本發(fā)明涉及一種微生物，是一種來自海洋的天目不動(dòng)桿菌，特別是一種天目不動(dòng)桿菌mcda01及其制備幾丁質(zhì)脫乙酰酶的方法。

背景技術(shù)：

幾丁質(zhì)又叫甲殼素、甲殼質(zhì)，是天然有機(jī)化合物中僅次于纖維素含量的物質(zhì)，廣泛存在于無脊椎動(dòng)物的外骨骼及表皮和真菌及藻類的細(xì)胞壁中。幾丁質(zhì)是由n-乙酰葡萄糖胺通過β-1,4糖苷鍵連接而成的直鏈大分子物質(zhì)，不溶解于水和有機(jī)溶劑，不容易被廣泛的開發(fā)利用。如幾丁質(zhì)脫乙酰度超過55％便可得到殼聚糖，隨之其溶解性增加，并具有抗癌、降低膽固醇、降血壓等生物活性，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、化妝品等行業(yè)，有很高的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景。

目前，幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為殼聚糖的處理方法有化學(xué)熱堿法和生物酶法兩種，其中，化學(xué)熱堿法存在反應(yīng)時(shí)間長、用堿量大、成本高的缺陷，存在污染環(huán)境的危害，并且由于化學(xué)熱堿發(fā)處理其脫乙酰度不易控制而導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。此外，生物酶法主要采用幾丁質(zhì)脫乙酰酶來酶解幾丁質(zhì)獲取殼聚糖，但目前微生物制備幾丁質(zhì)脫乙酰酶存在產(chǎn)酶活力低、脫乙酰效果差等問題，急需擴(kuò)大對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶生微生物資源的篩選，滿足殼聚糖生物酶法工業(yè)化生產(chǎn)需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了針對(duì)上述的化學(xué)熱堿法存在的如不環(huán)保、產(chǎn)品穩(wěn)定性差、不易控制和生物酶解法存在的酶活性低、脫乙酰效果差、成本高等缺陷，本發(fā)明提供了一種綠色環(huán)保，提高脫乙酰度的幾丁質(zhì)脫乙酰酶的方法，具體方案如下：

一種天目不動(dòng)桿菌mcda01，該菌株為天目不動(dòng)桿菌(acinetobacterschindleri)mcda01，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmccno.13538。

進(jìn)一步的，所述mcda01為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢，菌落白色、不透明，表面光滑濕潤，稍有突起，菌落邊緣有小鋸齒狀。

一種天目不動(dòng)桿菌mcda01制備幾丁質(zhì)脫乙酰酶的方法，其特征在于，所述天目不動(dòng)桿菌mcda01制備幾丁質(zhì)脫乙酰酶的方法具體包括如下步驟：

(1)配制2216e液體培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基，

(2)將菌株mcda01接種至2216e液體培養(yǎng)基中斜面種子培養(yǎng)，并用篩選培養(yǎng)基篩選目標(biāo)菌種，

(3)將上述步驟(2)中獲取的斜面種子接種至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后將其以1000r/min離心10min，取上清液即為種子液，

(4)將上述步驟(3)中獲取的種子液以1％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，制備幾丁質(zhì)脫乙酰酶，

(5)每間隔2h取上述步驟(4)中樣品進(jìn)行測定幾丁質(zhì)脫乙酰酶活力，其中設(shè)置沸水浴滅活15min的酶液對(duì)照組。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)中2216e液體培養(yǎng)基組成成分為：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，fepo40.01％，瓊脂2％，陳海水配置；種子培養(yǎng)基組成成分為：酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％，nacl1％，陳海水配置；發(fā)酵培養(yǎng)基組成組分為：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.2％，nh4so40.3％，kh2po40.15％，mgso40.05％，粉末幾丁質(zhì)1％，陳海水配制。

進(jìn)一步的，所述步驟(2)中2216e液體培養(yǎng)基ph值為7.0，斜面培養(yǎng)48h，獲得的斜面種子能夠使篩選培養(yǎng)基產(chǎn)生黃色圈。

進(jìn)一步的，所述步驟(3)中種子液搖瓶培養(yǎng)條件為裝液量20％，轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度5℃-45℃，ph值為3.0-11.0，nacl濃度為0％-10％，時(shí)間為0-24h。

進(jìn)一步的，所述步驟(4)中發(fā)酵培養(yǎng)條件為裝液量20％，發(fā)酵時(shí)間2h-96h，溫度10℃-30℃，發(fā)酵起始ph值為4.0-10.0，誘導(dǎo)劑1％-5％。

進(jìn)一步的，所述步驟(2)中篩選培養(yǎng)基為ph值為7.0的組分為膠體幾丁質(zhì)0.2％，k2hpo40.07％，kh2po40.03％，mgso40.05％，對(duì)硝基-n-乙酰苯胺0.02％，陳海水配置。

進(jìn)一步的，所述步驟(5)中酶活力的鑒定，試管中加入30℃預(yù)保溫的0.05mol/l、ph值為7.0磷酸緩沖液3ml，200mg/l的對(duì)硝基乙酰苯胺水溶液1ml，酶液1ml，于30℃水浴反應(yīng)15min，沸水浴終止酶促反應(yīng)，3000r/min離心10min，測定上清液的吸光度。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明涉及的菌株是在中國黃海海州灣海域的海泥中分離到的天目不動(dòng)桿菌mcda01，來源廣泛，在含有膠體幾丁質(zhì)和對(duì)硝基-n-乙酰苯胺的篩選培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生黃色圈，不發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣，在nacl濃度為0％-10％生長，屬于耐鹽海洋微生物，利用其進(jìn)行發(fā)酵制備幾丁質(zhì)脫乙酰酶，其在在低溫時(shí)具有高活性，常溫下催化活性更高，mcda01發(fā)酵制備的幾丁質(zhì)脫乙酰酶，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，滿足市場對(duì)的殼聚糖的需求，不僅脫乙酰度高，無污染物質(zhì)排放，達(dá)到綠色生產(chǎn)的目的，而且保護(hù)了環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說明

圖1為菌株mcda01革蘭氏染色體(×1000)；

圖2為菌株mcda01在初篩平板形成的變色圈圖；

圖3為溫度對(duì)菌株mcda01生長的影響圖；

其中，●5℃，○15℃，▼25℃，■30℃，▲45℃；

圖4為ph對(duì)菌株mcda01生長的影響圖；

圖5為nacl濃度對(duì)菌株mcda01生長的影響圖；

圖6為發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株mcda01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖；

圖7為溫度對(duì)菌株mcda01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖；

圖8為培養(yǎng)基初始ph對(duì)菌株mcda01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖；

圖9為裝樣量對(duì)菌株mcda01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖；

圖10為粉末幾丁質(zhì)添加量對(duì)菌株mcda01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響；

圖11為溫度對(duì)菌株mcda01幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性的影響；

圖12為溫度對(duì)菌株mcda01幾丁質(zhì)脫乙酰酶穩(wěn)定性的影響；

其中，●4℃，○15℃，▲25℃，▼30℃；

圖13為ph對(duì)菌株mcda01幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性的影響，

其中，▲ph5.0-ph8.0，●ph8.0-ph9.0，○ph9.0-ph12.0；

圖14為ph對(duì)菌株mcda01幾丁質(zhì)脫乙酰酶穩(wěn)定性的影響，

其中，▲ph5.0-ph8.0，●ph8.0-ph9.0，○ph9.0-ph12.0。

生物材料樣品保藏：

天目不動(dòng)桿菌mcda01(acinetobacterschindleri)已經(jīng)于2017年1月6號(hào)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter(cgmcc))，保藏編號(hào)為cgmccno.13538，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

具體實(shí)施方式

為進(jìn)一步揭示本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式：

其中，本發(fā)明中所用的培養(yǎng)基為：2216e液體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，fepo40.01％，瓊脂2％，陳海水配置，ph7.0；篩選培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)0.2％，k2hpo40.07％，kh2po40.03％，mgso40.05％，對(duì)硝基-n-乙酰苯胺0.02％，陳海水配置，ph7.0；種子培養(yǎng)基：酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％，nacl1％，陳海水配置，ph7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.5％，葡萄糖0.2％，nh4so40.3％，kh2po40.15％，mgso40.05％，粉末幾丁質(zhì)1％，陳海水配制，ph8.0。

實(shí)施例1：

(一)mcda01的特性

形態(tài)上，該菌株為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢，如圖1所示。在lb固體培養(yǎng)上培養(yǎng)48h后，菌落呈白色不透明狀，其表面光滑濕潤，稍有突起，該菌落邊緣有小鋸齒狀、不易挑取。在含有膠體幾丁質(zhì)和對(duì)硝基-n-乙酰苯胺的篩選培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生黃色圈，參見圖2。所述mcda01具有生理生化特性，如表1所示：

表1mcda01菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

注：+：陽性；-：陰性；

(二)mcda01的培養(yǎng)：

將菌株mcda01的2216e斜面種子接種到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，其中控制溫度30℃，轉(zhuǎn)速180r/min，裝液量20％，培養(yǎng)24h。

為了進(jìn)一步的探究溫度對(duì)菌株mcda01生長的影響，將種子液以1％的接種量接于2216e液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速180r/min、裝液量為20％條件下，分別在不同溫度下培養(yǎng)24h，然后測定其od600的值。由圖3可知，該菌株在低于5℃和高于45℃生長速度顯著降低，最適生長溫度為30℃。

為了進(jìn)一步探究ph值對(duì)菌株生長的影響，在ph3.0-ph11.0范圍、溫度控制在30℃，其余條件上，對(duì)mcda01進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌在ph6.0-ph9.0范圍內(nèi)生長良好，最適生長ph為8.0，參見圖4。

為了進(jìn)一步探究nacl濃度對(duì)菌株生長的影響，本發(fā)明用蒸餾水配置2216e培養(yǎng)基，控制nacl范圍為0％-10％，然后接種該菌在最適溫度和ph條件下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌在0％-10％的nacl濃度范圍內(nèi)可以生長，最適生長的nacl濃度為4.0％，無nacl有一定生長，屬于耐鹽海洋微生物，參見圖5。

(三)發(fā)酵mcda01制備幾丁質(zhì)脫乙酰酶：

將種子液以1％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，其中溫度30℃、裝液量20％、搖瓶轉(zhuǎn)速為180r/min進(jìn)行發(fā)酵96h，每隔2h取樣測酶活力，結(jié)果表明72h產(chǎn)酶最高，參見圖6。

為了進(jìn)一步探究發(fā)酵溫度對(duì)菌株mcda01產(chǎn)酶的影響，本發(fā)明將種子液以1％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，其中裝液量為20％、搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為180r/min，在不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng)72h，結(jié)果顯示25℃時(shí)酶產(chǎn)量達(dá)到最高，15℃時(shí)有較高的產(chǎn)酶量，達(dá)到最高產(chǎn)酶的80％，參見圖7。

為了進(jìn)一步探究培養(yǎng)基起始ph對(duì)菌株mcda01產(chǎn)酶的影響，本發(fā)明將種子液以1％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵條件為溫度25℃、裝液量20％、搖瓶發(fā)酵轉(zhuǎn)速為180r/min，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基不同初始ph，培養(yǎng)72h后測定酶活力，結(jié)果表明，隨著初始ph的升高酶產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)ph達(dá)到8.0時(shí)產(chǎn)酶量達(dá)到最大，低于ph5.0或高于ph10.0時(shí)酶產(chǎn)量顯著降低，參見圖8。

為了進(jìn)一步探究裝液量對(duì)菌株mcda01產(chǎn)酶的影響，本發(fā)明將種子液以1％接種量接種至不同裝液量發(fā)酵培養(yǎng)基，其中發(fā)酵條件為溫度25℃、轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)72h后測定酶活力，結(jié)果顯示250ml三角瓶中裝液量在20％時(shí)產(chǎn)酶最高，參見圖9。

為了進(jìn)一步確定誘導(dǎo)劑對(duì)菌株mcda01產(chǎn)酶的影響，本發(fā)明將種子液以1％接種量接種至不同幾丁質(zhì)含量的發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵條件為溫度25℃、裝液量20％、轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)72h后測定酶活力，幾丁質(zhì)添加量為1％-5％時(shí)產(chǎn)酶量達(dá)到最大值，低于1％或高于5％時(shí)，產(chǎn)酶顯著降低，考慮到經(jīng)濟(jì)原因，選擇1％，參見圖10。

(四)幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性測定方法：

試管中加入30℃預(yù)保溫的0.05mol/lph7.0磷酸緩沖液3ml，200mg/l的對(duì)硝基乙酰苯胺水溶液1ml，酶液1ml，于30℃水浴反應(yīng)15min，沸水浴終止酶促反應(yīng)，3000r/min離心10min，測定上清液的吸光度。以添加1ml同樣濃度沸水浴滅活15min的酶液為對(duì)照。其中，酶活單位(u)定義：在上述反應(yīng)條件下每小時(shí)產(chǎn)生1μg對(duì)硝基苯胺所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

首先，溫度對(duì)菌株mcda01幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性和穩(wěn)定性的影響：在ph7.0，0.05mmol/l磷酸緩沖液中于不同溫度下測定純化幾丁質(zhì)脫乙酰酶活力，確定酶的最適合作用溫度，結(jié)果見圖11，酶的最適合作用溫度是30℃，在15℃和45℃仍保持50％以上相對(duì)酶活。

將幾丁質(zhì)脫乙酰酶在ph7.0，0.05mol/l磷酸緩沖液中分別于不同溫度下分別保溫0h-2.5h，然后測定殘余酶活力，確定酶溫度穩(wěn)定性，結(jié)果見圖12，酶在4℃時(shí)最穩(wěn)定，25℃的半衰期為1.5h。

其次，ph對(duì)菌株mcda01幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性和穩(wěn)定性的影響：配制不同ph的0.05mol/l緩沖液，磷酸緩沖液(ph5.0-ph8.0)，tris-hcl緩沖液(ph8.0-ph9.0)，gly-naoh緩沖液(ph9.0-ph12.0)。在30℃于不同ph的緩沖液下以對(duì)硝基乙酰苯胺為底物測定酶的活力，結(jié)果見圖13，酶的最適ph為8.0，在ph7.0-ph10.0具有80％以上酶活性。

將酶在不同ph的緩沖液中分別于30℃保溫1h，然后在30℃于ph7.0磷酸緩沖液中測定殘余酶活力。結(jié)果見圖14，酶在在ph7.0-ph10.0具有80％以上響度酶活，在ph10.0保持40％以上酶活性，在酸性條件下，酶活性顯著降低。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。