本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種大豆低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子sp5及其在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

要想實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控，包括特異性的組織表達(dá)、特定時(shí)期的表達(dá)和誘導(dǎo)性的表達(dá)等，就要靠對(duì)基因的精確設(shè)計(jì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，也就是如何使用“分子開(kāi)關(guān)”啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控單一基因或多個(gè)基因針對(duì)特異的環(huán)境、生理和化學(xué)誘導(dǎo)來(lái)表達(dá)。最有效的，也是最具應(yīng)用前景的，就是利用植物人工合成啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)。

人工合成啟動(dòng)子對(duì)基因的精細(xì)調(diào)控已經(jīng)在植物生長(zhǎng)發(fā)育、組織特性、生物及非生物抗性中獲得了成功。mullerandsheen為了獲得一個(gè)廣譜性的細(xì)胞分裂素報(bào)告基因，對(duì)細(xì)胞分裂素雙組分產(chǎn)物傳感器（two-component-outputsensor，tcs）基因的啟動(dòng)子進(jìn)行人工設(shè)計(jì)，直接將tcs中的核心元件重復(fù)6次（tcs::luc），以經(jīng)過(guò)核心元件突變的tcs*::luc作為陰性對(duì)照。用不同的激素tz（反式玉米素，細(xì)胞分裂素的一種）、生長(zhǎng)素（naa）、aba和赤霉素處理轉(zhuǎn)化的擬南芥原生質(zhì)體，tcs::luc只對(duì)tz處理有響應(yīng)，為對(duì)照的18倍左右，而atgh3.3::luc（脫落酸誘導(dǎo)型）和rd29a::luc（赤霉素誘導(dǎo)型）也對(duì)特異的激素才有反應(yīng)。用不同種類的細(xì)胞分裂素處理（ad是腺嘌呤處理，作為陰性對(duì)照）轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，tcs::luc都有作用，表明該啟動(dòng)子對(duì)不同的細(xì)胞分裂素具有廣譜響應(yīng)性。

為了獲得強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，hou等將脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（rd29a,erd1,cor15a,kin1）的調(diào)控元件重新組合，以gus作為報(bào)告基因，設(shè)計(jì)合成了3個(gè)人工合成啟動(dòng)子。在各轉(zhuǎn)基因株系中，誘導(dǎo)情況下，人工合成啟動(dòng)子的gus表達(dá)水平要強(qiáng)于對(duì)照株系rd29a::gus株系。在不同脅迫情況下，人工合成啟動(dòng)子比rd29a啟動(dòng)子的調(diào)控活性要好很多，但不如組成型啟動(dòng)子camv35s。

acharya等利用花椰菜花葉病毒（mirabilismosaicvirus）全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的上游激活區(qū)（muas,?297to?38）和花椰菜花葉病毒亞基因組的5’端序列（mscp,?306to?125）構(gòu)建了一個(gè)高效的人工嵌合強(qiáng)啟動(dòng)子。這個(gè)啟動(dòng)子可以啟動(dòng)gus基因在轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥原生質(zhì)體中高效表達(dá)，啟動(dòng)活性強(qiáng)于camv35s啟動(dòng)子，是它的兩倍多。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中鑒定muasmscp嵌合啟動(dòng)子的活性，種子萌發(fā)過(guò)程中，muasmscp啟動(dòng)gus表達(dá)的活性高于其它類型的轉(zhuǎn)基因株系，在21天大小的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，muasmscp啟動(dòng)gus基因在整株表達(dá)且活性較高。

這些研究結(jié)果表明，通過(guò)組合不同的調(diào)控元件合成人工啟動(dòng)子可以有目的的調(diào)控基因的表達(dá)，即實(shí)現(xiàn)基因精細(xì)調(diào)控。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的是提供了一種大豆低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子sp5。

一種大豆誘導(dǎo)啟動(dòng)子sp5，其堿基序列如seqidno.1所示。

一種表達(dá)載體，它是在植物表達(dá)載體中插入了如seqidno.1所示的堿基序列；

所述的表達(dá)載體為pbi121。

一種含有其堿其序列如seqidno.1的互補(bǔ)或反向序列。

一種大豆誘導(dǎo)啟動(dòng)子sp5在用于以低溫或鹽堿為壓力作為選擇標(biāo)記的用途。

一種大豆誘導(dǎo)啟動(dòng)子sp5在培育耐低溫或抗鹽堿轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用；

所述的的植物為單子葉植物或雙子葉植物。

本發(fā)明公開(kāi)了一種大豆低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子sp5，它是以大豆中的glyma18g03930基因啟動(dòng)子區(qū)179bp、glyma09g29840基因啟動(dòng)子區(qū)382bp、以及35s核心啟動(dòng)子corecamv35s連接構(gòu)建而成，命名為syntheticpromoter5，簡(jiǎn)稱為sp5。在轉(zhuǎn)基因煙草中鑒定sp5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因gus的表達(dá)情況表明，sp5啟動(dòng)子可以受干旱、鹽、鹽堿、aba以及低溫脅迫所誘導(dǎo)，對(duì)低溫尤其敏感。本發(fā)明構(gòu)建了一種大豆人工合成啟動(dòng)子sp5，其對(duì)低溫脅迫尤其敏感，可直接應(yīng)用于農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因抗逆育種。

附圖說(shuō)明

圖1為sp5與gus融合表達(dá)載體圖；

圖2為轉(zhuǎn)sp5基因煙草在不同脅迫條件下gus蛋白的染色情況；

圖3為轉(zhuǎn)sp5基因煙草在不同脅迫條件下gus蛋白的活性。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1大豆人工合成啟動(dòng)子sp5的設(shè)計(jì)

通過(guò)分析大豆glyma18g03930與glyma09g29840基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)，在我們選定的兩個(gè)區(qū)域內(nèi)含有多個(gè)與逆境響應(yīng)的元件，比如tca-element、tcrichrepeat、ltr元件等，將glyma18g03930啟動(dòng)子區(qū)179bp、glyma09g29840啟動(dòng)子區(qū)382bp、以及35s核心啟動(dòng)子corecamv35s串聯(lián)構(gòu)建而成syntheticpromoter5，簡(jiǎn)稱為sp5，其核苷酸序列為seqidno.1序列。

實(shí)施例2啟動(dòng)子sp5表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)人工合成方法將sp5（seqidno.1）序列合成到載體puc57上，并在序列兩端添加酶切位點(diǎn)bamhl和hindiii。將puc57-sp2載體和pbi121質(zhì)粒（可直接從生物公司購(gòu)買），分別用bamhl和hindiii進(jìn)行雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物后，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定，獲得表達(dá)載體pbi121-sp2（圖1）。將載體pbi121-sp2轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌eha105中，用于浸染煙草。

實(shí)施例3轉(zhuǎn)sp5基因煙草的獲得

按照葉盤轉(zhuǎn)化法（horschetal.1988）進(jìn)行。農(nóng)桿菌菌液用滅菌水稀釋至106-107cells/ml（一般稀釋30倍左右）。取無(wú)菌煙草葉片，去掉主脈將葉片切成四方形狀，然后將其浸入到稀釋后的菌液中，侵染8-10分鐘。

(1)共培養(yǎng)

取出葉片外植體后在滅菌濾紙上吸干菌液，將其葉表面向下倒置于ms培養(yǎng)基的表面，24°c-25°c暗培養(yǎng)2天。

(2)選擇培養(yǎng)

將共培養(yǎng)葉片轉(zhuǎn)移到選擇分化培養(yǎng)基（含250mg/l頭孢；100mg/l卡那霉素）上，28°c，每日光照16小時(shí)，15-20天換一次培養(yǎng)基。

(3)生根培養(yǎng)

當(dāng)分化的抗性芽長(zhǎng)到1cm左右，切下（最好不帶任何愈傷組織）轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，28°c，每日光照16小時(shí)。

(4)土壤培養(yǎng)

當(dāng)根長(zhǎng)出約1-3cm長(zhǎng)，且密度較大時(shí)，去除封口膜，室溫環(huán)境中進(jìn)行煉苗2-3天，取出植株徹底洗凈培養(yǎng)基，同時(shí)注意盡量減少根的損傷，移入溫室土壤中培養(yǎng)。前2-3天需要遮陰培養(yǎng)。

(5)煙草的繁種

將轉(zhuǎn)基因煙草播種與人工氣候室中，繁種至t2代后，收取種子用于gus染色分析。

實(shí)施例4gus組織化學(xué)染色

將轉(zhuǎn)sp5基因煙草種植于ms固體培養(yǎng)基中，待長(zhǎng)至4片葉時(shí)將小苗移至液體培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)2天后進(jìn)行鹽、鹽堿、干旱、低溫及aba處理，干旱處理1天，其他處理均處理6小時(shí)。將處理好的煙草幼苗置于固定液（1%甲醛，50mm磷酸鈉緩沖液ph7.0，0.05%tritonx-100）中，室溫靜置固定45-60min；然后用50mm，ph7.0的磷酸鈉緩沖液漂洗2-3次，每次10-15min；加入x-gluc染色液浸沒(méi)材料，蓋上管蓋，37℃避光保溫過(guò)夜。棄去染色液，50mm，ph7.0磷酸鈉緩沖液漂洗沖洗后，加入25%、50%、75%、90%、100%的梯度濃度乙醇分別浸泡1h進(jìn)行脫色，體視顯微鏡下觀察并拍照記錄gus的表達(dá)情況。結(jié)果顯示（圖2）：sp5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gus基因在轉(zhuǎn)基因煙草各組織中均有表達(dá)，且在鹽、鹽堿、干旱、aba以及低溫處理下表達(dá)增強(qiáng)，其中低溫脅迫下gus染色較深。這些結(jié)果說(shuō)明sp5啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，且可以受鹽、鹽堿、干旱、低溫以及aba處理誘導(dǎo)，尤其受低溫脅迫誘導(dǎo)顯著，適合作為利用植物基因工程手段培育抗逆作物新品種的候選啟動(dòng)子。

實(shí)施例4gus組織化學(xué)染色及活性測(cè)定

（1）gus酶提取

1)將0.1g的轉(zhuǎn)基因煙草材料置于研缽中，加入液氮研磨成粉末；

2)加入600μl的酶提取緩沖液，研磨成勻漿；

3)4℃，12000rpm離心10min，取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）bradford法測(cè)定gus提取液的蛋白含量

1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：配置濃度0-100μg/ml的bsa梯度液（表1），與考馬斯亮藍(lán)g250按照1：5混勻，室溫靜置5min，595nm測(cè)量吸收值，以吸收值作縱坐標(biāo)，蛋白濃度為橫坐標(biāo)做回歸方程；

2)提取液蛋白含量的測(cè)定：取gus提取液20μl，加水至4ml，取出1ml，加入5ml考馬斯亮藍(lán)溶液混勻，595nm測(cè)量吸收值，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中蛋白含量。

（3）熒光測(cè)定

1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制10μm4-mu母液，用反應(yīng)終止液將其稀釋成依次為：62.5nmol/l，125nmol/l，250nmol/l，500nmol/l，1000nmol/l的濃度，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)光365nm，發(fā)射光455nm，狹縫10nm條件下測(cè)定各管熒光強(qiáng)度，制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線；

2）取6支1.5ml的離心管，各加入900μl的反應(yīng)終止液，并編號(hào)；

3）取1支1.5ml的離心管，加入37℃預(yù)熱的檢測(cè)液2mmol/lmug1ml，根據(jù)測(cè)定蛋白的濃度加入適量的gus提取液，迅速充分混合，立即取出100μl加入1號(hào)管中，此時(shí)反應(yīng)為0，嚴(yán)格計(jì)時(shí)；

4）反應(yīng)管放入37℃水浴中進(jìn)行酶反應(yīng)，分別于5、10、15、30、60min時(shí)各取出100μl加入到900μl反應(yīng)終止液，依次加入到2-6號(hào)管中混勻，分別為酶反應(yīng)5、10、15、30、60min時(shí)的樣品，在激發(fā)光365nm，發(fā)射光455nm，狹縫10nm條件下測(cè)定各管熒光強(qiáng)度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取2-6號(hào)管中4-mu的含量。

（4）gus酶活性計(jì)算

l)酶活力單位定義：每分鐘水解4-mug生成1nmol或1mg、1μg、1ng4-mu的酶量為一個(gè)活力單位，根據(jù)定義求出各樣品的酶活力；

2)gus基因表達(dá)活性：以每毫克蛋白的酶活力來(lái)計(jì)算，每毫克蛋白每分鐘催化生成1pmol4-mu作為gus的一個(gè)活力單位。

gus熒光檢測(cè)的gus活性用獲得的熒光值除以蛋白濃度和時(shí)間得到相對(duì)活性。熒光測(cè)定結(jié)果（圖3）顯示，未處理的轉(zhuǎn)sp5基因煙草熒光值與aba脅迫處理相近，都較低；在鹽、鹽堿、干旱及低溫處理下，轉(zhuǎn)基因煙草的gus熒光值均有所提高，其中低溫脅迫下提高的尤為顯著。這就表明，sp5啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，并且能夠在脅迫條件下驅(qū)動(dòng)gus基因高表達(dá)而使對(duì)應(yīng)的熒光值提高。

<110>吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>大豆低溫誘導(dǎo)人工合成啟動(dòng)子sp5及應(yīng)用

<160>1

<210>1

<211>611

<212>dna

<213>人工

<400>1

atacttcctacgttaaaatgtattttttttatctcttctaaagccgaaagtcccgtcacg60

acacatttttcttcacatccgtcacgtgtcaccttttcatcgacgatgggaagatctttc120

ggcaccgcactttctggtatcttcacgcgcaatccccatcccaccgtccattctctcact180

taagaaaataataatttaaaaattataatataaataatgaaatcaatatttttttaagaa240

acataaatgagttgaaagagtgttaggacataaaaaggaagagagtaataaatttttgcg300

ggtgaaagggaaagcaaatgagagaaaagaagaggtttgaaattggaatggaaggtagta360

agagagagagagaggaccacatgcgtgtctgaaaaggaagaagggttggacctagcgtgg420

atggaaatgattggtgccacgtagtcctatggaaaagaggatgcgccacgtgttgggaag480

gcaaagcagagagcgatgcgatgaagggtggagatagcatacggtgcctctgacggtgac540

gggcaggctgcccgtgtggccgatcccaagacccttcctctatataaggaagttcatttc600

atttggagagg611