本發(fā)明涉及一種多肽，具體涉及一種抗菌肽及其制備方法和應用。
背景技術：
：：抗菌肽是一類具有抗菌活性的多肽物質(zhì)。目前，在不同動物組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種具有抗菌作用的蛋白質(zhì)和多肽，其是存在于生物體內(nèi)的一類廣譜抗菌活性多肽，也是先天免疫系統(tǒng)中重要的組成部分。這些抗菌肽具有抗菌能力強、抗菌譜廣、種類多、可供選擇范圍廣、靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等特點，同時鑒于許多微生物已對抗生素產(chǎn)生抗藥性，因此抗菌肽有望成為新一代的臨床抗菌藥物，并且在化妝品、生物農(nóng)藥、動物飼料添加劑、天然食品防腐劑、動植物抗病基因工程等方面具有廣闊的應用前景。蜜蜂肽(apidaecin，簡稱ap)是一類來源于膜翅目昆蟲的富脯氨酸的多肽，最早從蜜蜂的淋巴液中分離得到，一般含有16～19個氨基酸殘基，其對多種革蘭氏陰性菌，特別是腸桿菌科，具有很強的傷殺作用，而對包括乳酸乳球菌在內(nèi)的革蘭氏陽性菌不起作用，并且對真核細胞沒有毒性作用。由于蜜蜂肽在昆蟲中的含量較少，人們?nèi)諠u嘗試在不同的表達系統(tǒng)中對蜜蜂肽進行表達。然而，抗菌肽在外源基因表達中存在基因表達量低、表達產(chǎn)物易降解、表達產(chǎn)物活性低、抗菌肽易對宿主菌產(chǎn)生毒害等問題。因此，期待一種穩(wěn)定性好且抗菌活性高的抗菌肽。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種抗菌肽及其制備方法和應用，該抗菌肽的穩(wěn)定性好，抗菌活性高。本發(fā)明提供一種抗菌肽，其氨基酸序列為：tyr‐ile‐pro‐gln‐pro‐arg‐pro‐pro‐his‐pro‐arg‐leu(seqidno：1)。本發(fā)明對具有上述氨基酸序列的抗菌肽的制備方法不作嚴格限制，可以通過化學合成得到，也可以通過對含有上述抗菌肽表達載體的菌株進行發(fā)酵得到；本領域技術人員可以根據(jù)上述抗菌肽的氨基酸序列容易地構建得到上述抗菌肽表達載體，進而得到含有上述抗菌肽表達載體的菌株并對其進行發(fā)酵。本發(fā)明還提供一種抗菌肽的制備方法，包括：對含有上述抗菌肽的發(fā)酵液進行陽離子交換層析、疏水層析和尺寸排阻層析，得到所述抗菌肽。本發(fā)明對上述發(fā)酵液的制備方法不作嚴格限制，只要能夠通過發(fā)酵得到上述抗菌肽即可。在一實施方式中，所述發(fā)酵液的制備方法可以包括：對含有所述抗菌肽表達載體的枯草芽孢桿菌進行發(fā)酵，得到所述發(fā)酵液。具體地，可以通過對公開號cn105671069a的中國發(fā)明專利中所公開的重組枯草芽孢桿菌進行改造，從而得到含有上述抗菌肽表達載體的菌株；對改造方式不作嚴格限制，可以采用紫外誘變等物理誘變方式、誘變劑誘變等化學誘變方式、定點突變等基因工程方式等。在本發(fā)明中，對陽離子交換層析、疏水層析和尺寸排阻層析的順序不作嚴格限制，優(yōu)選為依次進行陽離子交換層析、疏水層析和尺寸排阻層析。本發(fā)明通過由陽離子交換層析、疏水層析和尺寸排阻層析三種層析組成的層析系統(tǒng)，分別去除發(fā)酵液中與目的抗菌肽具有電荷差異、疏水差異、大小差異的雜蛋白等其他物質(zhì)，從而達到純化的效果；經(jīng)純化后的抗菌肽通過結合hplc-ms，從而能夠獲得進一步純化的抗菌肽純品及其結構信息。上述方法通過利用抗菌肽的特點和不同層板方法之間的特性差異，不僅科學合理地對抗菌肽進行了分離純化，還為抗菌肽的檢測提供了依據(jù)。其中，陽離子交換層析是利用離子交換劑(即交換介質(zhì))上的可交換離子與周圍介質(zhì)中被分離的各種離子間的親和力不同，即利用離子交換劑的荷電基團，吸附發(fā)酵液中相反電荷的離子或離子化合物，被吸附的物質(zhì)隨后被帶同類型電荷的其他離子所置換而被洗脫，由于各種不同的離子或離子化合物對離子交換劑的結合力不同，因而洗脫的速率不同從而形成了層析層。由于離子交換是可逆的，其能以極快的速率達到平衡，因此離子交換層析具有靈敏度高、重復性、選擇性好，分析速度快等優(yōu)點。在本發(fā)明的具體方案中，所述陽離子交換層析的交換介質(zhì)為captos；該交換介質(zhì)是建立在新穎的高流速瓊脂基質(zhì)平臺上的層析介質(zhì)，其結合了高機械性、高動態(tài)載量和快速傳質(zhì)的性質(zhì)，能夠快速純化，滿足靈活工藝設計和最大限度的成本效益要求。相比不具葡聚糖修飾骨架的介質(zhì)，該交換介質(zhì)的結合載量大幅度提高。本發(fā)明對陽離子交換層析的具體分離條件不作嚴格限制，可以為本領域的常規(guī)分離條件。具體地，平衡液可以為ph值為5‐6的磷酸鹽緩沖溶液；此外，可以采用0.03‐0.12mol/l、ph值為5‐6的磷酸鹽緩沖溶液作為洗脫液進行洗脫。在本發(fā)明中，疏水層析是利用多肽/蛋白質(zhì)的疏水基團與親水基團進行分離，多肽/蛋白質(zhì)的表面通常具有疏水性基團，其與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時會結合；一般而言，離子強度(鹽濃度)越高，結合所形成的疏水鍵越強。在本發(fā)明的具體方案中，所述疏水層析的疏水介質(zhì)為苯基‐瓊脂糖凝膠，其能夠較好地分離目標抗菌肽。本發(fā)明對疏水層析的具體分離條件不作嚴格限制，可以為本領域的常規(guī)分離條件。具體地，平衡液可以為ph值5‐6、濃度0.2mol/l的磷酸鹽緩沖溶液；此外，可以采用0.02‐0.05mol/l、ph值為5‐6的磷酸鹽緩沖溶液作為洗脫液進行梯度洗脫。優(yōu)選地，采用減少鹽濃度的方式進行洗脫，例如依次采用0.05mol/l、0.04mol/l、0.03mol/l、0.02mol/l、0.01mol/l的ph值為5‐6的磷酸鹽緩沖溶液進行梯度洗脫。在洗脫時，將洗脫液的鹽濃度逐漸降低，能夠使疏水性不同的物質(zhì)逐個地先后被洗脫出來，從而使目的抗菌肽與其它親水性蛋白等物質(zhì)分離。特別是，在陽離子交換層析后進行疏水層析，能夠使兩種層析互補，因此，有利于分離陽離子交換層析中很難或不能分離的物質(zhì)。在本發(fā)明中，尺寸排阻層析是基于分子的大小不同進行分離，其是一種非吸附形式的層析方法，因此緩沖液的成分不會直接影響分離結果，目的抗菌肽可以在廣泛的ph值及離子強度下進行物質(zhì)的分離。尺寸排阻層析提供了靈活合適的層析條件的選擇，滿足進一步純化的需求。在本發(fā)明的具體方案中，所述尺寸排阻層析的填料為葡聚糖凝膠g‐100。本發(fā)明對尺寸排阻層析的具體分離條件不作嚴格限制，可以為本領域的常規(guī)分離條件。具體地，可以采用0.02‐0.08mol/l、ph值為5‐6的磷酸鹽緩沖溶液作為平衡液和洗脫液。本發(fā)明還提供一種抗菌方法，采用上述抗菌肽進行。上述抗菌肽對多種革蘭氏陰性菌，特別是腸桿菌科，具有很強的傷殺作用，不僅抗菌活性強，此外穩(wěn)定性好，有利于實際推廣應用。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例1制備的抗菌肽的hplc色譜圖；圖2為本發(fā)明實施例1制備的抗菌肽的質(zhì)譜圖。具體實施方式為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合本發(fā)明的附圖和實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。各實施例采用的原料：重組枯草芽孢桿菌菌株：按照公開號cn105671069a的中國發(fā)明專利所公開的方法制備得到；交換介質(zhì)：captos，購自通用電氣醫(yī)療集團(gehealthcare)；疏水介質(zhì)：苯基‐瓊脂糖凝膠，購自北京索萊寶科技有限公司(solarbio)；尺寸排阻層析填料：葡聚糖凝膠g‐100，購自上海玉博生物科技有限公司(pharmacia)；抗菌肽(seqidno：1)：采用abi433a全自動多肽合成儀合成得到。實施例1一、菌株改造采用常規(guī)方法對重組枯草芽孢桿菌菌株進行紫外誘變，篩選抑菌圈較大的菌株(以下稱為突變菌株)，備用。將大量沙門氏菌與少量上述突變菌株進行混合培養(yǎng)，在突變菌株活菌數(shù)增多并穩(wěn)定后，將少量菌懸液接種到沙門氏菌的純培養(yǎng)物中，反復混合培養(yǎng)，突變菌株在沙門氏菌的攻毒培養(yǎng)的選擇下，產(chǎn)生抗菌活性更強的枯草芽孢桿菌新菌株。對上述枯草芽孢桿菌新菌株進行遺傳穩(wěn)定性試驗，得到遺傳性穩(wěn)定的枯草芽孢桿菌新菌株(以下稱為改造菌株)。二、發(fā)酵將上述改造菌株接種到lb培養(yǎng)基中，于37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)22小時，10000r/min離心10min收集發(fā)酵液上清，備用。三、分離純化對上述發(fā)酵液上清依次進行陽離子交換層析、疏水層析和尺寸排阻層析，具體步驟為：1、陽離子交換層析以captos作為交換介質(zhì)對上述發(fā)酵液上清進行陽離子交換層析，其中采用ph5.8的磷酸鹽緩沖溶液平衡后，以2bv/h的速度上樣，隨后采用0.06mol/l、ph5.8的磷酸鹽緩沖溶液進行洗脫，每5min收集一次洗脫液并采用雙層瓊脂穿孔擴散法進行抑菌試驗，收集具有抑菌圈的洗脫液。2、疏水層析以苯基‐瓊脂糖凝膠作為疏水介質(zhì)對上述收集的洗脫液進行疏水層析，其中采用0.2mol/l、ph5.8的磷酸鹽緩沖溶液平衡后，以2bv/h的速度上樣，隨后依次采用0.05mol/l、0.04mol/l、0.03mol/l、0.02mol/l、0.01mol/l的ph5.8的磷酸鹽緩沖溶液進行梯度洗脫，每5min收集一次洗脫液并進行抑菌試驗，收集具有抑菌圈的洗脫液。3、尺寸排阻層析以葡聚糖凝膠g‐100作為填料對上述收集的洗脫液進行尺寸排阻層析，其中采用ph5.8的磷酸鹽緩沖溶液平衡后，以2bv/h的速度上樣，隨后采用ph5.8的磷酸鹽緩沖溶液進行洗脫，每5min收集一次洗脫液并進行抑菌試驗，收集具有抑菌圈的洗脫液，按常規(guī)方式超濾濃縮、干燥、凍干后，得到純化的抗菌肽，密封保存。四、hplc‐ms分析檢測采用agilent1260infinity二元液相色譜系統(tǒng)(購自agilent公司)對上述制備得到的抗菌肽進行分析檢測，其中：色譜柱為agilentzorbax300stablebond(300sb)c8hplc色譜柱(購自agilent公司)；流動相a：0.1％的三氟乙酸水溶液；流動相b：80％的乙腈水溶液；柱溫：25℃，檢測波長：280nm；最大壓力：200bar；時間：65min；流速：0.700ml/min；上樣量：20ug，分析梯度見表1，檢測結果見圖1。表1hplc分析梯度時間/min03.0010.0040.0055.0057.0065.00a(％)95.095.091.083.070.095.095.0b(％)5.05.09.017.030.05.05.0質(zhì)譜檢測條件：鞘氣體流量(arb)：15；輔助氣體流量(arb)：5；熱噴涂電壓(kv)：4.7；毛細管溫度(℃)：275；毛細管電壓(v)：49；套管透鏡補償電壓(v)：120；檢測結果見圖2。結果表明：上述制備的抗菌肽的氨基酸序列為：tyr‐ile‐pro‐gln‐pro‐arg‐pro‐pro‐his‐pro‐arg‐leu(seqidno：1)。實施例2本實施例以化學合成方法合成抗菌肽，其中采用abi433a全自動多肽合成儀進行合成，抗菌肽的氨基酸序列為：tyr‐ile‐pro‐gln‐pro‐arg‐pro‐pro‐his‐pro‐arg‐leu(seqidno：1)。對照例1以按照公開號cn105671069a的中國發(fā)明專利所公開的方法制備得到的重組枯草芽孢桿菌菌株作為對照，參照實施例1方法對該重組枯草芽孢桿菌菌株進行發(fā)酵、分離純化和hplc‐ms分析檢測。結果表明：上述重組枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵產(chǎn)生的抗菌肽為蜜蜂肽。試驗例1抗菌試驗采用標準瓊脂孔穴擴散法分別對實施例1、實施例2和對照例1的抗菌肽進行抗菌試驗。分別將實施例1、實施例2和對照例1的抗菌肽配制成相同濃度的抗菌肽溶液，以大腸桿菌k88、金黃色葡萄球菌、沙門氏桿菌、糞腸球菌和糞鏈球菌為實驗菌株，將各實驗菌株培養(yǎng)液分別與55℃的lb固體培養(yǎng)基25ml混勻后平鋪板待其凝固后，用滅過菌的打孔器(直徑5mm)打孔，孔中分別滴加各抗菌肽溶液，在37℃培養(yǎng)12h，測定各抑菌圈直徑(mm)，同時以抑菌圈直徑計算殺菌活力(x)和殺菌效價(u/ml)，計算公式如下：殺菌活力(x)＝(抑菌圈直徑-2.3mm)/2殺菌效價(u/ml)＝2x×1000觀察抑菌圈大小，結果見表2。表2各抗菌肽的抗菌活性由表1結果可知：本發(fā)明的抗菌肽的抗菌活性顯著高于蜜蜂肽。試驗2穩(wěn)定性試驗分別將實施例1、實施例2和對照例1的抗菌肽在室溫(28‐32℃)下連續(xù)保存6個月，定期(每月)按照試驗例1方法進行抗菌試驗，保存6個月后的抗菌結果見表3。表3各抗菌肽的穩(wěn)定性表3中，“/”代表未檢出。穩(wěn)定性試驗結果表明：常規(guī)的蜜蜂肽在室溫下保存1個月后基本不具有抗菌活性，而本發(fā)明的抗菌肽在室溫下連續(xù)保存6個月后，抗菌活性僅下降10％左右，說明本發(fā)明的抗菌肽具有良好的穩(wěn)定性。最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術方案的范圍。<110>甘肅奧林貝爾生物科技集團有限公司<120>抗菌肽及其制備方法和應用<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>12<212>prt<213>人工序列<400>1tyrileproglnproargproprohisproargleu1510當前第1頁12當前第1頁12