本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
：，涉及菊芋液泡型(v型)質(zhì)子泵c亞基基因htvhac1的克隆及其工程應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：植物細(xì)胞的顯著特征之一是有一個(gè)或幾個(gè)巨大的液泡，在成熟的植物細(xì)胞中，液泡的體積一般可達(dá)到細(xì)胞體積的90％以上。液泡是植物細(xì)胞中養(yǎng)分離子(如氮，磷，鉀)或有害離子(如重金屬和大量的鈉離子)的主要的儲(chǔ)存器官。在鹽土中過量的鈉離子是對植物造成離子特異傷害的最初原因(flowers,1997；testeranddavenport,2003；kronzuckerandbritto,2011)。目前全世界總共大約2.3億公頃的灌溉農(nóng)地中約20％在不同程度上受到灌溉和施肥造成的鹽漬化危害(flowers,1977；zhu,2002；flowers,2004)。提高植物將鈉離子儲(chǔ)存(區(qū)隔)入液泡是提高植物抗鹽性的重要途徑之一((cardenetal.,2003；cuinetal.,2003))。另外鉀是植物生長的必須的大量元素，由于鉀，鈉同屬堿金屬家族，離子水化半徑和活性有著較大的相似性，增強(qiáng)對鉀的吸收和儲(chǔ)存是控制作物k+/na+離子平衡，提高植物的抗鹽性的重要途徑(shabalaandcuin,2008)。植物細(xì)胞膜電位為負(fù)值而液泡膜電位為正值，通常情況下將陽離子(如鉀、鈉等)區(qū)隔入液泡是一個(gè)耗能過程(汪香梅和黃敏仁,2001)。在液泡膜上的很多離子轉(zhuǎn)運(yùn)體都不能直接催化atp產(chǎn)生能量，而是需要利用間接的、跨液泡膜的質(zhì)子梯度所提供的能量(趙可夫和范海,2000)。跨液泡膜的質(zhì)子梯度主要有膜上的焦磷酸水解酶(h+-ppase)和液泡型質(zhì)子泵(v-h+-atpas)提供。植物v-h+-atpase是一個(gè)分子質(zhì)量為400～650kd的多聚體復(fù)合酶，由多個(gè)亞基組成，呈現(xiàn)出“球莖”結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)與葉綠體及線粒體的f-h+-atpase極為相似，如圖1所示，它由兩部分組成，膜外親水結(jié)構(gòu)域(v1)和膜內(nèi)疏水結(jié)構(gòu)域(v0)。v1部分由8個(gè)亞基(a～h)構(gòu)成，v0部分由6個(gè)亞基(a,c,c’,c”,d,e)構(gòu)成，其中c亞基是一個(gè)疏水亞基，參與質(zhì)子通道的形成，也是目前為止研究最多的一個(gè)(tsuyoshinishi,2002)。由于它在不同種屬間的同源性大大超過了65％，因此認(rèn)為它是目前已知的最為保守的脂質(zhì)蛋白。c亞基是分子量約為16kd，以4拷貝對稱排列同c’和c”形成一個(gè)六聚體(finbowme,1997)，有6個(gè)質(zhì)子結(jié)合點(diǎn)，c亞基中2/3的氨基酸殘基構(gòu)成4個(gè)跨膜的α螺旋，并在第四個(gè)跨膜的α螺旋上含有一個(gè)高度保守的谷氨酸(glu)殘基，推測它是質(zhì)子的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)也是v-h+-atpase活性抑制劑二環(huán)己碳二亞胺(dccd)的作用位點(diǎn)，c亞基在v-h+-atpase的組裝中起非常重要的作用，是v-h+-atpase全酶的必要部分(nelson,2003)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供菊芋v型質(zhì)子泵c亞基的基因htvhac1，其序列如seqidno.1所示。菊芋v型質(zhì)子泵c亞基基因htvhac1的克隆，包括如下步驟：1)提取南菊芋塊莖的rna反轉(zhuǎn)錄為cdna，以cdna作為模板；2)登入ncbi網(wǎng)站查找不同物種的vhac基因的蛋白或者cdna編碼的氨基酸序列，進(jìn)行多序列比對，確定了合適的保守區(qū)域，利用引物設(shè)計(jì)軟件primer5.0設(shè)計(jì)引物序列p1和p2，p1如seqidno.2所述，p2為seqidno.3所述；3)htvhac1基因pcr擴(kuò)增：pcrbuffer2.5μl，dntpmix2μl，上下游引物各1μl，模板1μl,kod高保真酶0.5μl，雙蒸水17μl，pcr擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，58℃復(fù)性延伸2min，35個(gè)循環(huán)后，72℃5min充分延伸，10℃保持，pcr擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，htvhac1基因的大小為549b，序列如seqidno.1所示；4)htvhac1基因載體的構(gòu)建，將htvhac1基因pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后切膠回收，將純化后片段與pmd19-t中間載體連接，酶連體系包含1μl的pmd19-t載體，7μl的pcr純化產(chǎn)物，1μlt4連接酶，1μlt4buffer，16℃連接過夜，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中涂在含有50μg/mlamp的lb固體培養(yǎng)基上生長12h-16h后，挑取陽性菌落進(jìn)行測序，將測序正確的菌液加入等體積體積比30％甘油于-70℃保存?zhèn)溆茫@得含有htvhac1基因全長序列的重組質(zhì)粒，命名為htvhac1-p。本發(fā)明還公開了菊芋v型質(zhì)子泵c亞基基因htvhac1的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：1)擴(kuò)增基因htvhac1、bamhi和kpni酶切位點(diǎn)，與peasy-blunt中間載體連接，獲得重組質(zhì)粒htvhac1-pea；2)將步驟1)獲得的重組質(zhì)粒htvhac1-pea插入到ptck303載體構(gòu)建表達(dá)載體ptck303-htvhac1；3)經(jīng)酶切驗(yàn)證后的表達(dá)載體ptck303-htvhac1轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌，將獲得的轉(zhuǎn)有ptck303-htvhac1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織，共培養(yǎng)后經(jīng)過選擇培養(yǎng)、分化、生根、煉苗得到轉(zhuǎn)基因植株。優(yōu)選的，基因htvhac1在增強(qiáng)植物耐鹽能力中的應(yīng)用。優(yōu)選的，基因htvhac1在提高植物在貧瘠土壤中的產(chǎn)量中的應(yīng)用。優(yōu)選的，基因htvhac1在開發(fā)耐鹽水稻新品種中的應(yīng)用。優(yōu)選的，基因htvhac1在培育貧瘠土壤中高產(chǎn)水稻新品種中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：1.本發(fā)明中，首次克隆htvhac1基因并發(fā)現(xiàn)htvhac1基因構(gòu)建的重組表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)染到野生型水稻日本晴中，達(dá)到理想耐鹽性并能提高作物產(chǎn)量。2.對htvhac1的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行分析，htvhac1定位為液泡膜型。3.對htvhac1轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，獲得單拷貝且能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因水稻株系。4.htvhac1超表達(dá)后不但增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽能力，而且與對照野生型相比，在低養(yǎng)分條件下生物量明顯增大，低鉀環(huán)境下各株系趨勢更加顯著。附圖說明圖1v-atpase的分子結(jié)構(gòu)；圖2htvhac1基因cdna全長的克隆電泳檢測圖；圖3htvhac1的跨膜結(jié)構(gòu)分析；圖4植物vhac1的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；圖5htvhac1轉(zhuǎn)基因材料real-timepcr鑒定；圖6htvhac1基因的亞細(xì)胞定位結(jié)果；圖7htvhac1轉(zhuǎn)基因材料正常處理結(jié)果；圖8htvhac1轉(zhuǎn)基因材料低鉀處理結(jié)果；圖9htvhac1轉(zhuǎn)基因材料低營養(yǎng)脅迫結(jié)果；圖10ptck303載體圖；圖11pmd19-t載體圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例方式對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。具體實(shí)施如下：1.菊芋htvhac1基因的獲得，其步驟如下：1)提取南菊芋1號(hào)塊莖的rna反轉(zhuǎn)錄為cdna，以cdna作為模板。2)登入ncbi網(wǎng)站查找不同物種的vhac基因的蛋白或者cdna編碼的氨基酸序列，進(jìn)行多序列比對，確定了合適的保守區(qū)域，利用引物設(shè)計(jì)軟件primer5.0設(shè)計(jì)引物序列p1和p2，p1如seqidno.2所述，p2為seqidno.3所述；p1:5’-atgtcagaaactgcgatatt-3’(seqidno.2)；p2:5’-ctacacagtagtaggccatg-3’(seqidno.3)。3)htvhac1基因pcr擴(kuò)增：pcrbuffer2.5μl，dntpmix2μl，上下游引物各1μl，模板1μl,kod高保真酶0.5μl，雙蒸水17μl，pcr擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，58℃復(fù)性延伸2min，35個(gè)循環(huán)后，72℃5min充分延伸，10℃保持，pcr擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，htvhac1基因的大小為549b，序列如seqidno.1所示；seqidno.1如下：4)htvhac1基因載體的構(gòu)建，將htvhac1基因pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后切膠回收，將純化后片段與pmd19-t中間載體連接，酶連體系包含1μl的pmd19-t載體，7μl的pcr純化產(chǎn)物，1μlt4連接酶，1μlt4buffer，16℃連接過夜，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中涂在含有50μg/mlamp的lb固體培養(yǎng)基上生長16h后，挑取陽性菌落進(jìn)行測序，將測序正確的菌液加入等體積體積比30％甘油于-70℃保存?zhèn)溆?，獲得含有htvhac1基因全長序列的重組質(zhì)粒，命名為htvhac1-p。2.植物表達(dá)載體ptck303-htvhac1的構(gòu)建，其步驟如下：根據(jù)htvhac1基因序列，加上bamhi和kpni酶切位點(diǎn)。以htvhac1-p質(zhì)粒為模板，利用引物設(shè)計(jì)軟件primer5.0設(shè)計(jì)引物序列：p1:5’-cgcggatccatgtcagaaactgcgatatt-3’(seqidno.4)；p2:5’-cgcggtaccctacacagtagtaggccatg-3’(seqidno.5)。htvhac1基因pcr擴(kuò)增：pcrbuffer2.5μl，dntpmix2μl，上下游引物各1μl，模板1μl,kod高保真酶0.5μl，雙蒸水17μl。pcr擴(kuò)增程序如下：菊芋htvhac1基因在94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，58℃復(fù)性延伸30s，30個(gè)循環(huán)后，72℃5min充分延伸，10℃保持。pcr擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，將htvhac1基因pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后切膠回收，將純化后片段與peasy-blunt中間載體連接，酶連體系包含1μl的peasy-blunt載體，4μl的pcr純化產(chǎn)物，25-28℃連接25min；再轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中涂在含有50μg/mlkana(卡那霉素)的lb固體培養(yǎng)基上生長16h后，挑取陽性菌落進(jìn)行測序。將測序正確的菌液加入等體積體積比30％甘油于-70℃保存?zhèn)溆?，獲得含有htvhac1基因全長序列的重組質(zhì)粒，命名為htvhac1-pea。測序正確的htvhac1-pea質(zhì)粒用bamhi和kpni雙酶切得到含特定酶切位點(diǎn)的基因片段，回收片段。同時(shí)用bamhi和kpni雙酶切表達(dá)載體ptck303(如圖10所示)(eamensal,blanchardcl,dennises,etal.abidirectionalgenetrapconstructsuitablefort‐dnaandds‐mediatedinsertionalmutagenesisinrice(oryzasatival.)[j].plantbiotechnologyjournal,2004,2(5):367-380.)，回收片段，與從中間載體上切下htvhac1的基因片斷通過t4dna連接酶定向連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂在含有50μg/ml卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基上生長16h后，挑取陽性克隆，保存陽性克隆，提取大腸桿菌質(zhì)粒送公司測序。最后通過電擊法將ptck303-htvhac1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至eha105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后涂在含有利弗平(rfp)、卡那霉素(kana)和鏈霉素(str)均為50μg/ml的yep固體培養(yǎng)基上生長72h后，挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒，回轉(zhuǎn)大腸桿菌，提取質(zhì)粒經(jīng)測序驗(yàn)證無誤后，將農(nóng)桿菌菌液加入等體積30％甘油于-70℃冰箱保存，后續(xù)試驗(yàn)備用。3.轉(zhuǎn)基因水稻的獲得，其步驟如下：將以上獲得的轉(zhuǎn)有ptck303-htvhac1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，侵染水稻愈傷組織，共培養(yǎng)(暗培)2.5天后洗菌，將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入含500mg/l羧芐青霉素(car)和50mg/l潮霉素(hyg)的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第一輪選擇培養(yǎng)，28℃光照培養(yǎng)2周，將長有抗性愈傷的愈傷轉(zhuǎn)到含500mg/l羧芐青霉素和80mg/l潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第二輪選擇培養(yǎng)，28℃光照培養(yǎng)，直到長出顆粒性的抗性愈傷組織。挑取同一愈傷來的顏色鮮黃的抗性愈傷轉(zhuǎn)入裝有分化培養(yǎng)基的塑料廣口瓶中分化培養(yǎng)，等待分化成苗(30d)，待苗長至2-3cm左右，放入生根培養(yǎng)基中壯苗。將分化好的苗從生根管挑出，加入適量無菌水，煉苗一周。洗去根部瓊脂培養(yǎng)基，移栽到水稻營養(yǎng)液中生長并進(jìn)行陽性苗鑒定，陽性苗轉(zhuǎn)入大田至收獲，得到t1代轉(zhuǎn)基因種子。本發(fā)明中實(shí)施例使用的培養(yǎng)基均為現(xiàn)有技術(shù)。4.菊芋htvhac1基因的生物信息學(xué)分析：通過blast和genomescan分析基因全長編碼區(qū)(即開放閱讀框，orf)。利用dnaman軟件對htvhac1編碼的氨基酸進(jìn)行同源性分析。htvhac1cdna全長549bp，預(yù)測編碼一條182個(gè)氨基酸組成的多肽鏈，預(yù)測蛋白分子量為20kda。tmhmm網(wǎng)站進(jìn)行跨膜蛋白預(yù)測。tmhmm預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)表明，htvhac1蛋白有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，分別位于26-48，68-90，110-132，152-174氨基酸之間如圖3所示。菊芋htvhac1基因與蒺藜苜蓿mtvhac基因同源關(guān)系最近；與擬南芥atvhac1基因和互花米草savhac1基因同源關(guān)系較近；而與玉米zmvhac基因和小麥tavhac等基因同源關(guān)系較遠(yuǎn)，如圖4所示。5.轉(zhuǎn)基因材料的分子生物學(xué)分析：我們將所獲得的htvhac1轉(zhuǎn)基因水稻材料分別篩選出4個(gè)獨(dú)立的t1代轉(zhuǎn)基因陽性株系的水稻種子于光照培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)芽4d后，gus染色鑒定轉(zhuǎn)基因水稻陽性株系，利用7l塑料周轉(zhuǎn)箱作培養(yǎng)容器，每盆20株，用海棉固定在塑料板的孔中。開始一天用自來水培養(yǎng)，一天后用1/4營養(yǎng)液(其中n：0.51mm；p：0.075mm；k：0.25mm)培養(yǎng)3d，再換1/2營養(yǎng)液(其中n：1.25mm；p：0.15mm；k：0.5mm)培養(yǎng)3d，隨后轉(zhuǎn)入全營養(yǎng)液(其中n：2.5mm；p：0.3mm；k：1mm)培養(yǎng)4周，分別采轉(zhuǎn)基因水稻葉片樣品-70℃保存待用。用trizol試劑提取組織中rna，takarakits反轉(zhuǎn)錄為cdna，使用abiprism7500real-timepcrsystem(appliedbiosystems,fostercity,ca,usa)儀分析轉(zhuǎn)基因水稻中htvhac1在材料地上部中的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因水稻株系中htvhac1基因表達(dá)上調(diào)結(jié)果如圖5所示。6.htvhac1亞細(xì)胞定位情況的分析：通過準(zhǔn)備無菌生長的水稻苗，分離其原生質(zhì)體，經(jīng)peg介導(dǎo)的dna轉(zhuǎn)化，使用zeisslsm710nlo共聚焦激光掃描顯微鏡觀察原生質(zhì)體的熒光信號(hào)(63×油鏡)。觀察gfp和yfp熒光信號(hào)所用激發(fā)光/發(fā)射光波長分別為488nm/506～538nm，觀察rfp信號(hào)的波長參數(shù)則分別為561nm/575-630nm。如圖6所示，htvhac1的gfp融合蛋白在水稻原生質(zhì)體的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，為液泡膜型。7.轉(zhuǎn)基因水稻耐鹽性及養(yǎng)分脅迫耐受性方面的差異：(1)處理方法：我們將htvhac1轉(zhuǎn)基因水稻材料分別篩選出4個(gè)獨(dú)立的t2代轉(zhuǎn)基因陽性株系的水稻種子于光照培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)芽4d后，gus染色鑒定轉(zhuǎn)基因水稻陽性株系，挑選野生型日本晴水稻，htvhac1轉(zhuǎn)基因水稻4個(gè)株系；長勢一致的苗，每個(gè)株系4個(gè)重復(fù)，利用7l塑料周轉(zhuǎn)箱作培養(yǎng)容器，每盆20株，用海棉固定在塑料板的孔中，移栽到人工氣候室進(jìn)行水培實(shí)驗(yàn)。以上為培苗方法，然后進(jìn)行處理。對轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻分別進(jìn)行了全營養(yǎng)液+100mmnacl(其中n：2.5mm；p：0.3mm；k：1mm)、全營養(yǎng)液(其中n：2.5mm；p：0.3mm；k：1mm)、1/4營養(yǎng)液(其中n：0.51mm；p：0.075mm；k：0.25mm)、1/4k營養(yǎng)液(其中n：2.5mm；p：0.3mm；k：0.25mm)、分開脅迫實(shí)驗(yàn)。每隔3天換一次營養(yǎng)液所用的營養(yǎng)液為國際水稻研究所配方，脅迫4個(gè)星期后，分地上和地下部分別采樣，統(tǒng)計(jì)鮮重。收樣并拍照，拍照結(jié)束后，將各個(gè)材料的根系用去離子水沖洗3遍，然后將根系用0.1mmcaso4漂洗1min。洗完以后將根系擦干，將植株樣品分為地上部和地下部兩部分，分別稱取兩部分的鮮重并記錄數(shù)據(jù)。105攝氏度殺青半小時(shí)，常溫(60～70攝氏度)烘干3天。稱地上、地下干重，稱取0.05g干樣到15ml離心管，加入2ml的2mhcl130rpm搖床浸提3天。加去離子水定容15ml，用濾紙過濾殘?jiān)?，吸?ml液體稀釋兩倍?；鹧娣止夤舛扔?jì)測定na、k含量。然后對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。(2)處理結(jié)果：在養(yǎng)分充足、無鹽脅迫時(shí)，htvhac1轉(zhuǎn)基因水稻材料對提高水稻生物量沒有明顯的作用(圖7)，但是在低k下或者營養(yǎng)脅迫條件下，htvhac1基因均有提高水稻生物量的趨勢，推測htvhac1能增強(qiáng)水稻的耐鹽性，htvhac1轉(zhuǎn)基因水稻還可以提高水稻的營養(yǎng)脅迫耐受性(圖8、圖9)。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>菊芋v型質(zhì)子泵c亞基基因htvhac1及其工程應(yīng)用<130>2017<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>549<212>dna<213>菊芋<400>1atgtcagaaactgcgatattggttggagcttcaagctcatgggctcgtgcgttagtcaag60atctcaccatacacgttttccgccatcggtatcgccatttccatcggagtctctgtcctc120ggtgctgcttggggaatttacattacaggaagtagcttaatcggtgctgccattaaagcc180ccacgtattacctctaaaaatctcatcagtgtaattttctgtgaggcggttgctatatat240ggagtaattgtggcaattattcttcaaacaaagctggagagtgtgccattatcacagaca300tatgctccagaatcccttagagctggatatgcaatatttgcctctggtataattgttgga360tttgcaaaccttgtttgtggattatgtgttggtataatcggaagcagttgtgcattatca420gatgcacaaaactcgtcgctttttgtaaaaattctggtaatagaaatcttcggaagtgca480cttggactgtttggagtaatcgttggcataataatgtctgctcaagcaacatggcctact540actgtgtag549<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>2atgtcagaaactgcgatatt20<210>3<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>3ctacacagtagtaggccatg20<210>4<211>29<212>dna<213>人工合成序列<400>4cgcggatccatgtcagaaactgcgatatt29<210>5<211>29<212>dna<213>人工合成序列<400>5cgcggtaccctacacagtagtaggccatg29當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12