本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域中的獸醫(yī)動(dòng)物病原檢測(cè)，特別是涉及一種能夠特異性鑒別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(i型和ii型)的普通pcr檢測(cè)試劑盒及其專用引物。

背景技術(shù)：

瘟病毒屬

瘟病毒屬包括粘膜病病毒群的病毒以及豬瘟病毒和羊邊界病病毒。病毒粒子呈圓形，有脂蛋白的囊膜，在細(xì)胞漿內(nèi)增殖和發(fā)育成熟，是最小的有囊膜的rna病毒(直徑約40nm)，內(nèi)含非螺旋狀的、有可能是二十面體對(duì)稱的核衣殼?；蚪M為單分子的單股rna，本身就可作為信息rna(mrna)。瘟病毒不能在無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)增殖。血清學(xué)上與本屬內(nèi)的病毒呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，但與黃病毒科其它屬的病毒成員沒有交叉關(guān)系。

豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(i型和ii型)

豬瘟(classicalswinefever,csf)又稱豬霍亂(hogcholera，hc),是由豬瘟病毒(classicalswinefevervirus，csfv)引起的一種高度接觸性傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)將其列為必須通報(bào)的動(dòng)物傳染病。豬瘟的臨床癥狀由急性、亞急性逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁詼睾托?，臨床癥狀不典型，在豬瘟高發(fā)地區(qū)，主要采用常規(guī)的免疫接種進(jìn)行豬瘟的預(yù)防。疫苗的品質(zhì)則直接決定豬群抵抗豬瘟病毒的能力，現(xiàn)常用的豬瘟疫苗有傳代細(xì)胞源、兔源等不同廠家的豬瘟疫苗，因豬瘟疫苗生產(chǎn)離不開細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)最重要的原材料之一為血清，血清主要來(lái)源于牛血清。隨著牛群的進(jìn)口引進(jìn)，目前，牛病毒性腹瀉-粘膜病(bvd-md)分布于世界各地，從20世紀(jì)八、九十年代以來(lái)，在北美州，美國(guó)、加拿大bvd-md的感染率達(dá)到50％-85％；在歐洲、法國(guó)、德國(guó)，經(jīng)血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示bvd-md的感染率為76％，瑞典的發(fā)病率在10％-80％之間，芬蘭肉牛的感染率不小于50％，希臘陽(yáng)性率為1.3％-14％，立陶宛陽(yáng)性率為70％-100％，瑞士和波蘭的平均陽(yáng)性率分別為12.5％和86％；在南美洲，巴西、委內(nèi)瑞拉、秘魯、新西蘭及澳大利亞bvd-md的陽(yáng)性率分別為15.1％-56％、36％-37％、50％-96％和89％。因牛病毒性腹瀉-粘膜病(bvd-md)病毒(bvdv)的廣泛存在，生產(chǎn)豬瘟疫苗等疫苗類產(chǎn)品時(shí)為避免原材料血清被bvdv污染，需要建立一種快速、簡(jiǎn)單的對(duì)牛血清中的bvdv進(jìn)行檢測(cè)的方法。

csfv和bvdv的檢測(cè)

由于csfv和bvdv是同一個(gè)屬的成員，同源性高，具有很強(qiáng)的血清學(xué)交叉反應(yīng)，生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞苗常利用牛睪丸細(xì)胞和胎牛血清來(lái)擴(kuò)大培養(yǎng)豬瘟病毒，若牛睪丸細(xì)胞或胎牛血清被bvdv污染，會(huì)直接導(dǎo)致豬瘟細(xì)胞苗污染bvdv病毒，導(dǎo)致csfv疫苗不純凈，并且，用含有bvdv抗體的血清進(jìn)行cfsv病毒的體外培養(yǎng)對(duì)cfsv病毒具有抑制作用，因此為保證豬瘟細(xì)胞源疫苗的安全性及有效性，bvdv病毒和csfv病毒的鑒別尤為重要。常規(guī)的鑒別是對(duì)bvdv病毒和csfv病毒分別檢測(cè)，常用的csfv和bvdv檢測(cè)方法有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、動(dòng)物接種試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)、常規(guī)pcr試驗(yàn)和rt-pcr試驗(yàn)等，因瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、動(dòng)物接種試驗(yàn)和病毒中和試驗(yàn)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，并且成本較高，現(xiàn)常用的檢測(cè)方法為pcr技術(shù)，由于實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)的儀器昂貴、成本高，因此普通pcr檢測(cè)技術(shù)為首選的csfv和bvdv的檢測(cè)技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供用于對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)進(jìn)行普通pcr檢測(cè)的引物，并實(shí)現(xiàn)牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)與豬瘟病毒(csfv)的鑒別。

本發(fā)明所提供的用于對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進(jìn)行普通pcr檢測(cè)的引物為：上游引物(pu-bvdv-f)的核苷酸序列如序列表中sedidno：1所示，下游引物(pu-bvdv-r)的核苷酸序列如序列表中seqidno：2所示。

由上述引物衍生的引物序列也屬于本發(fā)明內(nèi)容。所述衍生序列是指在seqidno：1和/或seqidno：2的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)一至十個(gè)堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用于對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)進(jìn)行普通pcr檢測(cè)的試劑盒。

本發(fā)明所提供的普通pcr檢測(cè)試劑盒，包括上述用于對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進(jìn)行普通pcr檢測(cè)的引物。

具體來(lái)講，所述試劑盒還包括以下用于25μl普通pcr反應(yīng)體系的試劑：一步法pcr反應(yīng)液2×onesteprt-pcrbufferiii12.5μl(購(gòu)于takara公司)，takaraextaqhs0.5μl(購(gòu)于takara公司)，primescriptrtenzymemixii0.5μl(購(gòu)于takara公司)，pu-bvdv-f(20μm)0.5μl，pu-bvdv-r(20μm)0.5μl，rna-freeh2o8.5μl，核酸模板2μl。該體系中引物稀釋至20μm，反應(yīng)體系中最終加量為0.4μmol/l。

為方便檢測(cè)，所述試劑盒中還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒i型和ii型基因組rna，所述陰性對(duì)照為不含i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的反應(yīng)體系，如h2o(雙蒸水、無(wú)菌去離子水等)。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述引物或試劑盒在對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)進(jìn)行非疾病診斷目的的檢測(cè)、或在對(duì)牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)與豬瘟病毒(csfv)進(jìn)行非疾病診斷目的的鑒別的應(yīng)用。

該應(yīng)用之一為一種用上述普通pcr檢測(cè)試劑盒及普通pcr技術(shù)對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)進(jìn)行非疾病診斷目的的定性檢測(cè)的方法，該普通pcr檢測(cè)方法包括以下步驟：

1)提取待測(cè)樣品的基因組rna，以提取的基因組rna為模板，在上述引物引導(dǎo)下進(jìn)行普通pcr擴(kuò)增檢測(cè)；

2)用得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，實(shí)現(xiàn)對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的定性檢測(cè)，出現(xiàn)預(yù)期目的條帶“233bp”表明待測(cè)樣品中含有i型和/或ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)，若無(wú)預(yù)期目的條帶則表明待測(cè)樣品中無(wú)i型和/或ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)。

應(yīng)用之二為一種非疾病診斷目的的鑒別i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)與豬瘟病毒(csfv)的方法，在上述步驟后還包括：

3)結(jié)果判定：

本發(fā)明的普通pcr檢測(cè)方法只對(duì)bvdv樣品有擴(kuò)增條帶而對(duì)csfv樣品無(wú)擴(kuò)增條帶，本發(fā)明充分利用兩者基因序列的差異，在pu-bvdv-f序列上篩選出較好的8個(gè)位點(diǎn)(自5’端148、152、155、156、160、164、166、170位點(diǎn))，在pu-bvdv-r序列上篩選出較好的1個(gè)位點(diǎn)(自5’端355位點(diǎn))，用pu-bvdv-f和pu-bvdv-r可同時(shí)擴(kuò)增i型和ii型bvdv，pcr擴(kuò)增若出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增條帶“233bp”可以確認(rèn)其為i型和/或ii型bvdv病毒，因與csfv序列具有8個(gè)堿基的差異無(wú)法擴(kuò)增csfv序列(未出現(xiàn)預(yù)期條帶)，從而實(shí)現(xiàn)鑒別i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)與豬瘟病毒(csfv)的目的。

具體判定方法：pcr擴(kuò)增若出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增條帶“233bp”，則確認(rèn)為bvdv陽(yáng)性(樣品中含有i型和/或ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒)，無(wú)預(yù)期擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，則確認(rèn)為bvdv陰性(樣品中不含有i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒)。

在上述方法中，所述步驟1)中的待測(cè)樣品可以為采自犢牛用于疫苗生產(chǎn)的血清，也可以為犢牛睪丸分離的原代細(xì)胞，對(duì)其檢測(cè)用于非診斷目的。通過(guò)對(duì)此類待測(cè)樣品中bvdv病毒的定性檢測(cè)以實(shí)現(xiàn)對(duì)基于犢牛的產(chǎn)品及原料的監(jiān)控，并為后續(xù)原料處置提供客觀數(shù)據(jù)。

所述步驟1)和步驟2)中的25μl普通pcr反應(yīng)體系可包括：模板2μl，一步法pcr反應(yīng)液2×onesteprt-pcrbufferiii12.5μl(購(gòu)于takara公司)，takaraextaqhs0.5μl(購(gòu)于takara公司)，primescriptrtenzymemixii0.5μl(購(gòu)于takara公司)，pu-bvdv-f(20μm)0.5μl，pu-bvdv-r(20μm)0.5μl，rna-freeh2o8.5μl。引物稀釋為20μm，反應(yīng)體系中最終加量為0.4μmol/l。

所述步驟1)和步驟2)中的普通pcr反應(yīng)條件可為：先52℃15min，95℃5s；然后94℃5s，56℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；最后終延伸72℃7min。

本發(fā)明提供了一種可特異性鑒別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(i型和ii型)的普通pcr檢測(cè)試劑盒及其專用引物。本發(fā)明能對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒實(shí)施快速檢測(cè)，可為豬瘟病毒疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)控提供有力依據(jù)，確保疫苗接種的安全性和純凈性，對(duì)豬瘟病毒疫苗的生產(chǎn)具有指導(dǎo)作用；還可以對(duì)犢牛來(lái)源原材料的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，并為后續(xù)處置提供客觀數(shù)據(jù)，以保證犢牛血清、細(xì)胞及其制品的安全性。本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，不僅可用于i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的檢測(cè)，更可以實(shí)現(xiàn)牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)和豬瘟病毒(csfv)的鑒別，將在i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的檢測(cè)(包括臨床診斷中臨床病料或培養(yǎng)物中i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的準(zhǔn)確檢測(cè))及疫苗生產(chǎn)和犢牛制品生產(chǎn)(非診斷目的的應(yīng)用)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明用普通pcr技術(shù)對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)進(jìn)行定性檢測(cè)的技術(shù)路線

圖2為16份臨床疑似血清病料i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的檢測(cè)結(jié)果

圖3為i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr檢測(cè)方法的特異性檢測(cè)結(jié)果

圖4為i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr檢測(cè)方法的靈敏度檢測(cè)結(jié)果

圖5為i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr檢測(cè)方法的重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

圖6為10份csfv疫苗半成品中外源病毒i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的檢測(cè)結(jié)果

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見：《molecularcloning:alaboratorymanual》(sambrook，j.，russell，davidw.，molecularcloning:alaboratorymanual，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)。

所述百分比濃度如無(wú)特別說(shuō)明均為質(zhì)量/質(zhì)量(w/w，單位g/100g)百分比濃度、質(zhì)量/體積(w/v，單位g/100ml)百分比濃度或體積/體積(v/v，單位ml/100ml)百分比濃度。

實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá)到具體公開的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來(lái)源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的來(lái)源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提示替換使用。

所用引物由北京華大基因有限公司合成。

實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

生物基因組是直接反應(yīng)生物基本信息的一個(gè)最客觀的指標(biāo)，不同的病毒所含有的基因組信息不同，通過(guò)基因組信息可將不同的病毒分類至不同的族群，利用基因組堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，可實(shí)現(xiàn)特異位點(diǎn)基因序列的大量擴(kuò)增，從而通過(guò)一定的方法使得肉眼可見。

如圖1所示，本發(fā)明基于以上基本原理設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理，建立了一種特異性檢測(cè)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr檢測(cè)方法。

實(shí)施例1、設(shè)計(jì)用普通pcr技術(shù)檢測(cè)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的引物

檢測(cè)序列的選?。号２《拘愿篂a-粘膜病病毒(bvdv)的常規(guī)pcr檢測(cè)，有文獻(xiàn)介紹其檢測(cè)序列為5’utr，然而，由于csfv和bvdv的5’utr基因區(qū)域的高相似性原因，導(dǎo)致已有文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)序列存在無(wú)法鑒別csfv和bvdv的問(wèn)題。本發(fā)明首先從檢測(cè)序列上進(jìn)行突破，從ncbi的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)對(duì)bvdv不同毒株基因進(jìn)行大量檢索，獲得i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的5’utr區(qū)域基因(bvdvi型genbank號(hào)：kc963967，序列表中sedidno：3；bvdvii型genbank號(hào)：kc176779.1，序列表中sedidno：4)的序列，用dnaman軟件進(jìn)行比對(duì)后，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，通過(guò)分析研究，篩選、比較、確定在bvdv不同毒株之間相對(duì)保守的一段基因作為檢測(cè)序列。最終，選取i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的5’utr區(qū)域基因的特異性保守序列(自5’端第147-379位堿基，序列表中sedidno：5)作為檢測(cè)序列。

引物設(shè)計(jì)：基于確定的檢測(cè)序列，用primerexpress6.0軟件設(shè)計(jì)對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進(jìn)行普通pcr檢測(cè)的引物，獲得4組引物，經(jīng)分析、比較、實(shí)驗(yàn)，最終確定的引物序列如下：

pu-bvdv-f(上游引物)：5’-gtgagttcg/a/tttggatggcc/tgaag/tc-3’(序列表中sedidno：1)

pu-bvdv-r(下游引物)：5’-gtgccatgtacagcagagattttta-3’(序列表中sedidno：2)。

以上檢測(cè)引物確定過(guò)程中，本發(fā)明還充分考慮了利用該引物檢測(cè)中對(duì)bvdv和csfv的鑒別，因此，還充分考慮了兩者基因序列的差異，在pu-bvdv-f序列上篩選出較好的8個(gè)位點(diǎn)(自5’端148、152、155、156、160、164、166、170位點(diǎn))，在pu-bvdv-r序列上篩選出較好的1個(gè)位點(diǎn)(自5’端355位點(diǎn))，用pu-bvdv-f和pu-bvdv-r可同時(shí)擴(kuò)增i型和ii型bvdv，pcr擴(kuò)增若出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增條帶“233bp”可以確認(rèn)其為i型和/或ii型bvdv病毒，因與csfv序列具有8個(gè)堿基的差異無(wú)法擴(kuò)增csfv序列(未出現(xiàn)預(yù)期條帶)，從而實(shí)現(xiàn)鑒別i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)與豬瘟病毒(csfv)的目的。

實(shí)施例2、用本發(fā)明的引物對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)進(jìn)行普通pcr檢測(cè)

一、提取待測(cè)樣品的基因組rna

分別對(duì)滅活的i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物(陽(yáng)性對(duì)照)以及待測(cè)樣品提取基因組rna，具體方法包括以下步驟(axyprep^tmbodyfluidviraldna/rnaminiprepkit，axygen公司)：

(1)axygen試劑盒準(zhǔn)備：按試劑盒說(shuō)明書，預(yù)先配制含1％冰乙酸的異丙醇和在試劑bufferw1a和bufferw2中添加指定濃度的無(wú)水乙醇。

(2)在1.5ml離心管中加入200ul的待檢樣品，并加入200μlbufferv-l，漩渦振蕩混勻后，靜置5min.

(3)在步驟(2)的1.5ml樣品及試劑混合離心管中加75μlbufferv-n，漩渦振蕩混勻，12000g離心5min。

(4)將上清轉(zhuǎn)移至2ml離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，加300μl異丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均勻。

(5)將制備管置于2ml離心管中(試劑盒內(nèi)提供)中，取步驟(4)的混合液移入制備管中，6000g離心1min。

(6)棄濾液，將制備管置回至2ml離心管中，加500μlbufferw1a，室溫靜置1min。12000g離心1min。

(7)棄濾液，將制備管置回至2ml離心管中，加800μlbufferw2，12000g離心1min。

(8)將制備管置回到2ml離心管中，12000g離心1min。

(9)將制備管置于潔凈的1.5ml離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，在制備管膜中央加40ul無(wú)酶水，室溫靜置1min，12000g離心1min洗脫rna。

二、待測(cè)樣品中i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr檢測(cè)

1、待測(cè)樣品和陰性和陽(yáng)性對(duì)照pcr擴(kuò)增

對(duì)步驟一提取的來(lái)自i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的基因組rna、陰性對(duì)照和待測(cè)樣品rna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，25μl反應(yīng)體系如下：

表1i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒5’utr區(qū)域基因的pcr擴(kuò)增體系

反應(yīng)體系中引物最終加量為0.4μmol/l。

pcr反應(yīng)循環(huán)條件如下：

表2i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒5’utr區(qū)域基因的pcr循環(huán)條件

2、待測(cè)樣品和陰性和陽(yáng)性對(duì)照pcr產(chǎn)物電泳檢測(cè)

將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓為110v，電泳40min。

3、對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)血清樣品的普通pcr檢測(cè)

本實(shí)施例用本發(fā)明建立的牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒i型和ii型的普通pcr檢測(cè)方法對(duì)所收集的16份臨床疑似血清病料(待測(cè)樣品)提取的rna進(jìn)行檢測(cè)，以滅活的i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒細(xì)胞培養(yǎng)物提取的rna為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)酶水為陰性對(duì)照，根據(jù)普通pcr檢測(cè)結(jié)果，以是否出現(xiàn)“233bp”擴(kuò)增條帶為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)臨床樣本是否感染i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進(jìn)行判定(出現(xiàn)判定為陽(yáng)性，未出現(xiàn)判定為陰性)。

結(jié)果如圖2(m1：2000bpmarker；m2：100bpdnaladder；1：0627-1(結(jié)果：陰性)；2：0627-2(結(jié)果：陽(yáng)性)；3：0627-3(結(jié)果：陽(yáng)性)；4：0627-4(結(jié)果：陽(yáng)性)；5：0627-5(結(jié)果：陽(yáng)性)；6：0627-6(結(jié)果：陰性)；7：0627-7(結(jié)果：陰性)；8：0627-8(結(jié)果：陰性)；9：0627-9(結(jié)果：陰性)；10：0627-10(結(jié)果：陰性)；11：0627-11(結(jié)果：陰性)；12：0627-12(結(jié)果：陰性)；13：0627-13(結(jié)果：陰性)；14：0627-14(結(jié)果：陰性)；15：0627-15(結(jié)果：陰性)；16：0627-16(結(jié)果：陽(yáng)性)；ntc：空白對(duì)照(結(jié)果：成立)；—：陰性對(duì)照(結(jié)果：成立)；+：陽(yáng)性對(duì)照(結(jié)果：成立))所示，所檢測(cè)的16份疑似血清中有5份血清判定為陽(yáng)性(說(shuō)明感染了i型和/或ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒)，11份血清判定為陰性(說(shuō)明未感染i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒)。

實(shí)施例3、本發(fā)明檢測(cè)方法的特異性實(shí)驗(yàn)

按照實(shí)施例2所述方法用dna/rna同時(shí)提取的axygen試劑盒(購(gòu)自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司)對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)、牛鼻氣管炎病毒(ibrv)、豬瘟病毒(csfv)和口蹄疫病毒(fmdv)提取rna，對(duì)偽狂犬病毒(prv)、羊口瘡病毒(orfv)、羊痘病毒和布魯氏菌病細(xì)菌提取dna，同時(shí)以滅活的i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒細(xì)胞培養(yǎng)物提取的rna為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)酶水為陰性對(duì)照，在本發(fā)明引物的引導(dǎo)下進(jìn)行普通pcr檢測(cè)，pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照實(shí)施例2，以驗(yàn)證該方法的特異性。

檢測(cè)結(jié)果如圖3(m：2000bpmarker；1：ibrv病毒；2：csfv病毒；3：bvdv病毒；4：fmdv病毒；5：羊口瘡病毒；6：羊痘病毒；7：布病細(xì)菌；8：偽狂犬病毒；9：ntc(空白對(duì)照))所示，僅有bvdv出現(xiàn)預(yù)期的擴(kuò)增條帶“233bp”，結(jié)果陽(yáng)性，其它樣品未出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增條帶，結(jié)果陰性。檢測(cè)結(jié)果表明用本發(fā)明的方法可特異性地檢測(cè)出i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒。

實(shí)施例4、本發(fā)明檢測(cè)方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)

按照實(shí)施例2所述，將攜帶牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的陽(yáng)性核酸樣品，采用nanodrop儀器測(cè)定濃度后，按照10倍梯度依次進(jìn)行稀釋，分別稀釋至濃度為1.5ng/μl、0.15ng/μl、0.015ng/μl、1.5pg/μl、0.15pg/μl、0.015pg/μl、1.5fg/μl、0.15fg/μl、0.015fg/μl、0.0015fg/μl，以不同濃度的核酸樣品作為模板，在本發(fā)明引物的引導(dǎo)下進(jìn)行普通pcr檢測(cè)，pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照實(shí)施例2，以驗(yàn)證該方法的靈敏度。

檢測(cè)結(jié)果如圖4(m：2000bpmarker；1：1.5ng/μl；2：0.15ng/μl；3：0.015ng/μl；4：1.5pg/μl；5：0.15pg/μl；6：0.015pg/μl；7：1.5fg/μl；8：0.15fg/μl；9：0.015fg/μl；10：0.0015fg/μl；11：陰性對(duì)照；12：ntc(空白對(duì)照))所示，顯示本發(fā)明i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的普通pcr檢測(cè)方法的檢測(cè)敏感度為1.5pg/μl。

實(shí)施例5、本發(fā)明檢測(cè)方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照實(shí)施例2所述，將10倍梯度稀釋的1.5ng/μl、0.15ng/μl、0.015ng/μl、1.5pg/μl共4個(gè)梯度的核酸樣品，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，在本發(fā)明引物的指導(dǎo)下進(jìn)行普通pcr檢測(cè)，pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照實(shí)施例2，以驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。

檢測(cè)結(jié)果如圖5(m：2000bpmarker；1、5、9：1.5ng/μl；2、6、10：0.15ng/μl；3、7、11：0.015ng/μl；4、8、12：1.5pg/μl)所示，從圖中可見每一個(gè)濃度梯度的3個(gè)重復(fù)樣，檢測(cè)結(jié)果一致，表明本發(fā)明i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的普通pcr檢測(cè)方法的重復(fù)性較好。

實(shí)施例6、檢測(cè)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr檢測(cè)試劑盒

基于實(shí)施例1和2，本發(fā)明所提供的普通pcr檢測(cè)試劑盒，包括用于對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進(jìn)行普通pcr檢測(cè)的引物(pu-bvdv-f和pu-bvdv-r)。使用中引物稀釋為20μm，反應(yīng)體系中引物最終加量為0.4μmol/l。

具體來(lái)講，該試劑盒包括以下用于25μl普通pcr反應(yīng)體系的試劑：一步法pcr反應(yīng)液2×onesteprt-pcrbufferiii12.5μl(購(gòu)于takara公司)，takaraextaqhs0.5μl(購(gòu)于takara公司)，primescriptrtenzymemixii0.5μl(購(gòu)于takara公司)，pu-bvdv-f(20μm)0.5μl，pu-bvdv-r(20μm)0.5μl，rna-freeh2o8.5μl和模板2μl。

為方便檢測(cè)，試劑盒中還可包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒i型和ii型基因組rna，所述陰性對(duì)照為不含牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒i型和ii型的反應(yīng)體系，如h2o(雙蒸水、無(wú)菌去離子水等)。

試劑盒中各試劑的使用可參考實(shí)施例2的內(nèi)容。

實(shí)施例7、csfv疫苗生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病外源病毒的普通pcr檢測(cè)

本實(shí)施例對(duì)csfv疫苗生產(chǎn)(csfv疫苗生產(chǎn)方法可參考文獻(xiàn)《豬瘟活疫苗生產(chǎn)工藝改進(jìn)現(xiàn)狀》，廣東畜牧獸醫(yī)科技，2012-08-18，謝文強(qiáng)，金宇保靈生物藥品有限公司)中半成品樣品中的i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病外源病毒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法與實(shí)施例2相同，待檢樣品為csfv疫苗半成品1-10號(hào)

檢測(cè)結(jié)果如圖6(m：100bpdnaladder；1：01#疫苗(結(jié)果：陰性)；2：02#疫苗(結(jié)果：陰性)；3：03#疫苗(結(jié)果：陰性)；4：04#疫苗(結(jié)果：陰性)；5：05#疫苗(結(jié)果：陰性)；6：06#疫苗(結(jié)果：陰性)；7：07#疫苗(結(jié)果：陽(yáng)性)；8：08#疫苗(結(jié)果：陽(yáng)性)；9：09#疫苗(結(jié)果：陰性)；10：10#疫苗(結(jié)果：陰性)；11：陰性對(duì)照(結(jié)果：成立)；12：陽(yáng)性對(duì)照(結(jié)果：成立))所示，從圖中可見在10份csfv疫苗半成品中，2份有外源病毒bvdv的污染，8份無(wú)外源病毒bvdv的污染，可見csfv疫苗生產(chǎn)過(guò)程中監(jiān)控外源病毒bvdv非常有必要，也顯示本發(fā)明能夠特異性鑒別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(i型和ii型)，可為豬瘟病毒疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)控提供有力依據(jù)，確保疫苗接種的安全性和純凈性。

序列表

<110>金宇保靈生物藥品有限公司

<120>鑒別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的pcr檢測(cè)試劑盒及其專用引物

<130>cgcnb175056w

<160>5

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>pu-bvdv-f（上游引物）,d為g或a或t，y為c或t，k為g或t

<220>

<223>

<400>1

gtgagttcdttggatggcygaakc24

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>pu-bvdv-r（下游引物）

<400>2

gtgccatgtacagcagagattttta25

<210>3

<211>12301

<212>dna

<213>i型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒：kc963967全基因

<400>3

gtatacgagaatttgcctaacctcgtatacgtattggacactctaaaaaataattaggtc60

tagggaaaatcctccttagcgaaggccgaaaagaggctagccatgcccttagtaggacta120

gcaacataaggggggtagcaacagtggtgagttcgttggatggctgaagccctgagtaca180

gggtagtcgtcagtggttcgacgctttggaggacaagcctcgagatgccacgtggacgag240

ggcatgcccacagcacatcttaacatggacgggggtcgttcatgtgaaaacggtttaacc300

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ggtccacaacaagctaaactgccccctatgggtttcaagctgctccgacacaaaggatga900

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gctactactctcagtggtagtgttgtccgatttcgctccagagacagccagtgtgatata2100

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tttgggtaaatatgtttgcataagaccaaattggtggccttatgagacagtcacggttct2280

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gcgcatttggaccgctgctacgaccactgcattcctggtttgcttggtgaaggtggtgag2400

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ggtggtacaagtcattgcaatggatgataaactagggcccatgccttgcaaaccacatga3300

aatcatatccagtgaagggccagtggaaaagacggcatgcacctttaactacacaaaaac3360

attgaaaaacaagtactttgagcctagggacaactatttccaacaatatatgttaaaggg3420

ggagtaccaatattggtttgacctagagatcactgaccaccaccgggactactttgctga3480

gtccctgctggtgatagtagttgcactcctgggtggcaggtacgtgctttggttgctagt3540

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agtgatgatgggcaacttgttaacacatgacagtgttgaagtggtgacatatttcttact3660

actatacctactactgagagaggataacaccaaaaaatgggtcatacttatataccacat3720

catagtaatgcacccactaaagtcggtgacggtgatactgctaatggttggagggatggc3780

aaaggccgagccaggcgcccaggggtacctagagcaggttgaccttagtttcacgatgat3840

tacgatcatcgtagtaggcctggttatagccaggcgtgaccccactgtggtgccattagt3900

cacaataattgcagcactgaagatcacaggactaggctttgggcctggagtggacgcagc3960

tatggcagttctcaccttaaccctactgatgattagttatgttacagactacttcaggta4020

taaaaggtggatacaatgcatcctcagcttagtagctggggtgttccttattcggagcct4080

caaacacctaggtgaaatcaaaacccctgagctgaccataccgaactggaggccactaac4140

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tggcatattactgcaaggggccccgatccttttgctgatcgccaccctatgggccgactt4260

cctgacccttgttctgatcttacccacctacgaattagtcaagttgtactacctaaagaa4320

tgtcaagactgacgtggaaaagagttggcttggggggttagactacaaaacaattgactc4380

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aaataagaatatcagcatactcctgcccctcatcagagctacgctaataagttgtattag4500

cagcaaatggcagatggtgtatatggcttacctaaccctggactttatgtactacatgca4560

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agcaagctggtatggggaggaagaagtctacggcatgccaaaagtcatgaccataataag4800

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<210>4

<211>260

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<213>ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒：kc176779.1（其5’端基因）

<400>4

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<210>5

<211>233

<212>dna

<213>i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的5’utr區(qū)域基因的特異性保守序列（自5’端第147-379位堿基）

<400>5

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