本發(fā)明屬于微生物體外核酸檢測領(lǐng)域，具體涉及一種特異性檢測單純皰疹病毒ⅰ、ⅱ型核酸的熒光pcr方法及試劑盒，能夠?qū)渭儼捳畈《劲⌒秃廷⑿偷膁na進(jìn)行定性檢測，可以作為有效的檢測工具。
背景技術(shù)：
：單純皰疹病毒(herpessimplexviruses，hsv)屬皰疹病毒科，病毒顆粒直徑約180納米，人類是單純皰疹病毒唯一的自然宿主。同時，單純皰疹病毒主要分兩型，即單純皰疹病毒ⅰ型(hsv1)和單純皰疹病毒ⅱ型(hsv2)。hsv1主要引起生殖道以外的口腔、皮膚、粘膜或其他器官感染，而hsv2主要引起生殖道感染。孕婦在孕程的早中晚期的首次感染對胎兒均有嚴(yán)重影響，可導(dǎo)致流產(chǎn)，發(fā)育遲緩，先天性畸形，智力障礙，視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎等。大多數(shù)新生兒感染是因為陰道分娩受染，雖然出生時外表可正常，但產(chǎn)后3周內(nèi)逐漸出現(xiàn)癥狀：一是在皮膚、口腔、眼結(jié)合膜處等出現(xiàn)皰疹；二是中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，顱內(nèi)壓增高，抽搐等；三是全身性彌散型，表現(xiàn)為黃疸，肝炎，肺炎等。未經(jīng)及時治療的新生兒單純皰疹病毒感染，有很大概率導(dǎo)致死亡或有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。目前，臨床實驗室檢測多采用血清學(xué)試驗，如elisa、ria和ifa等，檢測特異性抗體。血清單純皰疹病毒-igm陽性證明近期感染己持續(xù)2～4個月。血清單純皰疹病毒-igg陽性則提示既往感染。由于單純皰疹病毒抗原來源困難，血清學(xué)試驗尚難普及，而且某些人群感染病毒后抗體反應(yīng)很弱或不產(chǎn)生抗體，因此僅以抗體檢測結(jié)果不能準(zhǔn)確判定單純皰疹病毒感染情況，需輔以抗原或核酸檢測結(jié)果作為診斷和治療的依據(jù)。目前比較成熟的核酸檢測方法是用熒光pcr方法，該方法克服了常規(guī)pcr法特異性差、易污染、結(jié)果分析操作步驟多等缺點(diǎn)，采用taqman方法或稱雙標(biāo)探針法(熒光淬滅探針或稱fq探針)，即在其5’端和3’端分別標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)和一個淬滅基團(tuán)。靶序列的特異性探針和特異性的pcr引物同時使用，設(shè)計的該探針在上下游pcr引物的范圍內(nèi)退火，由三個寡核苷酸共同結(jié)合于目的基因片段，使其特異性大大增強(qiáng)。在pcr的延伸階段，taqdna聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性將熒光報告基團(tuán)從探針上切割下來。隨著pcr循環(huán)數(shù)的增加，游離報告基團(tuán)的數(shù)量不斷的增加，實時檢測從游離熒光基團(tuán)上釋放的熒光信號，從而對靶序列進(jìn)行定性分析。該pcr反應(yīng)在封閉系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行，分析結(jié)果也無需開封，因此，避免了pcr產(chǎn)物污染的發(fā)生。目前，也有熒光pcr方法用于檢測單純皰疹病毒的報道，但是開發(fā)更多有效、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)的熒光pcr方法用的引物和探針，并將此引物和探針用于檢測試劑盒也是本領(lǐng)域追求的目標(biāo)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性檢測單純皰疹病毒ⅰ型和ⅱ型核酸的熒光pcr試劑盒，該試劑盒具有靈敏、特異和高效率的特點(diǎn)，從而實現(xiàn)檢測樣本中單純皰疹病毒的核酸，實現(xiàn)定性的目的。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種特異性檢測單純皰疹病毒ⅰ、ⅱ型核酸的熒光pcr試劑盒，包括單純皰疹病毒ⅰ型特異性引物對和熒光探針、單純皰疹病毒ⅱ型特異性引物對和熒光探針，所述的單純皰疹病毒ⅰ型特異性引物對和熒光探針如下：正向引物：5’-ccccgctggaactactatgaca-3’反向引物：5’-tccgtccagtcgtttatcttca-3’熒光探針：5’-acgcccccgcgtttgagacc-3’；所述的單純皰疹病毒ⅱ型特異性引物對和熒光探針如下：正向引物：5’-aagctcccgctaaggacatg-3’反向引物：5’-ggtgctgatgataaagaggatatctaga-3’熒光探針：5’-aacacatccccctgttctggttcctaacg-3’。所述的單純皰疹病毒ⅰ型熒光探針、單純皰疹病毒ⅱ型熒光探針的兩端分別標(biāo)記報告熒光素或熒光染料、淬滅基團(tuán)。標(biāo)記的報告熒光素或熒光染料為fam或其它任何可以作為探針標(biāo)記的熒光素或熒光染料，例如hex、tet、joe、yakimayellow、cy3、cy3.5、cy5、ned、vic、pet、rox、liz、red、texasred；淬滅基團(tuán)為tamra或其它任何可以作為淬滅基團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)，例如dabcyl、bhq1、bhq2。進(jìn)一步地，所述的試劑盒還包括pcr反應(yīng)液、單純皰疹病毒ⅰ型陽性質(zhì)控品、單純皰疹病毒ⅱ型陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。優(yōu)選地，所述的單純皰疹病毒ⅰ型陽性質(zhì)控品含人工合成序列，所述人工合成序列為人工合成含所述單純皰疹病毒ⅰ型特異性引物對擴(kuò)增產(chǎn)物片段的序列。該人工合成序列內(nèi)容為：cgcggcaaatatgccttggtggatgcctctctcaagatggccgaccccaatcgctttcgcggcaaagaccttccggtcctggaccagctgaccgaccctccgggggtccggcgcgtgtaccacatccaggcgggcctaccggacccgttccagccccccagcctcccgatcacggtttactacgccgtgttggagcgcgcctgccgcagcgtgctcctaaacgcaccgtcggaggccccccagattgtccgcggggcctccgaagacgtccggaaacaaccctacaacctgaccatcgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggcctgtcccatccgaacgcagccccgctggaactactatgacagcttcagcgccgtcagcgaggataacctggggttcctgatgcacgcccccgcgtttgagaccgccggcacgtacctgcggctcgtgaagataaacgactggacggagattacacagtttatcctggagcaccgagccaagggctcctgtaagtacgccctcccgctgcgcatccccccgtcagcctgcctctccccccaggcctaccagcagggggtgacggtggacagcatcgggatgctgccccgcttcatccccgagaaccagcgcaccgtcgccgtatacagcttgaagatcg。優(yōu)選地，所述的單純皰疹病毒ⅰ型陽性質(zhì)控品是通過在puc57質(zhì)粒載體中插入所述人工合成含所述單純皰疹病毒ⅰ型特異性引物對擴(kuò)增產(chǎn)物片段的序列重組制得。根據(jù)本發(fā)明的一個具體方面，所述的單純皰疹病毒ⅰ型陽性質(zhì)控品所含的重組puc57載體質(zhì)粒濃度為1ng/μl。優(yōu)選地，所述的單純皰疹病毒ⅱ型陽性質(zhì)控品含人工合成序列，所述人工合成序列為人工合成含所述單純皰疹病毒ⅱ型特異性引物對擴(kuò)增產(chǎn)物片段的序列。該人工合成序列內(nèi)容為：ccacgactccggggccccaaacaacccctcccggacccgcaaccccgggtccggtgggcgcctccgccgcgcccacggccgattcccccctcaccgcctcgccccccgctaccgcgccggggccctcggccgccaacgtttcggtcgccgcgaccaccgccacgcccggaacccggggcaccgcccgtacccccccaacggacccaaagacgcacccacacggacccgcggacgctccccccggctcgccagcccccccaccccccgaacatcgcggcggacccgaggagtttgagggcgccggggacggcgaaccccccgaggacgacgacagcgccaccggcctcgccttccgaactccgaaccccaacaaaccaccccccgcgcgccccgggcccatccgccccacgctcccgccaggaattcttgggccgctcgcccccaacacgcctcgcccccccgcccaagctcccgctaaggacatgccctcgggccccacaccccaacacatccccctgttctggttcctaacggcctcccctgctctagatatcctctttatcatcagcaccaccatccacacggcggcgttcgtttgtctggtcgccttggcagcacaactttggcgcggccgggcggggcgcaggcgatacgcgcacccgagcgtgcgttacgtatgtctgccacccgagcgggattagggggtgggggtggggggcgagaaacgatgaaggacgggaaagggaacagcgaccaaatgtcacgataagaacaataaa。優(yōu)選地，所述的單純皰疹病毒ⅱ型陽性質(zhì)控品是通過在puc57質(zhì)粒載體中插入所述人工合成含所述單純皰疹病毒ⅱ型特異性引物對擴(kuò)增產(chǎn)物片段的序列重組制得。根據(jù)本發(fā)明的一個具體方面，所述的單純皰疹病毒ⅱ型陽性質(zhì)控品所含的重組puc57載體質(zhì)粒濃度為1ng/μl。優(yōu)選地，所述的陰性質(zhì)控品含人工合成人類管家基因gapdh部分片段的序列。用于擴(kuò)增所述的人工合成人類管家基因gapdh部分片段的引物對如下：正向引物：5’-ccgggaaggaaatgaatg-3’反向引物：5’-cttctctaagtccctcctac-3’。更優(yōu)選地，所述的人工合成的人類管家基因gapdh部分片段的序列為：ttctttcctttcgcgctctgcggggtcacgtgtcgcagaggagcccctcccccacggcctccggcaccgcaggccccgggatgctagtgcgcagcgggtgcatccctgtccggatgctgcgcctgcggtagagcggccgccatgttgcaaccgggaaggaaatgaatgggcagccgttaggaaagcctgccggtgactaaccctgcgctcctgcctcgatgggtggagtcgcgtgtggcggggaagtcaggtggagcgaggctagctggcccgatttctcctccgggtgatgcttttcctagattattctctggtaaatcaaagaagtgggtttatggaggtcctcttgtgtcccctccccgcagaggtgtggtggctgtggcatggtgccaagccgggagaagctgagtcatgggtagttggaaaaggacatttccaccgcaaaatggcccctctggtggtggccccttcctgcagcgccggctcacctcacggccccgcccttcccctgccagcctagcgttgacccgaccccaaaggccaggctgtaaatgtcaccgggaggattgggtgtctgggcgcctcggggaacctgcccttctccccattccgtcttccggaaaccagatctcccaccgcaccctggtctgaggttaaatatagctgctgacctttctgtagctgggggcctgggctggggctctctcccatcccttctccccacacacatgcacttacctgtgctcccactcctgatttctggaaaagagctaggaaggacaggcaacttggcaaatc。更優(yōu)選地，所述陰性質(zhì)控品是通過在ptg19-t質(zhì)粒載體中插入所述人工合成人類管家基因gapdh部分片段的序列重組制得。優(yōu)選地，所述pcr反應(yīng)液包括taq酶、dntp、緩沖液等成分。根據(jù)本發(fā)明，所述的試劑盒的反應(yīng)體系包括檢測單純皰疹病毒ⅰ型的反應(yīng)體系和檢測單純皰疹病毒ⅱ型的反應(yīng)體系。根據(jù)本發(fā)明，所述檢測單純皰疹病毒ⅰ型的反應(yīng)體系為20μl-50μl，當(dāng)所述檢測單純皰疹病毒ⅰ型的反應(yīng)體系為20μl體系，則包括：pcr反應(yīng)液(2x)10μl，hsv1正向引物0.5μl(10μmol/ml)，hsv1反向引物0.5μl(10μmol/ml)，hsv1熒光探針0.5μl(10μmol/ml)，被檢測物細(xì)胞、組織、體液(分泌物、痰液、尿液等等)的dna提取物4μl，滅菌超純水加至20μl；當(dāng)所述檢測單純皰疹病毒ⅰ型的反應(yīng)體系為50μl體系，則包括：pcr反應(yīng)液(2x)25μl，hsv1正向引物1.25μl(10μmol/ml)，hsv1反向引物1.25μl(10μmol/ml)，hsv1熒光探針1.25μl(10μmol/ml)，被檢測物細(xì)胞、組織、體液(分泌物、痰液、尿液等等)的dna提取物4-10μl，滅菌超純水加至50μl。根據(jù)本發(fā)明，所述檢測單純皰疹病毒ⅱ型的反應(yīng)體系為20μl-50μl，當(dāng)所述檢測單純皰疹病毒ⅱ型的反應(yīng)體系為20μl體系，則包括：pcr反應(yīng)液(2x)10μl，hsv2正向引物0.5μl(10μmol/ml)，hsv2反向引物0.5μl(10μmol/ml)，hsv2熒光探針0.5μl(10μmol/ml)，被檢測物細(xì)胞、組織、體液(分泌物、痰液、尿液等等)的dna提取物4μl，滅菌超純水加至20μl；當(dāng)所述檢測單純皰疹病毒ⅱ型的反應(yīng)體系為50μl體系，則包括：pcr反應(yīng)液(2x)25μl，hsv2正向引物1.25μl(10μmol/ml)，hsv2反向引物1.25μl(10μmol/ml)，hsv2熒光探針1.25μl(10μmol/ml)，被檢測物細(xì)胞、組織、體液(分泌物、痰液、尿液等等)的dna提取物4-10μl，滅菌超純水加至50μl。根據(jù)本發(fā)明，所述的試劑盒的熒光pcr擴(kuò)增的反應(yīng)時間和溫度為：50℃，2min1個循環(huán)(如果pcr反應(yīng)液不含ung酶則省略)；95℃，2-10min(依據(jù)不同來源的pcr反應(yīng)液而定)1個循環(huán)；95℃，15s，60℃，1min，40個循環(huán)并收集熒光信號。本發(fā)明采用的另一種技術(shù)方案是：一種特異性檢測單純皰疹病毒ⅰ、ⅱ型核酸的熒光pcr方法，采用上述試劑盒進(jìn)行檢測。由于上述技術(shù)方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明試劑盒通過對大量臨床樣本進(jìn)行檢測，能夠有效檢測出單純皰疹病毒ⅰ、ⅱ型，大量臨床樣本的檢測對試劑盒的有效性、大規(guī)模使用性提供了保障。本發(fā)明試劑盒，單純皰疹病毒ⅰ型熒光pcr檢測的反應(yīng)效率高達(dá)89.8％，單純皰疹病毒ⅱ型熒光pcr檢測的反應(yīng)效率高達(dá)85.1％，具有較高的反應(yīng)效率。附圖說明圖1為單純皰疹病毒ⅰ、ⅱ型熒光pcr引物對的質(zhì)檢電泳圖；圖中，1：hsv1熒光pcr反應(yīng)正向引物；2：hsv1熒光pcr反應(yīng)反向引物；3：hsv2熒光pcr反應(yīng)正向引物；4：hsv2熒光pcr反應(yīng)反向引物；m：電泳marker，長度由上到下依次為17，24，34(單位：堿基)。圖2為hsv1熒光pcr反應(yīng)探針的質(zhì)檢hplc圖。圖3為hsv2熒光pcr反應(yīng)探針的質(zhì)檢hplc圖。圖4為單純皰疹病毒ⅰ型的puc57重組質(zhì)粒構(gòu)成示意圖。圖5為單純皰疹病毒ⅱ型的puc57重組質(zhì)粒構(gòu)成示意圖。圖6為ptg19-t質(zhì)粒載體構(gòu)成示意圖。圖7為單純皰疹病毒ⅰ型陽性質(zhì)控品熒光pcr的擴(kuò)增反應(yīng)圖；圖中從左至右的曲線分別對應(yīng)單純皰疹病毒ⅰ型陽性質(zhì)控品的濃度從高到低。圖8為圖7對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖9為單純皰疹病毒ⅱ型陽性質(zhì)控品熒光pcr的擴(kuò)增反應(yīng)圖；圖中從左至右的曲線分別對應(yīng)單純皰疹病毒ⅱ型陽性質(zhì)控品的濃度從高到低。圖10為圖9對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，應(yīng)當(dāng)說明一點(diǎn)，實施例僅用于具體說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明。實施例1：試劑盒的制備1、引物和探針的設(shè)計和合成使用primerexpress3.0軟件，對單純皰疹病毒ⅰ型的gpd基因、ⅱ型的gpg基因的dna序列分別設(shè)計了特異性引物對和其特異性的探針，引物和探針均由上海捷瑞生物有限公司合成，在合成的探針上進(jìn)行了雙熒光和淬滅基團(tuán)標(biāo)記。其中，引物為page純化，探針為hplc純化。設(shè)計出的引物對和探針分別為：單純皰疹病毒ⅰ型：正向引物：5’-ccccgctggaactactatgaca-3’(seqidno.1)反向引物：5’-tccgtccagtcgtttatcttca-3’(seqidno.2)熒光探針：5’-acgcccccgcgtttgagacc-3’(seqidno.3)單純皰疹病毒ⅱ型：正向引物：5’-aagctcccgctaaggacatg-3’(seqidno.4)反向引物：5’-ggtgctgatgataaagaggatatctaga-3’(seqidno.5)熒光探針：5’-aacacatccccctgttctggttcctaacg-3’(seqidno.6)。引物和探針合成后均制備成凍干粉狀，然后用1×tebuffer稀釋至100μm的濃度作為母液，-20℃保存。工作液為母液通過無菌水稀釋10倍制得，用于常規(guī)使用。對特異性引物對和熒光探針進(jìn)行質(zhì)檢分析，結(jié)果如圖1、2和3所示。2、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品的制備1)單純皰疹毒ⅰ型陽性質(zhì)控品的制備：含單純皰疹病毒ⅰ型特異性引物對擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性片段由南京金斯瑞生物有限公司合成，然后用重組dna基因工程方法人工裝入puc57質(zhì)粒載體中，再通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌、質(zhì)粒擴(kuò)增和質(zhì)粒提取等步驟獲得重組質(zhì)粒dna，此質(zhì)粒dna就是本發(fā)明試劑盒中所使用的單純皰疹毒ⅰ型陽性質(zhì)控品，該單純皰疹毒ⅰ型陽性質(zhì)控品所含的人工合成序列如seqidno.7所示。單純皰疹病毒ⅰ型的puc57重組質(zhì)粒構(gòu)成示意圖如圖4所示。2)單純皰疹毒ⅱ型陽性質(zhì)控品的制備：含單純皰疹病毒ⅱ型特異性引物對擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性片段由南京金斯瑞生物有限公司合成，然后用重組dna基因工程方法人工裝入puc57質(zhì)粒載體中，再通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌、質(zhì)粒擴(kuò)增和質(zhì)粒提取等步驟獲得重組質(zhì)粒dna，此質(zhì)粒dna就是本發(fā)明試劑盒中所使用的單純皰疹毒ⅱ型陽性質(zhì)控品，該單純皰疹毒ⅰ型陽性質(zhì)控品所含的人工合成序列如seqidno.8所示。單純皰疹病毒ⅱ型的puc57重組質(zhì)粒構(gòu)成示意圖如圖5所示。3)陰性質(zhì)控品的制備：以人類管家基因gapdh基因為模板，設(shè)計常規(guī)pcr引物，引物序列如seqidno.9和seqidno.10所示，從人類組織細(xì)胞提取的基因組dna中進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，然后用重組dna基因工程的方法將擴(kuò)增產(chǎn)物人工裝配到ptg19-t質(zhì)粒載體中，再通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌、質(zhì)粒擴(kuò)增和質(zhì)粒提取等步驟獲得重組質(zhì)粒dna，此質(zhì)粒dna就是本發(fā)明試劑盒中所使用的陰性質(zhì)控品，該陰性質(zhì)控品所含的人工合成的人類管家基因gapdh部分片段的序列如seqidno.11所示。ptg19-t質(zhì)粒載體構(gòu)成示意圖如圖6所示。3、pcr反應(yīng)液pcr反應(yīng)液包括taq酶、dntp、緩沖液等成分，可以使用購自abi公司的熒光pcr反應(yīng)混合液，名稱是universalmastermixii,withung。實施例2：樣本核酸的提取使用天根生化科技(北京)有限公司的血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒(dp304)，按照該試劑盒說明書的步驟，提取樣本核酸。提取完成后，產(chǎn)物放-20℃保存。實施例3：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1)單純皰疹病毒ⅰ型選取單純皰疹病毒ⅰ型陽性質(zhì)控品作為標(biāo)準(zhǔn)物，稀釋濃度至1μg/ml，然后繼續(xù)以10倍梯度稀釋五個濃度，一共是6個濃度梯度，即1μg/ml、10-1μg/ml、10-2μg/ml、10-3μg/ml、10-4μg/ml、10-5μg/ml。然后進(jìn)行熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)，用與abi7500儀器配套的軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖7和圖8所示，且儀器的系統(tǒng)顯示，反應(yīng)效率達(dá)89.8％。2)單純皰疹病毒ⅱ型選取單純皰疹病毒ⅱ型陽性質(zhì)控品作為標(biāo)準(zhǔn)物，稀釋濃度至1μg/ml，然后繼續(xù)以10倍梯度稀釋五個濃度，一共是6個濃度梯度，即1μg/ml、10-1μg/ml、10-2μg/ml、10-3μg/ml、10-4μg/ml、10-5μg/ml。然后進(jìn)行熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)，用與abi7500儀器配套的軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖9和圖10所示，且儀器的系統(tǒng)顯示，反應(yīng)效率達(dá)85.1％。實施例4：熒光pcr擴(kuò)增以及結(jié)果分析1、采用的反應(yīng)體系如表1和2所示。在熒光pcr專用八聯(lián)管中配置好每個體系后，放入abi7500熒光pcr儀器中(或其它類型的開放式熒光定量pcr儀器)，準(zhǔn)備進(jìn)行反應(yīng)。每次實驗都需要配置1個陽性質(zhì)控品的反應(yīng)管作為陽性對照和一個陰性質(zhì)控品的反應(yīng)管作為陰性對照。表1hsv1體系內(nèi)容體積(μl)pcr反應(yīng)液10hsv1正向引物0.5hsv1反向引物0.5hsv1熒光探針0.5無菌水4.5待測樣本4總計20表2hsv2體系內(nèi)容體積(μl)pcr反應(yīng)液10hsv2正向引物0.5hsv2反向引物0.5hsv2熒光探針0.5無菌水4.5待測樣本4總計20表1和2中的待測樣本為通過實施例2的方式制備得到的待測樣本。2、反應(yīng)條件設(shè)置如表3所示：表33、結(jié)果分析1)反應(yīng)結(jié)束后，首先，基線的選取設(shè)置為“自動”。閾值(threshold)設(shè)定的原則是閾值線剛好超過陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，使其ct值＝40或“undetermined”。2)設(shè)置好閾值后，觀察陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線是否為正常的s型對數(shù)增長曲線，且ct值≤37。滿足上述條件則說明本次實驗反應(yīng)正常，否則，需要重做。3)結(jié)果判定：ct值≤37，表示該樣本結(jié)果為陽性，ct值>37或“undetermined”，表示該樣本結(jié)果為陰性。應(yīng)用實施例使用本發(fā)明試劑盒對收集到的124例組織樣本進(jìn)行了檢測。124例樣本為臨床收集的胎兒組織，分兩組：正常引產(chǎn)組(對照組)42例，自發(fā)性流產(chǎn)組(患病組)82例。按照上述實施例2：樣本核酸的提取。隨后按照上述實施例4：熒光pcr擴(kuò)增以及結(jié)果分析，使用本發(fā)明試劑盒在abi7500熒光pcr儀進(jìn)行熒光pcr檢測，結(jié)果如下表4所示。表4從表中的結(jié)果可以得出，本試劑盒能夠成功檢測單純皰疹病毒ⅰ、ⅱ型，并且從正常組和患病組的陽性率結(jié)果來看，本試劑盒可以很好地區(qū)分正常對照組和患病組。單純皰疹病毒ⅰ型檢測結(jié)果，對照組無陽性結(jié)果，而患病組為4.76％；單純皰疹病毒ⅱ型檢測結(jié)果，對照組與患病組陽性率的比率是1比2.55,也就是說患病組單純皰疹病毒ⅱ型的感染率是正常對照組的2.55倍,結(jié)果顯示本試劑盒具有很好的靈敏度和特異性，能夠作為檢測單純皰疹病毒ⅰ、ⅱ型的有效工具。大量臨床樣本的檢測對試劑盒的有效性、大規(guī)模使用性提供了保障。本發(fā)明試劑盒，單純皰疹病毒ⅰ型的反應(yīng)效率高達(dá)89.8％，單純皰疹病毒ⅱ型的反應(yīng)效率高達(dá)85.1％，具有較高的反應(yīng)效率。以上對本發(fā)明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，且本發(fā)明不限于上述的實施例，凡根據(jù)本發(fā)明的精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110>張家港藍(lán)蘇生物工程有限公司<120>一種特異性檢測單純皰疹病毒ⅰ、ⅱ型核酸的熒光pcr方法及試劑盒<130><160>11<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>檢測單純皰疹病毒ⅰ型的正向引物<400>1ccccgctggaactactatgaca22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>檢測單純皰疹病毒ⅰ型的反向引物<400>2tccgtccagtcgtttatcttca22<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>檢測單純皰疹病毒ⅰ型的熒光探針<400>3acgcccccgcgtttgagacc20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>檢測單純皰疹病毒ii型的正向引物<400>4aagctcccgctaaggacatg20<210>5<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>檢測單純皰疹病毒ii型的反向引物<400>5ggtgctgatgataaagaggatatctaga28<210>6<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>檢測單純皰疹病毒ii型的熒光探針<400>6aacacatccccctgttctggttcctaacg29<210>7<211>721<212>dna<213>人工序列<220><223>試劑盒單純皰疹毒ⅰ型陽性質(zhì)控品所含的人工合成序列<400>7cgcggcaaatatgccttggtggatgcctctctcaagatggccgaccccaatcgctttcgc60ggcaaagaccttccggtcctggaccagctgaccgaccctccgggggtccggcgcgtgtac120cacatccaggcgggcctaccggacccgttccagccccccagcctcccgatcacggtttac180tacgccgtgttggagcgcgcctgccgcagcgtgctcctaaacgcaccgtcggaggccccc240cagattgtccgcggggcctccgaagacgtccggaaacaaccctacaacctgaccatcgct300tggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgc360tcctacaacaagtctctgggggcctgtcccatccgaacgcagccccgctggaactactat420gacagcttcagcgccgtcagcgaggataacctggggttcctgatgcacgcccccgcgttt480gagaccgccggcacgtacctgcggctcgtgaagataaacgactggacggagattacacag540tttatcctggagcaccgagccaagggctcctgtaagtacgccctcccgctgcgcatcccc600ccgtcagcctgcctctccccccaggcctaccagcagggggtgacggtggacagcatcggg660atgctgccccgcttcatccccgagaaccagcgcaccgtcgccgtatacagcttgaagatc720g721<210>8<211>779<212>dna<213>人工序列<220><223>試劑盒單純皰疹毒ⅱ型陽性質(zhì)控品所含的人工合成序列<400>8ccacgactccggggccccaaacaacccctcccggacccgcaaccccgggtccggtgggcg60cctccgccgcgcccacggccgattcccccctcaccgcctcgccccccgctaccgcgccgg120ggccctcggccgccaacgtttcggtcgccgcgaccaccgccacgcccggaacccggggca180ccgcccgtacccccccaacggacccaaagacgcacccacacggacccgcggacgctcccc240ccggctcgccagcccccccaccccccgaacatcgcggcggacccgaggagtttgagggcg300ccggggacggcgaaccccccgaggacgacgacagcgccaccggcctcgccttccgaactc360cgaaccccaacaaaccaccccccgcgcgccccgggcccatccgccccacgctcccgccag420gaattcttgggccgctcgcccccaacacgcctcgcccccccgcccaagctcccgctaagg480acatgccctcgggccccacaccccaacacatccccctgttctggttcctaacggcctccc540ctgctctagatatcctctttatcatcagcaccaccatccacacggcggcgttcgtttgtc600tggtcgccttggcagcacaactttggcgcggccgggcggggcgcaggcgatacgcgcacc660cgagcgtgcgttacgtatgtctgccacccgagcgggattagggggtgggggtggggggcg720agaaacgatgaaggacgggaaagggaacagcgaccaaatgtcacgataagaacaataaa779<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>擴(kuò)增陰性質(zhì)控品人工合成片段的正向引物<400>9ccgggaaggaaatgaatg18<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>擴(kuò)增陰性質(zhì)控品人工合成片段的反向引物<400>10cttctctaagtccctcctac20<210>11<211>798<212>dna<213>人工序列<220><223>試劑盒陰性質(zhì)控品所含的人工合成序列<400>11ttctttcctttcgcgctctgcggggtcacgtgtcgcagaggagcccctcccccacggcct60ccggcaccgcaggccccgggatgctagtgcgcagcgggtgcatccctgtccggatgctgc120gcctgcggtagagcggccgccatgttgcaaccgggaaggaaatgaatgggcagccgttag180gaaagcctgccggtgactaaccctgcgctcctgcctcgatgggtggagtcgcgtgtggcg240gggaagtcaggtggagcgaggctagctggcccgatttctcctccgggtgatgcttttcct300agattattctctggtaaatcaaagaagtgggtttatggaggtcctcttgtgtcccctccc360cgcagaggtgtggtggctgtggcatggtgccaagccgggagaagctgagtcatgggtagt420tggaaaaggacatttccaccgcaaaatggcccctctggtggtggccccttcctgcagcgc480cggctcacctcacggccccgcccttcccctgccagcctagcgttgacccgaccccaaagg540ccaggctgtaaatgtcaccgggaggattgggtgtctgggcgcctcggggaacctgccctt600ctccccattccgtcttccggaaaccagatctcccaccgcaccctggtctgaggttaaata660tagctgctgacctttctgtagctgggggcctgggctggggctctctcccatcccttctcc720ccacacacatgcacttacctgtgctcccactcctgatttctggaaaagagctaggaagga780caggcaacttggcaaatc798當(dāng)前第1頁12