本發(fā)明涉及微生物
技術領域：
，尤其涉及一種適用于廣泛耐藥銅綠假單胞菌的篩查培養(yǎng)基及制備方法。
背景技術：
：銅綠假單胞菌是一種常見的條件致病菌，能引起化膿性病變，感染后因膿汁和滲出液呈綠色，故又名綠膿桿菌，是臨床上重要的條件致病菌之一。在臨床樣本檢驗中，常常通過使用血液瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)從由檢測樣本獲得的眾多菌落中挑取高度懷疑的菌落進行分離培養(yǎng)，并在確認所培養(yǎng)聚落無雜菌污染后，再對該培養(yǎng)菌落進行系統(tǒng)鑒定和藥物敏感性實驗。該傳統(tǒng)檢測方法檢測時間常常達72小時或以上，耗時較長。目前，認為使用nac瓊脂培養(yǎng)基能夠大大縮短檢測時間的常用培養(yǎng)基，但，nac瓊脂培養(yǎng)基配方中含有能影響銅綠假單胞菌生長速度的奈叮酸抗生素，故應用nac瓊脂培養(yǎng)基的檢測方法也需48小時。另外，上述檢測方法往往只能從幾百或上千菌落中挑選出1～3個菌落進行藥物敏感性試驗，容易漏檢耐藥菌株，靈敏度較低。故，需要一種培養(yǎng)基能夠在保證銅綠假單胞菌生長的條件下，實現(xiàn)快速挑選得到屬于銅綠假單胞菌的菌落。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種適用于廣泛耐藥銅綠假單胞菌的篩查培養(yǎng)基及制備方法，從而解決現(xiàn)有技術中存在的前述問題。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述適用于廣泛耐藥銅綠假單胞菌的篩查培養(yǎng)基，所述篩選培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基、促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質、多耐藥銅綠假單胞菌檢測用抗生素和蒸餾水；所述促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質與所述蒸餾水的體積比例為1：(9～99)，所述促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質為恒溫動物血液在高溫高壓下的水解產物；所述多耐藥銅綠假單胞菌檢測用抗生素為碳青霉烯類抗生素、氨基糖苷類抗生素和喹諾酮類抗生素中的一種或多種。優(yōu)選地，所述促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質的制備方法為：s11，將恒溫動物血液與蒸餾水按照1：(10～20)的體積比例混合，得到混合液；s12，使用攪拌機充分攪拌所述混合液，得到原料液；s13，將所述原料液置于反應釜中，將反應釜置于190℃～200℃、大于等于2個大氣壓強的條件下，對反應釜中的所述原料液進行水解，將水解液過濾后，得到濾液，所述濾液即為促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質。優(yōu)選地，所述基礎培養(yǎng)基為nac基礎培養(yǎng)基，所述nac基礎培養(yǎng)基配方為蛋白胨20g/l、磷酸氫二鉀0.3g/l、硫酸鎂0.2g/l、溴棕三甲銨0.2g/l、萘啶酸0.015g/l和瓊脂15g/l。優(yōu)選地，所述碳青霉烯類抗生素與所述蒸餾水的質量體積比為32mg/l～256mg/l，所述氨基糖苷類抗生素與所述蒸餾水的質量體積比為1mg/l～8mg/l，所述喹諾酮類抗生素與所述蒸餾水的質量體積比為8mg/l～64mg/l。優(yōu)選地，所述碳青霉烯類抗生素為亞胺培南，所述氨基糖苷類抗生素為阿卡米星，所述喹諾酮類抗生素為環(huán)丙沙星。本發(fā)明所述適用于廣泛耐藥銅綠假單胞菌的篩查培養(yǎng)基的制備方法，所述制備方法包括：s21，制備促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質在溫度為190℃～200℃、壓強大于等于2個大氣壓強的條件下，對ph＞8的恒溫動物血液與蒸餾水的混合液進行水解、過濾，得到的濾液即為促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質；s22，將所述促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質添加到所述基礎培養(yǎng)基中，高壓滅菌得到初始培養(yǎng)基；所述促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質與所述蒸餾水的體積比例為1：(9～99)；s23，滅菌后，將初始培養(yǎng)基的溫度在室溫至60℃之間時，添加多耐藥銅綠假單胞菌檢測用抗生素，混勻，分注到排樣板不同孔，室溫冷卻，得到適用于廣泛耐藥銅綠假單胞菌的篩查培養(yǎng)基；所述多耐藥銅綠假單胞菌檢測用抗生素為碳青霉烯類抗生素、氨基糖苷類抗生素和喹諾酮類抗生素中的一種或多種；所述碳青霉烯類抗生素與所述蒸餾水的質量體積比為32mg/l～256mg/l，所述氨基糖苷類抗生素與所述蒸餾水的質量體積比為1mg/l～8mg/l，所述喹諾酮類抗生素與所述蒸餾水的質量體積比為8mg/l～64mg/l。優(yōu)選地，所述恒溫動物血液為恒溫哺乳動物血液或恒溫鳥類血液。優(yōu)選地，所述基礎培養(yǎng)基為nac基礎培養(yǎng)基，所述nac基礎培養(yǎng)基配方為蛋白胨20g/l、磷酸氫二鉀0.3g/l、硫酸鎂0.2g/l、溴棕三甲銨0.2g/l、萘啶酸0.015g/l和瓊脂15g/l。優(yōu)選地，步驟s22中的滅菌條件為溫度121℃，滅菌時間25min。優(yōu)選地，所述碳青霉烯類抗生素為亞胺培南，所述氨基糖苷類抗生素為阿卡米星，所述喹諾酮類抗生素為環(huán)丙沙星。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所述篩查培養(yǎng)基具有縮短檢測時間、靈敏度高和配制方法簡便的特點。更詳細的：(1)本發(fā)明培養(yǎng)基利用了細菌生長促進劑，可促進銅綠假單胞菌的生長和銅綠色素的分泌，縮短檢測時間，根據(jù)需要也可以添加ttc(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)等氧化還原指示劑。(2)本發(fā)明培養(yǎng)基包括抗生素組合為不同濃度的不同抗生素組合，根據(jù)結果可以大致判斷耐藥藥物和耐藥藥物濃度。(3)本發(fā)明篩查方法，無需純化培養(yǎng)，直接使用臨床樣本進行篩查，篩查時間至少縮短24小時以上。附圖說明圖1是選擇性分離培養(yǎng)廣泛耐藥銅綠假單胞菌瓊脂平板的平面示意圖。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施方式僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。①關于適用于廣泛耐藥銅綠假單胞菌的篩查培養(yǎng)基的解釋說明：所述篩查培養(yǎng)基的形狀為含有各種濃度抗生素組合的格子組成的方形，或為含有不同濃度抗生素組合的孔隙或孔狀培養(yǎng)基組合的板狀。所述篩查培養(yǎng)基上只生長廣泛耐藥銅綠假單胞菌，其他細菌或敏感銅綠假單胞菌以及其他耐藥銅綠假單胞菌均不能生長。②關于基于適用于廣泛耐藥銅綠假單胞菌的篩查培養(yǎng)基的制備方法所述篩查方法為在篩查培養(yǎng)基的各個方格或孔隙或孔狀中接種待檢臨床標本，或利用毛細管現(xiàn)象使待檢臨床標本均勻分布到篩查培養(yǎng)基中，或利用微流控原理均勻滴入方格或孔隙或孔狀，肉眼觀察菌落或自動監(jiān)測濁度變化、指示劑顏色變化進行篩查同時測定銅綠假單胞菌的最低生長抑制藥物濃度(mic)。所述篩查方法進行篩查時，設置三組模塊(每組模塊由任意兩種抗生素組成)均能生長的菌落只有廣泛耐藥銅綠假單胞菌，其他細菌或敏感銅綠假單胞菌不能生長，雙重耐藥銅綠假單胞菌按照理論可以在三組模塊中某一個模塊生長。實施例1：促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質的制備1、動物血液前處理：在農貿市場采購豬血1000ml，取100ml加入900ml蒸餾水，使用skg1246破壁料理機進行攪拌打碎凝血塊，得到血液混合液，轉速為1200轉/min，時間為3分鐘。2、調整ph值：使用1mol/l濃度的氫氧化鈉(ph：14)，調整血液混合液的ph值為8.5，得到血液原料液；3、高溫高壓水解：將血液原料液放入高溫高壓反映釜，，在溫度195℃、大氣壓2.1個大氣壓、攪拌轉速為100轉/分鐘的條件下，邊攪拌邊進行高溫高壓水解反應，反應時間為1h，得到水解液，所述高溫高壓反映釜為威?；C械有限公司gsh高溫高壓反映釜；4、使用無菌紗布對水解液進行過濾，獲得過濾液即為促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質，在一個大氣壓、20℃的條件下對過濾液進行采用vsm自動粘度計進行動力粘度和運動粘度測試，所述動力粘度μ＝1.09×10-3pa·s，所述運動粘度v＝1.11×10-6㎡/s，粘稠度低，流動性好，與其它液體混合容易。5、將過濾液在121℃、1.2個大氣壓的條件下，高溫高壓滅菌15分鐘，冷卻至室溫保存?zhèn)溆谩嵤├?：nac瓊脂平板和添加促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質的nac瓊脂平板(無添加抗生素組合)對比測試1、配制nac瓊脂平板稱量蛋白胨20g、磷酸氫二鉀0.3g、硫酸鎂0.2g、溴棕三甲銨0.2g、萘啶酸0.015g、瓊脂15g，并溶于1l蒸餾水中，混勻，于121℃高壓滅菌25min后澆注到無菌平板上，室溫冷卻，獲得nac瓊脂平板，設為對照組。2、配制促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質的nac瓊脂平板(無添加抗生素組合)稱量蛋白胨20g、磷酸氫二鉀0.3g、硫酸鎂0.2g、溴棕三甲銨0.2g、萘啶酸0.015g、瓊脂15g，加入實施例1中的50ml過濾液和950ml蒸餾水，混勻，121℃高壓滅菌25min后澆注到無菌平板上，室溫冷卻，獲得選擇性分離培養(yǎng)廣泛耐藥銅綠假單胞菌瓊脂平板(無添加抗生素組合)，設為試驗組。3、取100株從臨床樣本中分離純化獲得的銅綠假單胞菌(經(jīng)梅里埃vitek2compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定)，分別在以上兩種瓊脂平板上，36℃～37.5℃培養(yǎng)8h后，觀察這些細菌分別在對照組和試驗組上的菌落大小和熒光深淺，熒光強度檢測使用quantum，紫外線波長350nm。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，試驗組3個小時后已經(jīng)形成銅綠色菌落，對照組在8個小時后形成肉眼可見菌落，對照組菌落較小，熒光值較低，詳見表1。表1nac瓊脂平板和添加促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質nac瓊脂平板(無添加抗生素組合)對比測試結果對照組實驗組(50ml動物血液水解產物)平均菌落形成時間8.3小時3.1小時平均菌落大小0.6mm2.1mm平均熒光值231783實驗結果說明促進銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)物質能促進銅綠假單胞菌的生長，作為本發(fā)明培養(yǎng)基中的關鍵組分。實施例3：nac瓊脂平板和基于適用于廣泛耐藥銅綠假單胞菌的篩查培養(yǎng)基的篩查方法及其篩查培養(yǎng)基對比測試1、配制nac瓊脂平板稱量蛋白胨20g、磷酸氫二鉀0.3g、硫酸鎂0.2g、溴棕三甲銨0.2g、萘啶酸0.015g、瓊脂15g，并溶于1l蒸餾水中，混勻，于121℃高壓滅菌25min后澆注到無菌平板上，室溫冷卻，獲得nac瓊脂平板，設為對照組。2、配制選擇性分離培養(yǎng)廣泛耐藥銅綠假單胞菌瓊脂平板(添加抗生素組合)(1)稱量蛋白胨20g、磷酸氫二鉀0.3g、硫酸鎂0.2g、溴棕三甲銨0.2g、萘啶酸0.015g、瓊脂15g，加入100ml添加液和900ml蒸餾水，混勻，分裝到48個小三角瓶中，121℃高壓滅菌25min。(2)滅菌后放置室溫冷卻至60℃后分別添加不同濃度的亞胺培南、阿卡米星和環(huán)丙沙星，混勻，澆注到48孔長方形平板上，放置冷卻，獲得選擇性分離培養(yǎng)廣泛耐藥銅綠假單胞菌瓊脂平板，設為試驗組，長方形平板形狀見圖1，各孔抗生素組合和濃度，見表2。表二：長方形平板各孔抗生素組合和濃度碳青霉烯類抗生素：32～256mg/l，氨基糖苷類抗生素：1～8mg/l，喹諾酮類抗生素：8～64mg/l3、將100個臨床樣本直接接種到本發(fā)明培養(yǎng)基進行篩查同時接種到不含抗生素的nac平板培養(yǎng)基作為對照組，37度培養(yǎng)24小時后本發(fā)明篩查培養(yǎng)基三組抗生素組合都生長的銅綠假單胞菌菌株有7株，耐藥范圍見表3，對照組獲得25株銅綠假單胞菌菌株。表3篩查培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株最低抑制生長藥物濃度(mic)實驗組實驗組實驗組菌株阿米卡星亞安培南環(huán)丙沙星1464162264163832644264165464326412864723232挑取對照組單菌落進行液體培養(yǎng)24小時后使用梅里埃vitek2compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進行鑒定和mic測定，25株分離細菌中敏感菌：13株；單一藥物耐藥銅綠假單胞菌：5株；廣泛耐藥銅綠假單胞菌7株，分離出廣泛耐藥銅綠假單胞菌的臨床樣本和實驗組分離出廣泛耐藥銅綠假單胞菌臨床樣本相同，7株廣泛耐藥銅綠假單胞菌在本發(fā)明篩查培養(yǎng)基和梅里埃vitek2compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)各自的mic詳見表4。表47株廣泛耐藥銅綠假單胞菌耐藥水平實驗組對照組實驗組對照組實驗組對照組菌株阿米卡星阿米卡星亞安培南亞安培南環(huán)丙沙星環(huán)丙沙星1486412816162226464161638832646432422643216165446464323264412864643272232323264可見兩種方法所測mic相近，但是本發(fā)明篩查方法縮短時間48個小時。實施例4：適用于廣泛耐藥銅綠假單胞菌的篩查培養(yǎng)基的保質期測試1、將實施例2中所制備的未經(jīng)測試的空白平板于4℃冰箱中儲存一周、1個月和3個月后取出培養(yǎng)基平板，作為試驗組。2、制備nac培養(yǎng)基平板，作為對照組。3、分別在以上兩種培養(yǎng)基平板接種從臨床樣本中分離純化獲得的藥物敏感銅綠假單胞菌、單一藥物耐藥銅綠假單胞菌和廣泛耐藥銅綠假單胞菌，進行培養(yǎng)觀察這些細菌是否能在這兩種培養(yǎng)基平板上生長及生長速度、其生長形態(tài)。測試結果顯示，藥物敏感株和單一藥物耐藥株在試驗組中無生長，廣泛耐藥株能在試驗組上生長且形成銅綠色菌落，其生長速度和菌落大小、以及耐藥水平與實施例2實驗結果一致。說明該選擇性分離培養(yǎng)廣泛耐藥銅綠假單胞菌的瓊脂平板在儲存上述時間后仍有效，說明本發(fā)明培養(yǎng)基耐儲存，保存性能良好。實施例5：陰性對照試驗進行實施例3的同時進行了陰性對照試驗，在廣泛耐藥銅綠假單胞菌的篩查方法及其篩查培養(yǎng)基(添加抗生素組合)，接種臨床分離的耐甲氧西林葡萄球菌(mrsa)、超廣譜β-內酰胺酶(esbls酶)陽性大腸桿菌、肺炎克雷博菌、表皮葡萄球菌、屎腸球菌、糞腸球菌、不動桿菌，均未見生長，說明本發(fā)明所述適用于廣泛耐藥銅綠假單胞菌的篩查培養(yǎng)基的特異性較好。通過采用本發(fā)明公開的上述技術方案，得到了如下有益的效果：本發(fā)明所述篩查培養(yǎng)基具有縮短檢測時間、靈敏度高和配制方法簡便的特點。更詳細的：(1)本發(fā)明培養(yǎng)基利用了細菌生長促進劑，可促進銅綠假單胞菌的生長和銅綠色素的分泌，縮短檢測時間，根據(jù)需要也可以添加ttc(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)等氧化還原指示劑。(2)本發(fā)明培養(yǎng)基包括抗生素組合為不同濃度的不同抗生素組合，根據(jù)結果可以大致判斷耐藥藥物和耐藥藥物濃度。(3)本發(fā)明篩查方法，無需純化培養(yǎng)，直接使用臨床樣本進行篩查，篩查時間至少縮短24小時以上。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁12