本發(fā)明涉及生物信息學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種檢測微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定性的方法及裝置。
背景技術(shù)：
：人類基因組中都存在由均勻分布的2～6個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成的簡單重復(fù)序列，即微衛(wèi)星位點，部分結(jié)直腸癌病人的特定堿基重復(fù)序列會發(fā)生插入或缺失，這個現(xiàn)象與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但這一現(xiàn)象并不能作為疾病的診斷和患病風(fēng)險判斷的依據(jù)?，F(xiàn)有技術(shù)中，該檢測通常包括：從樣本中提取dna，捕獲腫瘤相關(guān)基因，進(jìn)行高通量測序，并結(jié)合微衛(wèi)星位點的序列信息對結(jié)直腸癌樣本的微衛(wèi)星位點穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。目前常用的微衛(wèi)星位點穩(wěn)定性檢測方法是基于檢測美國國家腫瘤研究所曾經(jīng)通過的msi檢測的統(tǒng)一檢測標(biāo)準(zhǔn)：檢測5個重復(fù)區(qū)域(微衛(wèi)星位點)的不穩(wěn)定情況來判定樣本的微衛(wèi)星位點穩(wěn)定情況。然而，這種方法由于位點數(shù)較少的限制常常會存在假陽性和假陰性的情況發(fā)生。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在提供一種檢測微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定性的方法及裝置，以降低現(xiàn)有技術(shù)中微衛(wèi)星位點穩(wěn)定性檢測中假陽性和假陰性的發(fā)生概率。為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種檢測微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定性的方法。該方法包括以下步驟：s1，樣本處理：包括樣本dna提取、打斷、加接頭、雜交捕獲、洗脫、富集及測序；s2，數(shù)據(jù)處理：包括利用比對軟件將測序序列比對到參考基因組上，得到比對文件，未比對上的序列形成軟截斷，然后根據(jù)比對的位置進(jìn)行排序，并用samtools軟件建立index；s3，檢測微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定性：包括：s31，確定待檢測微衛(wèi)星位點的區(qū)域；s32：對s31中確定待檢測微衛(wèi)星位點，確定比對文件中在相應(yīng)位置的重復(fù)類型，對于各種重復(fù)類型，計算病理組織樣本和對照樣本每個位點每種重復(fù)類型各自所支持的reads條數(shù)；s33：對s32中的各種重復(fù)類型和位點進(jìn)行過濾，使用曼惠特尼秩和檢驗判定每個位點在病理組織樣本和對照樣本中的差異情況，最后，使用有顯著差異的位點覆蓋率確定樣本的微衛(wèi)星不穩(wěn)定情況。進(jìn)一步地，s2中，利用bwa-mem比對軟件將測序序列比對到參考基因上。進(jìn)一步地，方法用于檢測結(jié)直腸癌微衛(wèi)星位點的不穩(wěn)定性。確定待檢測微衛(wèi)星位點的區(qū)域包括：進(jìn)一步地，樣本dna包括病理組織樣本dna和對照樣本血液白細(xì)胞dna。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種檢測微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定性的裝置。該裝置包括：樣本處理單元：用于樣本dna提取、打斷、加接頭、雜交捕獲、洗脫、富集及測序；數(shù)據(jù)處理單元：用于利用比對軟件將測序序列比對到參考基因組上，得到比對文件，未比對上的序列形成軟截斷，然后根據(jù)比對的位置進(jìn)行排序，并用samtools軟件建立index；微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定性檢測單元，包括：區(qū)域確定單元：用于確定待檢測微衛(wèi)星位點的區(qū)域；重復(fù)類型及數(shù)據(jù)處理單元：用于對區(qū)域確定單元中確定待檢測微衛(wèi)星位點，確定比對文件中在相應(yīng)位置特定的重復(fù)類型，對于各種重復(fù)類型，計算病理組織樣本和對照樣本每個位點每種重復(fù)類型各自所支持的reads條數(shù)；不穩(wěn)定性分析單元：對重復(fù)類型及數(shù)據(jù)處理單元中的各種重復(fù)類型和位點進(jìn)行過濾，使用曼惠特尼秩和檢驗判定每個位點在病理組織樣本和對照樣本中的差異情況，最后，使用有顯著差異的位點覆蓋率確定樣本的微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定情況。進(jìn)一步地，數(shù)據(jù)處理單元中，利用bwa-mem比對軟件將測序序列比對到參考基因組上。進(jìn)一步地，裝置用于檢測結(jié)直腸癌微衛(wèi)星位點的不穩(wěn)定性。區(qū)域確定單元確定待檢測微衛(wèi)星位點的區(qū)域包括：應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲的高通量測序技術(shù)，可以極大地提高檢測的位點數(shù)量，然后再判斷病理樣本和對照樣本的差異，加上統(tǒng)計學(xué)檢驗，來確定樣本的微衛(wèi)星的穩(wěn)定性，降低了現(xiàn)有技術(shù)中微衛(wèi)星位點穩(wěn)定性檢測中假陽性和假陰性的發(fā)生概率。附圖說明構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一實施方式的檢測微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定性的方法的流程示意圖。具體實施方式需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供了一種檢測微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定性的方法。該方法包括以下步驟：s1，樣本處理：包括樣本dna提取、打斷、加接頭、雜交捕獲、洗脫、富集及測序；s2，數(shù)據(jù)處理：包括利用比對軟件將測序序列比對到參考基因組上，得到比對文件，未比對上的序列形成軟截斷，然后根據(jù)比對的位置進(jìn)行排序，并用samtools軟件建立index；s3，檢測微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定性：包括：s31，確定待檢測微衛(wèi)星位點的區(qū)域；s32：對s31中確定待檢測微衛(wèi)星位點，確定比對文件中在相應(yīng)位置的重復(fù)類型，對于各種重復(fù)類型，計算病理組織樣本和對照樣本每個位點每種重復(fù)類型各自所支持的reads條數(shù)；s33：對s32中的各種重復(fù)類型和位點進(jìn)行過濾，使用曼惠特尼秩和檢驗判定每個位點在病理組織樣本和對照樣本中的差異情況，最后，使用有顯著差異的位點覆蓋率確定樣本的微衛(wèi)星不穩(wěn)定情況。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲的高通量測序技術(shù)，判斷病理樣本和對照樣本的差異，加上統(tǒng)計學(xué)檢驗，來確定樣本的微衛(wèi)星的穩(wěn)定性，降低了現(xiàn)有技術(shù)中微衛(wèi)星位點穩(wěn)定性檢測中假陽性和假陰性的發(fā)生概率。上述方法中，步驟s31，確定待檢測微衛(wèi)星位點的區(qū)域，可以在整個檢測微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定性的方法實施前單獨確認(rèn)完成，以便提高后續(xù)操作效率。優(yōu)選的，s2中，利用bwa-mem比對軟件將測序序列比對到參考基因上，以便后續(xù)的標(biāo)準(zhǔn)化操作。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，該方法用于檢測結(jié)直腸癌微衛(wèi)星位點的不穩(wěn)定性。本發(fā)明的發(fā)明人篩選出了43個結(jié)直腸癌高度相關(guān)的微衛(wèi)星位點，使用這些位點，判斷病理樣本和對照樣本的差異，加上統(tǒng)計學(xué)檢驗，來確定樣本的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，具有高靈敏性和高特異性的特點。43個結(jié)直腸癌高度相關(guān)的微衛(wèi)星位點的區(qū)域包括：優(yōu)選的，樣本dna包括病理組織樣本dna和對照樣本血液白細(xì)胞dna。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲技術(shù)、高通量測序技術(shù)，結(jié)合確定的43個微衛(wèi)星重復(fù)位點信息，提供了一套高特異性、高靈敏性的從dna中檢測結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的流程，如圖1所示，主要步驟如下：包括檢測程序外完成的部分和檢測程序內(nèi)完成的部分，其中檢測程序外完成的部分包括：樣本處理(圖1中未顯示，包括樣本dna提取、打斷、加接頭、雜交捕獲(使用特定序列的探針捕獲常發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定的基因)、洗脫、富集及測序)和對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理(包括利用比對軟件將測序序列比對到參考基因上，得到比對文件，未比對上的序列形成軟截斷，然后根據(jù)比對的位置進(jìn)行排序，并用samtools軟件建立index)；檢測程序內(nèi)完成的部分包括：分別確定病理組織和對照樣本43個位點的重復(fù)類型，提取每種重復(fù)類型支持的序列條數(shù)，對給點的所有重復(fù)類型進(jìn)行過濾，基于序列條數(shù)和曼惠特尼秩和檢驗確定每個位點的差異顯著性，計算差異顯著性位點占比，判斷樣本狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供了一種檢測微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定性的裝置。該裝置包括：樣本處理處理單元：用于樣本dna提取、打斷、加接頭、雜交捕獲、洗脫、富集及測序；數(shù)據(jù)處理單元：用于利用比對軟件將測序序列比對到參考基因上，得到比對文本，未比對上的序列形成軟截斷，然后根據(jù)比對的位置進(jìn)行排序，并用samtools軟件建立index；微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定性檢測單元，包括：區(qū)域確定單元：用于確定待檢測微衛(wèi)星位點的區(qū)域；重復(fù)類型及數(shù)據(jù)處理單元：用于對區(qū)域確定單元中確定待檢測微衛(wèi)星位點，確定比對文件中在相應(yīng)位置特定的重復(fù)類型，對于各種重復(fù)類型，計算病理組織樣本和對照樣本每個位點每種重復(fù)類型各自所支持的reads條數(shù)；不穩(wěn)定性分析單元：對重復(fù)類型及數(shù)據(jù)處理單元中的各種重復(fù)類型和位點進(jìn)行過濾，使用曼惠特尼秩和檢驗判定每個位點在病理組織樣本和對照樣本中的差異情況，最后，使用有顯著差異的位點覆蓋率確定樣本的微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定情況。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲的高通量測序技術(shù)，判斷病理樣本和對照樣本的差異，加上統(tǒng)計學(xué)檢驗，來確定樣本的微衛(wèi)星的穩(wěn)定性，降低了現(xiàn)有技術(shù)中微衛(wèi)星位點穩(wěn)定性檢測中假陽性和假陰性的發(fā)生概率。優(yōu)選的，數(shù)據(jù)處理單元中，利用bwa-mem比對軟件將測序序列比對到參考基因上。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，裝置用于檢測結(jié)直腸癌微衛(wèi)星位點的不穩(wěn)定性。優(yōu)選的，區(qū)域確定單元確定待檢測微衛(wèi)星位點的區(qū)域包括：下面將結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果，下列實施例中沒有詳細(xì)描述的部分均可采用現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)技術(shù)手段實現(xiàn)。實施例1在本實施例的第一部分中，待檢的是已知微衛(wèi)星位點穩(wěn)定的結(jié)直腸癌病理樣本及相應(yīng)的對照樣本。在本發(fā)明的實施例中，主要試劑用品是市售的，信息如下：本實施例中，操作步驟如下：1.提取dna(病理組織樣本dna和對照樣本血液白細(xì)胞dna)，利用熒光定量計(qubit)進(jìn)行定量，其濃度為3.8ng/ul，體積為130ul；利用超聲破碎儀(covaris)對樣品進(jìn)行片段化，使dna片段大小在200-400bp之間，然后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小是否符合要求。2.先將片段化的dna樣品進(jìn)行磁珠純化，然后進(jìn)行末端修復(fù)和3’端腺苷化，體系配置見表1，基本步驟如下：先在20℃溫浴30min，然后在65℃溫浴30min結(jié)束反應(yīng)。表1末端修復(fù)和3’端腺苷化緩沖液7μl末端修復(fù)和3’端腺苷化酶混合液3μldna50ul(500ng)3.將上述修復(fù)后的dna進(jìn)行接頭連接，接頭連接體系詳見表2，在20℃溫浴15min。表2試劑體積帶標(biāo)簽的接頭2.5μldna樣品60ul連接反應(yīng)液30ul連接酶10ul無核酸酶的水7.5ul4.將上述接頭連接后的產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化，然后進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到足量的帶接頭的dna片段，基本步驟如下：先在98℃預(yù)變性45s，其次在98℃變性15s，然后在60℃退火30s，72℃延伸30s；重復(fù)變性退火延伸過程7次；最后在72℃延伸1min，結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增體系見表3：表3試劑體積快速熱啟動聚合酶25μl擴(kuò)增引物1ul連上接頭的dna片段24μl5.對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化后，利用qubit定量得到濃度后，取出500ng擴(kuò)增產(chǎn)物，使用濃縮儀將擴(kuò)增產(chǎn)物體積濃縮到4.4ul，然后進(jìn)行封閉和探針雜交，雜交反應(yīng)體系如下表4所示：表4試劑體積封閉試劑混合液5.6μlp5、p7封閉試劑2ul快速封閉試劑5ulrna酶封閉試劑2ul針對目標(biāo)區(qū)域的生物素探針2ul雜交緩沖液6ul無核酸酶的水3ulpcr擴(kuò)增產(chǎn)物4.4ul雜交反應(yīng)條件如下表5所示：表56.使用鏈霉親合素磁珠對探針結(jié)合的樣品進(jìn)行捕獲，步驟如下：將50ul磁珠加入1.5ml離心管，置于磁力架上，棄上清，用200ul連接緩沖液清洗三遍后，使用200ul連接緩沖液重懸磁珠，將與探針雜交的樣品加入磁珠，混勻儀上顛倒混勻30min，置于磁力架上，棄上清，用清洗液1清洗1遍，然后用預(yù)熱到65℃的清洗液2清洗3遍，期間保證磁珠和緩沖液2的溫度在65℃。最后置于磁力架上，棄上清，加入38ul無核酸酶的水，重懸磁珠。7.將磁珠捕獲到的dna片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增體系見下表6，得到足量的加上接頭的dna片段，基本步驟如下：先在98℃預(yù)變性2min，其次在98℃變性30s，然后在60℃退火30s，72℃延伸1min；重復(fù)變性退火延伸過程14次；最后在72℃延伸5min，結(jié)束反應(yīng)。表68.將得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化，然后利用qpcr定量，利用2100進(jìn)行片段大小檢測。9.測序，在x-ten基因測序儀上完成測序，測序平臺將得到的光信號轉(zhuǎn)化為堿基序列下機(jī)數(shù)據(jù)為fq文件存儲所有測序片段結(jié)果。在本實施例的第二部分中，將下機(jī)數(shù)據(jù)fq文件比對上參考基因組，去除低質(zhì)量序列，使用檢測流程進(jìn)行檢測，即分別確定病理組織和對照樣本43個位點的重復(fù)類型，提取每種重復(fù)類型支持的序列條數(shù)，對給點的所有重復(fù)類型進(jìn)行過濾，基于序列條數(shù)和曼惠特尼秩和檢驗確定每個位點的差異顯著性，計算差異顯著性位點占比，判斷樣本狀態(tài)。樣本檢測結(jié)果如表7所示：表7目前設(shè)定閾值為0.2，該樣本顯著位點覆蓋率為0.1，小于閾值，可以判定為微衛(wèi)星狀態(tài)穩(wěn)定樣本。另外，使用其他25例已知微衛(wèi)星狀態(tài)的結(jié)直腸癌樣本按照實施例1的方法進(jìn)行檢測，所有樣本均可正確檢出。從以上的描述中，可以看出，本發(fā)明上述的實施例實現(xiàn)了如下技術(shù)效果：與現(xiàn)有技術(shù)中使用五個微衛(wèi)星位點進(jìn)行檢測的方法相比，本方法檢測的位點更加全面(43個位點)，可以很好地避免假陽性和假陰性的情況發(fā)生。除此之外，發(fā)展的檢測流程可以很好地利用病理樣本和對照樣本的測序數(shù)據(jù)，輔之自行設(shè)計的統(tǒng)計學(xué)判斷方法，使得檢測的精度更高，效果更好。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12