本發(fā)明屬于飼料添加劑技術領域，具體涉及一種用于動物飼料的富鋅酵母產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法。
背景技術：
鋅是動物機體所必需的微量元素，被稱為“生命元素”。鋅能促進動物生長發(fā)育，影響骨骼形成，維持免疫機能，在哺乳動物和禽類體內(nèi)含量平均為30mg/kg。鋅參與調(diào)控了機體幾乎所有免疫細胞的功能和生長發(fā)育，在體內(nèi)代謝所需的200多種酶中均發(fā)現(xiàn)有鋅的存在。例如，在畜牧生產(chǎn)中，日糧中鋅不足或吸收不良，會影響動物體的蛋白質代謝并導致動物采食量減少，會引發(fā)腹瀉、生長不良、單位增重飼料消耗增加、骨骼發(fā)育不健全等多種不利于養(yǎng)殖生產(chǎn)的情況發(fā)生。目前動物飼養(yǎng)補充鋅的主要途徑是在飼料中額外添加所需的鋅，大部分以無機鋅為主。無機鋅吸收利用率較低，在飼料中添加過量的鋅，不僅增加了生產(chǎn)成本而且還會增加糞便中鋅的沉積，給生態(tài)環(huán)境造成環(huán)境污染。在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中，鋅等微量元素的排放已逐漸成為困擾農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的亟待解決的問題之一。
目前，國內(nèi)大多采用高劑量氧化鋅、硫酸鋅等無機鋅作為鋅營養(yǎng)添加劑，但無機鋅生物效價低、添加量大、易造成了嚴重的環(huán)境污染；而穩(wěn)定性好、生物學效價較高的氨基酸絡合鋅鹽(如蛋氨酸鋅、葡萄糖酸鋅等)由于其生產(chǎn)工藝復雜、價格較高限制其應用。而富鋅酵母不僅可以滿足動物機體對于鋅的需要，而且酵母中有很豐富的營養(yǎng)成分，可以發(fā)揮協(xié)同作用。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種富鋅酵母產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法，為動物提供安全、高效的補鋅劑。
為達到上述目的，發(fā)明人必需解決兩個關鍵性的問題，一是制備耐高鋅的酵母菌種；二是高鋅含量富鋅酵母的生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明富鋅酵母產(chǎn)品的生產(chǎn)方法包括如下步驟：
1)制備耐高鋅的酵母菌種
1.1)啤酒酵母菌種接種到含鋅的麥芽糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出抗鋅能力強的菌種，作為誘變菌種；
1.2)將抗鋅能力強的酵母菌種接種到誘變培養(yǎng)基上進行誘變培養(yǎng)20～45h；
1.3)將誘變后的菌株進行分離篩選，接種到含鋅的麥芽糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出抗鋅能力強的菌種，即為耐高鋅富鋅酵母菌種；
2)高鋅含量富鋅酵母的生產(chǎn)工藝
2.1)斜面菌種培養(yǎng)：耐高鋅富鋅酵母菌種接種于糖含量5～20％，含鋅量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h，得到斜面酵母菌種；
2.2)一級液體種子培養(yǎng)：將斜面酵母菌種稀釋至菌株數(shù)496萬/ml，取2ml稀釋液接種于裝有250ml糖含量5～20％，含鋅量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h，得到一級液體種子培養(yǎng)液；
2.3)二級液體種子培養(yǎng)：將100ml一級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有50～100l糖含量5～20％，含鋅量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h，得到二級液體種子培養(yǎng)液；
2.4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將1000ml二級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有1000～2000l糖含量5～20％，含鋅量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h，得到富鋅酵母培養(yǎng)液；
2.5)分離干燥：分離機分離，60～90℃烘干；
2.6)粉碎：粉碎機粉碎后既得到富鋅酵母產(chǎn)品，鋅含量為每千克酵母1000～5000毫克。
所述的步驟1.1)和步驟1.3)中的含鋅的麥芽糖培養(yǎng)基的總糖含量5～20％，含鋅量20～1000μg/ml，ph值4.0～7.0，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
所述的步驟1.3)中的含鋅的麥芽糖培養(yǎng)基的含鋅量高于步驟1.1)中的含鋅的麥芽糖培養(yǎng)基。
所述的步驟1.2)中的誘變培養(yǎng)基中的誘變劑為n-甲基-n-硝基-n-亞硝基胍，濃度1.8～3.2mg/ml，總糖含量5～20％，ph值4.0～7.0。
所述含鋅的麥芽糖培養(yǎng)基所含鋅為無機鋅，所述的無機鋅包括氧化鋅、硫酸鹽、碳酸鹽或氯化物鹽；所述麥芽糖培養(yǎng)基和誘變培養(yǎng)基的氮源為尿素、硝酸銨、硫酸銨和磷酸氫氨中的一種或幾種；所述麥芽糖培養(yǎng)基和誘變培養(yǎng)基的磷源為植酸鈣、磷酸氫氨、磷酸氫二氨、磷酸氫二鉀中的一種或幾種。
所述的篩選出抗鋅能力強的菌種的方法為本領域的常規(guī)手段，也可以采用如下方法：分別配置不同鋅濃度的的麥芽糖培養(yǎng)基，將啤酒酵母菌種分別接種不同鋅濃度的的麥芽糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)后選定菌種部分存活的含鋅溶度最高的麥芽糖培養(yǎng)基；該麥芽糖培養(yǎng)基中存活菌種作為抗鋅能力強的酵母菌種，作為誘變菌種。
具體實施方式
實施例1
1)依據(jù)不同生化特性的酵母菌種接種到不同鋅濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出抗鋅能力強的酵母菌種，作為誘變菌種。
2)將抗鋅能力強的酵母菌種接種到不同劑量的亞硝基的培養(yǎng)基上進行誘變；
3)將誘變的菌株進行分離篩選，接種到不同鋅濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選出生物量較高和抗鋅能力強的菌種，即為耐高鋅富鋅酵母菌種；
4)篩選培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
麥芽糖培養(yǎng)基，總糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
實施例2
富鋅酵母生產(chǎn)工藝：斜面菌種培養(yǎng)→一級液體種子培養(yǎng)→二級液體種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐培養(yǎng)→分離干燥→粉碎→富鋅酵母產(chǎn)品。
1)斜面菌種培養(yǎng)：富鋅酵母菌種接種于糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量20μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
2)一級液體種子培養(yǎng)：將斜面酵母菌種接種于50個裝有250ml糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量20μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
3)二級液體種子培養(yǎng)：將一級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有50～100l糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量20μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將二級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有1000～2000l糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量20μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，鋅分批次加入，培養(yǎng)20～45h。
5)分離干燥：分離機分離，60～90℃烘干。
6)粉碎：粉碎機粉碎后既得到高鋅含量富鋅酵母，鋅含量為每千克酵母1050毫克。
實施例3
富鋅酵母生產(chǎn)工藝：斜面菌種培養(yǎng)→一級液體種子培養(yǎng)→二級液體種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐培養(yǎng)→分離干燥→粉碎→富鋅酵母產(chǎn)品。
1)斜面菌種培養(yǎng)：富鋅酵母菌種接種于糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量500μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
2)一級液體種子培養(yǎng)：將斜面酵母菌種接種于50個裝有250ml糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量500μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
3)二級液體種子培養(yǎng)：將一級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有50～100l糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將二級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有1000～2000l糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量500μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，鋅分批次加入，培養(yǎng)20～45h。
5)分離干燥：分離機分離，60～90℃烘干。
6)粉碎：粉碎機粉碎后既得到高鋅含量富鋅酵母，鋅含量為每千克酵母5000毫克。
實施例4
富鋅酵母生產(chǎn)工藝：斜面菌種培養(yǎng)→一級液體種子培養(yǎng)→二級液體種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐培養(yǎng)→分離干燥→粉碎→富鋅酵母產(chǎn)品。
1)斜面菌種培養(yǎng)：富鋅酵母菌種接種于糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量80μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
2)一級液體種子培養(yǎng)：將斜面酵母菌種接種于50個裝有250ml糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量80μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
3)二級液體種子培養(yǎng)：將一級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有50～100l糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量80μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將二級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有1000～2000l糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量80μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，鋅分批次加入，培養(yǎng)20～45h。
5)分離干燥：分離機分離，60～90℃烘干。
6)粉碎：粉碎機粉碎后既得到高鋅含量富鋅酵母，鋅含量為每千克酵母2000毫克。
實施例5
富鋅酵母生產(chǎn)工藝：斜面菌種培養(yǎng)→一級液體種子培養(yǎng)→二級液體種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐培養(yǎng)→分離干燥→粉碎→富鋅酵母產(chǎn)品。
1)斜面菌種培養(yǎng)：富鋅酵母菌種接種于糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
2)一級液體種子培養(yǎng)：將斜面酵母菌種接種于50個裝有250ml糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
3)二級液體種子培養(yǎng)：將一級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有50～100l糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將二級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有1000～2000l糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，鋅分批次加入，培養(yǎng)20～45h。
5)分離干燥：分離機分離，60～90℃烘干。
6)粉碎：粉碎機粉碎后既得到高鋅含量富鋅酵母，鋅含量為每千克酵母3000毫克。
實施例6
富鋅酵母生產(chǎn)工藝：斜面菌種培養(yǎng)→一級液體種子培養(yǎng)→二級液體種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐培養(yǎng)→分離干燥→粉碎→富鋅酵母產(chǎn)品。
1)斜面菌種培養(yǎng)：富鋅酵母菌種接種于糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
2)一級液體種子培養(yǎng)：將斜面酵母菌種接種于50個裝有250ml糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
3)二級液體種子培養(yǎng)：將一級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有50～100l糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，培養(yǎng)20～45h。
4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將二級液體種子培養(yǎng)液接種于裝有1000～2000l糖含量5～20％，含鋅(無機鋅鹽)量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麥芽汁培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度25～36℃，鋅分批次加入，培養(yǎng)20～45h。
5)分離干燥：分離機分離，60～90℃烘干。
6)粉碎：粉碎機粉碎后既得到高鋅含量富鋅酵母，鋅含量為每千克酵母4000毫克。
實施例7
1試驗動物
試驗動物：選取體重約20kg的“杜×長×大”三元雜交豬120頭，按照遺傳背景相同、體重相近、窩別相同的原則隨機分為3組，每組4重復，每個重復10頭。
2試驗材料
2.1富鋅酵母產(chǎn)品
由實施例6方法制備富鋅酵母產(chǎn)品，鋅含量為4000mg/kg。
2.2試驗日糧
試驗組日糧按照本發(fā)明配方進行配制，其飼料配方具體為：玉米51.40％；大麥6％；小麥6％；膨化大豆6.75％；脫皮豆粕19.10％；次粉5％；棉粕5％；豆油0.50％；食鹽0.25％；所述的預混料中還包含維生素類和微量元素，其中每千克日糧中zn元素的添加劑量分別為：100mg/kg。試驗組日糧中鋅元素的添加形式為酵母鋅，而對照組日糧中zn元素的添加形式為硫酸鋅。
3試驗方法
3.1動物飼養(yǎng)試驗
選取體重約20kg的“杜×長×大”三元雜交豬120頭，隨機分為2組，每組4重復，每個重復10頭。對照組飼喂常規(guī)日糧，試驗組按本配方配制日糧飼喂。試驗按照豬的生長階段分為前期(20～35kg)、中期(35～70kg)和后期(70～110kg)3個階段。
在實驗開始、第26天(20～35kg)、第72天(35～70kg)及實驗結束(70～110kg)前1天20:00斷料供水，次日08:00以重復為單位對所有試驗豬進行空腹稱體重，結算相應試驗期的耗料情況，計算平均日增重(adg)、日采食量(adfi)和飼料利用率(f/g)。
試驗期內(nèi)提供適宜的溫度濕度，地面飼養(yǎng)，通風，自由采食，飲水。免疫消毒程序按照豬場常規(guī)方法進行。
3.2屠宰試驗
3.2.1組織中鋅元素含量
屠宰后，取左肝內(nèi)葉、左腎皮質、左心室心肌、左側脾臟及背最長肌同一位置各約60g分裝于樣品袋中，-80℃保存。測定時準確稱取0.5g左右組織樣品，置于聚四氟乙烯消化罐中，加入5ml硝酸和2mlh202，于微波消解儀中消解，消解結束后趕酸冷卻，用超純水定容至50ml，同時做試劑空白測定。
3.2.2鋅元素利用率
從試驗開始，每隔10天，以重復為單位，均勻收集糞便，將其烘干(65℃)、回潮、制成風干樣。同時對飼料進行取樣，所采集的飼料和糞便都需粉碎、過孔徑40目篩(0.45mm)，密封保存。用agilienticp-ms7500a電感耦合等離子體光譜儀測定礦物元素含量。
3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
試驗數(shù)據(jù)采用spss20.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析onewayanova進行顯著性檢驗，并采用duncan氏法經(jīng)行多重比較，以p<0.05作為差異顯著判斷標準，試驗結果以“平均數(shù)±標準差”表示。
4結果與分析
4.1本發(fā)明富鋅酵母產(chǎn)品對生長肥育豬生長性能的影響
本發(fā)明富鋅酵母產(chǎn)品對生長肥育豬生長性能的影響如表1和2所示，試驗各組間體重、日增重、日采食量和料重比均無顯著差異(p>0.05)。相比較而言，試驗組其日采食量和料重比均優(yōu)于對照組。說明本發(fā)富鋅酵母產(chǎn)品方對育肥豬生長性能無影響，且還有一定促生長作用。
表1本發(fā)明富鋅酵母對生長肥育豬體重的影響(n＝4)(kg)
表2本發(fā)明富鋅酵母產(chǎn)品對生長肥育豬生長性能的影響(n＝4)
4.2本發(fā)明富鋅酵母產(chǎn)品對生長肥育豬組織鋅元素沉積的影響
本發(fā)明富鋅酵母產(chǎn)品對生長肥育豬血清、組織中鋅元素含量的影響如表3所示，血清及組織中鋅元素含量基本趨于一致，其中對照組組織中鋅元素含量略高于試驗組，但兩者無顯著差異(p>0.05)。
表3本發(fā)明配方對生長肥育豬血清、組織鋅元素含量的影響(n＝3)
4.3本發(fā)明富鋅酵母產(chǎn)品對生長肥育豬糞便中鋅元素排泄的影響
本發(fā)明富鋅酵母產(chǎn)品對生長肥育豬鋅元素排泄的影響如表4所示。各階段鋅元素排泄量組間差異顯著(p<0.05)，試驗組鋅元素排泄量顯著低于對照組。以20～35kg階段鋅的排泄量為例，試驗組和對照組組組間差異顯著(p<0.05)，試驗組比對照組分別降低了25.87％。這說明本發(fā)明富鋅酵母產(chǎn)品可顯著降低了生長肥育豬的糞便中鋅元素的排泄量。
表4本發(fā)明富鋅酵母對生長肥育豬鋅元素排泄的影響(n＝4)
5.結論
本發(fā)明富鋅酵母產(chǎn)品對生長肥育豬生長性能及組織中鋅元素沉積沒有影響，且可以顯著降低生長肥育豬糞便中鋅元素排泄量，從而證明富鋅酵母產(chǎn)品對于豬只健康生長及保護環(huán)境的有效性。