本發(fā)明涉及他克莫司生產技術領域，具體地，涉及一種提高他克莫司產量的發(fā)酵方法。

背景技術：

他克莫司(fk506)是一種由鏈霉菌產生的新型23元大環(huán)內酯聚酮類物質，具有很強的免疫抑制作用，其效力比應用較廣的環(huán)孢霉素a(cyclosporina，csa)高近100倍，而毒副作用比環(huán)孢素a更少，還具有低死亡率、高移植存活率、依賴性小等優(yōu)點。

他克莫司廣泛應用于特應性皮炎、變應性接觸性皮炎、銀屑病、紅斑狼瘡、扁平苔癬、白癜風、nethenton綜合癥和抑制宿主病等自身免疫疾病的治療。目前臨床應用于預防肝臟或腎臟移植術后的移植物排斥反應，治療肝臟、胰腺、腎臟、心臟、肺等實體器官移植術后應用其他免疫抑制藥物無法控制的移植物排斥反應。然而受制于他克莫司發(fā)酵水平較低、生產成本高等因素，很多器官移植患者在經(jīng)濟上無法接受，導致其推廣應用受到了一定的限制。

目前針對他克莫司產量低下的問題，國內外展開了一系列的研究，從實驗效果來看，菌種選育無疑是一種能夠有效提高他克莫司產量的方法。例如：王秀琴等采用通過復合誘變的方法對出發(fā)菌株筑波鏈霉菌進行處理，得到一株高產菌株，其發(fā)酵產量較出發(fā)菌株提高73.6%。鄭軍榮等應用化學和物理誘變劑對他克莫司產生菌進行菌種誘變，并利用莽草酸和哌可酸及其相應的結構類似物作為選擇壓力篩選出高產突變株，相對發(fā)酵效價提高了約2倍。jung等通過逐漸提高培養(yǎng)基中他克莫司的濃度來增加菌株對產物的耐受性，最終獲得的菌株產量達到972mg/l。袁暉等通過紫外誘變加抗性篩選的方法處理產他克莫司的鏈霉菌，得到1株高產菌，其50l罐產量達到918mg/l。

但是菌種選育工作的不確定性高、工作強度大，并且選育的高產菌種始終面臨著生產能力退化的問題，為他克莫司的生產埋下了不穩(wěn)定的隱患。因此有必要研究開發(fā)新的方法，提高他克莫司的產量，以滿足實際應用的需求。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的上述缺陷，提供一種提高他克莫司產量的發(fā)酵方法，使得他克莫司的發(fā)酵產量明顯提高。

本發(fā)明的上述目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的：

一種提高他克莫司產量的發(fā)酵方法，在常規(guī)的他克莫司發(fā)酵過程中加入吸附樹脂以及流加補充糊精，所述吸附樹脂在發(fā)酵時間為48h～60h時加入，所述吸附樹脂的加入體積與發(fā)酵液體積比為0.001～0.1:1；所述流加補充糊精在發(fā)酵時間為1h～60h時開始補加，所述流加補充糊精的流加速度按每小時每100ml發(fā)酵液加入0.5～3g糊精。

本發(fā)明采用新型發(fā)酵工藝，在恰當?shù)陌l(fā)酵過程中加入有效量的可吸附他克莫司的樹脂，有效降低由于他克莫司的積累而引起對自身菌體的有害作用；同時在發(fā)酵過程中流加補充糊精，保證發(fā)酵體系擁有充足的能量，延長生產菌的生產周期，從而提高他克莫司產量。

所述吸附樹脂為中等極性大孔樹脂和/或非極性大孔樹脂。

優(yōu)選地，所述吸附樹脂包括但不限于xad16、hp20、hz801、hzd-3、sp850和hz830中的任一種或多種。最優(yōu)選地，所述吸附樹脂為xad16樹脂。

優(yōu)選地，所述吸附樹脂的加入體積與發(fā)酵液體積比為0.03～0.1:1。最有選地，所述吸附樹脂的加入體積與發(fā)酵液體積比為0.1:1。

優(yōu)選地，所述流加補充糊精在發(fā)酵時間為48h～60h時開始補加。

優(yōu)選地，所述流加補充糊精的流加速度按每小時每100ml發(fā)酵液加入1～2g糊精。更優(yōu)選地，所述流加補充糊精的流加速度按每小時每100ml發(fā)酵液加入2g糊精。

以上所述他克莫司的發(fā)酵生產工藝得到的他克莫司。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明提供的他克莫司的發(fā)酵生產工藝，包括以下改進：1)添加特異性吸附他克莫司的吸附樹脂；2)發(fā)酵過程中流加補充糊精。在他克莫司發(fā)酵生產時添加特異性吸附樹脂，這樣在發(fā)酵時吸附樹脂在達到吸附平衡之前將持續(xù)的吸附發(fā)酵時產生的他克莫司，降低產物在發(fā)酵液中的濃度，解決了他克莫司發(fā)酵時的反饋抑制作用，實現(xiàn)連續(xù)液體發(fā)酵生產他克莫司，提高他克莫司產量；另一方面，吸附樹脂經(jīng)過再生處理后可重復使用，從而進一步降低生產成本。糊精的流加補充保證了發(fā)酵體系擁有充足的能量，延長生產菌的生產周期，從而提高他克莫司產量。相比現(xiàn)有的發(fā)酵方法，本發(fā)明的發(fā)酵方法可以大大提高發(fā)酵產物他克莫司的產量，降低生產成本，具有非常好的工業(yè)化應用前景。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步解釋說明，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明范圍的限制，但凡采用等同替換或等效變換的形式所獲得的技術方案，均應包括在本發(fā)明權利要求的保護范圍之內。

以下實施例和對比例中，所用原料均為市售商品。

實施例1

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時后加入xad16樹脂，樹脂體積與發(fā)酵液體積比為0.1:1，同時開始流加補充糊精，流加速度按每小時每100ml發(fā)酵液加入0.5g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結束發(fā)酵。使用濾布過濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測解析液中他克莫司的含量，結果為1022mg/l。

實施例2

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時后加入xad16樹脂，樹脂體積與發(fā)酵液體積比為0.1:1，同時開始流加補充糊精，流加速度按每小時每100ml發(fā)酵液加入2g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結束發(fā)酵。使用濾布過濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測解析液中他克莫司的含量，結果為1248mg/l。

實施例3

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)60小時后加入hp20樹脂，樹脂體積與發(fā)酵液體積比為0.001:1，同時開始流加補充糊精，流加速度按每小時每100ml發(fā)酵液加入1g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結束發(fā)酵。使用濾布過濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測解析液中他克莫司的含量，結果為663mg/l。

實施例4

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時后加入hz801樹脂，樹脂體積與發(fā)酵液體積比為0.03:1，同時開始流加補充糊精，流加速度按每小時每100ml發(fā)酵液加入3g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結束發(fā)酵。使用濾布過濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測解析液中他克莫司的含量，結果為779mg/l。

實施例5

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)1小時后開始流加補充糊精，流加速度按每小時每100ml發(fā)酵液加入0.5g糊精。培養(yǎng)至48h時加入sp850樹脂，樹脂體積與發(fā)酵液體積比為0.03:1。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結束發(fā)酵。使用濾布過濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測解析液中他克莫司的含量，結果為713mg/l。

實施例6

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時后加入hzd-3樹脂，樹脂體積與發(fā)酵液體積比為0.1:1，同時開始流加補充糊精，流加速度按每小時每100ml發(fā)酵液加入0.5g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結束發(fā)酵。使用濾布過濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測解析液中他克莫司的含量，結果為983mg/l。

實施例7

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時后加入hz830樹脂，樹脂體積與發(fā)酵液體積比為0.1:1，同時開始流加補充糊精，流加速度按每小時每100ml發(fā)酵液加入0.5g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結束發(fā)酵。使用濾布過濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測解析液中他克莫司的含量，結果為921mg/l。

對比例1

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)至170h，結束發(fā)酵。使用濾布過濾上述發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測解析液中他克莫司的含量，結果為492mg/l。

對比例2

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時后加入xad16樹脂，樹脂體積與發(fā)酵液體積比為0.1:1，繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結束發(fā)酵。使用濾布過濾上述發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測解析液中他克莫司的含量，結果為873mg/l。

對比例3

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，調節(jié)ph為7.8，分裝三角瓶，121℃實消20min，備用。按10%培養(yǎng)基體積的接種量接入發(fā)酵種子液。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度200rpm，通氣量1.0v/v·min。培養(yǎng)48小時后開始流加補充糊精，流加速度按每小時每100ml發(fā)酵液加入2g糊精。繼續(xù)培養(yǎng)至170h，結束發(fā)酵。使用濾布過濾所得發(fā)酵液，收集含有他克莫司的吸附樹脂和菌絲體，用2倍體積的丙酮溶液充分解析，使用hplc檢測解析液中他克莫司的含量，結果為603mg/l。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。