用鑷子將臍帶從離心管中取出，放到無菌容器內(nèi)。加入臍帶洗滌液，充分洗滌臍帶，直至將臍帶上的臍血或污物沖洗干凈。

3.用剪刀將臍帶剪成約3～5cm的小段。將臍靜脈、動脈和羊膜從臍帶中剝離干凈，取出華通膠部分放置到新的離心管中。

4.用剪刀將華通剪充分剪碎至約1mm³大小。

5.取出三個培養(yǎng)瓶，用移液管將華通膠平均轉(zhuǎn)移至3個培養(yǎng)瓶中，將組織塊均勻的鋪滿培養(yǎng)瓶內(nèi)。標(biāo)記操作人、編號和日期，將細(xì)胞放入37℃、5％co2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。

6.第二天，將試劑盒一、試劑盒二中的細(xì)胞原代培養(yǎng)基和市面上購買的普通無血清培養(yǎng)基從4℃冰箱取出，37℃放置20～30min。

7.用移液管吸取15ml預(yù)熱的培養(yǎng)基分別加到三個培養(yǎng)瓶中，試劑盒一的培養(yǎng)基加入到a瓶，試劑盒二的培養(yǎng)基加入到b瓶，普通無血清培養(yǎng)基加入到c瓶，輕輕來回翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使培養(yǎng)基覆蓋整個組織塊平面。

8.將細(xì)胞放入37℃、5％co2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天更換對應(yīng)的培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長情況。

9.培養(yǎng)第10-14天細(xì)胞融合度可達(dá)到70～80％，此為p0代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

10.倒置顯微鏡下觀察結(jié)果：

培養(yǎng)的臍帶mscs貼壁良好，可見貼壁生長的細(xì)胞集落，形態(tài)與骨髓mscs相似，多為長梭形或紡錘形細(xì)胞，多以平行或漩渦狀生長，細(xì)胞折光性好，核仁明顯，呈現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞(圖1)，試劑盒二的試劑培養(yǎng)的臍帶mscs數(shù)目比試劑盒一和普通無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目多，形態(tài)較為均一(圖1b)。

實(shí)施例4：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長曲線測定

1.實(shí)施例3得到的原代臍帶mscs，待細(xì)胞融合度達(dá)到70～80％時，收集細(xì)胞。

2.加入預(yù)熱的0.25％胰蛋白酶-edta，室溫下消化1～2min。顯微鏡下觀察細(xì)胞皺縮、變圓。

3.立即加入對應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，輕輕晃動瓶底，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞到一新的離心管中，混勻后，取0.2ml細(xì)胞使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)和檢測細(xì)胞活力。

4.將離心管配平，1200rpm/min離心10min，棄掉上清液，加入對應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

5.調(diào)整細(xì)胞密度為2×10⁴/ml，接種到96孔板中，每孔200μl，設(shè)6個復(fù)孔。對照組加入200μl細(xì)胞培養(yǎng)基，設(shè)6個復(fù)孔。一共鋪8塊96孔板，放置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

6.第1～8天每天隨機(jī)取出一塊96孔板，用移液槍向每孔加入20μlcck-8試劑，輕輕晃動培養(yǎng)板，混勻。

7.將該培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，0.5、1、2、4小時后分別用酶標(biāo)儀(450nm)檢測吸光度，然后選取吸光度范圍比較合適的一個時間點(diǎn)用于后續(xù)試驗(yàn)。

8.之后每天同一時間取出96孔板進(jìn)行cck-8檢測，連續(xù)觀察8天。

9.以時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

10.結(jié)果顯示，細(xì)胞在第1～2天處于潛伏期，增殖較慢，從第3天開始，進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞快速增殖，第6天細(xì)胞進(jìn)入平臺期，增殖緩慢(圖2)。

應(yīng)用本發(fā)明公開的用于原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒培養(yǎng)的臍帶mscs細(xì)胞生長迅速，增殖較快，細(xì)胞數(shù)量也高于普通無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，表明細(xì)胞活力較高(圖2)，其中試劑盒二所培養(yǎng)的臍帶mscs細(xì)胞增殖速度明顯快于試劑盒一。