本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種篩查癌癥腦轉(zhuǎn)移的試劑盒。
背景技術(shù)：
肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤的發(fā)病率及死亡率中，肺癌分別占13.0％和19.4％，居惡性腫瘤第一位。且受中國(guó)人口老齡化、吸煙人群年輕化等因素的影響，肺癌患者的人群基數(shù)仍在上升。腦轉(zhuǎn)移(brainmetastases)是肺癌最常見的并發(fā)癥，隨著肺癌發(fā)病率的上升、肺癌病人生存期的延長(zhǎng)，肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率日漸升高，約17％～57％的肺癌患者在疾病進(jìn)程中出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移，尤其是肺腺癌發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的幾率更高。肺癌腦轉(zhuǎn)移占顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的40％～70％。
肺癌腦轉(zhuǎn)移惡性程度高，發(fā)展迅速，預(yù)后差，如果不進(jìn)行積極治療或治療方案選擇不當(dāng)患者生存期僅為1-2個(gè)月，經(jīng)過及時(shí)治療可大大延長(zhǎng)患者壽命并提高生存質(zhì)量。因此，對(duì)于早期的肺癌患者，腦轉(zhuǎn)移的早期篩查和診斷至關(guān)重要。
長(zhǎng)鏈非編碼rna(longnoncodingrna，lncrna)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼rna分子，lncrna因缺乏完整的開放閱讀框而不能編碼蛋白質(zhì)。目前許多研究表明，lncrna是一類具有重要生物學(xué)功能的rna，參與基因組印記、染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N調(diào)控過程，在細(xì)胞分化和發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、遺傳和表觀遺傳等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
lnc-mmp2-2是一種長(zhǎng)鏈非編碼rna，位于第16號(hào)染色體chr16:55366267-55366879，hg19，基因序列長(zhǎng)度為613bp。
目前l(fā)nc-mmp2-2的功能尚未見報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
發(fā)明人對(duì)癌癥腦轉(zhuǎn)移進(jìn)行了詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2可以作為其分子標(biāo)志物。其中，長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2在腦組織中的表達(dá)水平與肺癌腦轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。因此，通過檢測(cè)肺癌患者腦組織中長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2的表達(dá)水平，可以預(yù)測(cè)待檢肺癌患者腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，為開展相應(yīng)的預(yù)防及治療措施做好準(zhǔn)備。
據(jù)此，本發(fā)明提供了一種癌癥腦轉(zhuǎn)移篩查試劑盒及長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2在癌癥腦轉(zhuǎn)移篩查中的用途。
本發(fā)明提供了一種篩查癌癥腦轉(zhuǎn)移的試劑盒，它包括任選的用于檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2表達(dá)水平的試劑。
其中，所述檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2表達(dá)水平的試劑為原位雜交、pcr檢測(cè)方法用試劑。
其中，所述試劑盒是篩查肺癌腦轉(zhuǎn)移的試劑盒。
進(jìn)一步的，所述試劑盒是篩查肺腺癌腦轉(zhuǎn)移的試劑盒。
其中，所述試劑是用于檢測(cè)腦組織中長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2表達(dá)水平的試劑。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2表達(dá)水平的試劑在制備篩查癌癥腦轉(zhuǎn)移的試劑中的用途。
其中，所述檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2表達(dá)水平的試劑為原位雜交、pcr檢測(cè)方法用試劑。
其中，所述癌癥腦轉(zhuǎn)移是指肺癌腦轉(zhuǎn)移。
進(jìn)一步的，所述癌癥轉(zhuǎn)移是指肺腺癌腦轉(zhuǎn)移。
其中，所述試劑是用于檢測(cè)腦組織中長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2表達(dá)水平的試劑。
本發(fā)明通過檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2的表達(dá)水平，可以判斷肺癌患者與疑似肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2表達(dá)水平差異，進(jìn)而篩查待檢肺癌患者腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)：若lnc-mmp2-2的表達(dá)水平高，則肺癌腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高，若lnc-mmp2-2的表達(dá)水平低，則肺癌腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)低，可用于臨床肺癌腦轉(zhuǎn)移的輔助診斷。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
附圖說明
圖1lnc-mmp2-2表達(dá)水平比較
a：正常肺組織、原位肺癌組織及肺癌腦轉(zhuǎn)移組織中l(wèi)nc-mmp2-2原位雜交染色，熒光探針為fam標(biāo)記(綠色)，dapi(藍(lán)色)為細(xì)胞核染料。
b：lnc-mmp2-2原位雜交染色進(jìn)行半定量分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明肺癌腦轉(zhuǎn)移組織明顯高于正常肺組織及原位肺癌組織(p＝0,0156)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2表達(dá)水平與肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的關(guān)系
一、實(shí)驗(yàn)材料
肺腺癌病程組織芯片微陣列(xt14-051)：購自上海芯超生物科技有限公司，含正常肺組織19例、原位肺腺癌組織(非轉(zhuǎn)移)14例和肺腺癌腦轉(zhuǎn)移組織11例；
fam-lncrna-mmp2-2核酸探針由上海歌凡生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，序列為：5’-fam-accctaggctgcaggctcctgctttgggct-3’；
原位雜交試劑盒(c004)購自上海歌凡生物科技有限公司,試劑盒包含：10x蛋白酶k、預(yù)雜交液、乙酸酐、三乙醇胺水溶液ph8.0、20xsscph4.5、20xsscph7.5；
其他自備試劑(甘氨酸、甲酰胺、鹽酸、二甲苯、30％h2o2)均為分析純購自成都科龍化工試劑廠；
depc水及dapi染料、防淬滅封片劑均購自碧云天生物技術(shù)有限公司(上海)；
熒光顯微鏡(dm4000b)購自萊卡公司(德國(guó))。
二、實(shí)驗(yàn)方法
1芯片常規(guī)脫蠟和水化：
脫蠟前將組織芯片60℃烘烤20min，二甲苯ⅰ10min，二甲苯ⅱ10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，75％乙醇5min，depc水5min。
2雜交步驟：(實(shí)驗(yàn)中的所有水試劑均用depc水配制)
2.1制作濕盒：用5×ssc(5ml)+甲酰胺(5ml)置于濕盒內(nèi).。
2.2組織芯片值于濕盒內(nèi)，30％h2o21份+9份純甲醇混合液室溫處理10min。depc水洗3×1min。
2.30.2mol/l鹽酸滴于組織上，常溫15min，用depc水洗2×1min。
2.41×蛋白酶k覆蓋組織，分子雜交儀中37℃20min。
2.50.2％甘氨酸洗液洗1min，終止蛋白酶k，pbs洗2×1min。
2.64％多聚甲醛固定組織10min，pbs洗3×1min。
2.7乙酸酐ph8.0室溫洗5min×2次。乙酸酐溶液配制：每5ml三乙醇胺水溶液中加12.6ul乙酸酐，現(xiàn)用現(xiàn)配。pbs洗5×1min。
2.85×sscph7.5室溫洗2×1min。
2.9預(yù)雜交液覆蓋組織，65℃預(yù)雜交1h。
2.10500ng/mlfam-lncrna-mmp2-2探針覆蓋切片，密封濕盒，恒溫65℃黑暗反應(yīng)48h，2×sscph7.5，室溫洗1×1min。
2.11甲酰胺加4×sscph4.51:1混合液在65℃洗3×20min。pbs洗5×1min。
2.12dapi染核，pbs洗3×5min。滴加防淬滅劑，蓋蓋玻片，熒光顯微鏡觀察拍照。
3、數(shù)據(jù)處理
拍照后對(duì)lnc-mmp2-2熒光染色進(jìn)行半定量分析，其中，
熒光強(qiáng)度為：陰性：0；弱陽性：1；陽性：2；強(qiáng)陽性：3，
陽性百分比為：0％：0；0-25％：1；25％-50％：2；50％-75％：3；75％-100％：4。
半定量評(píng)分＝熒光強(qiáng)度x陽性百分比，
半定量得分為0-12。
使用graphpad5.0對(duì)各組半定量評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
不同組織的lnc-mmp2-2表達(dá)結(jié)果見圖1。
由圖1可見，正常肺組織中，lnc-mmp2-2表達(dá)得分為5.0000±0.4382，原位肺癌組織(即非轉(zhuǎn)移的肺癌組織)中l(wèi)nc-mmp2-2表達(dá)得分為6.0000±0.5774，二者的lnc-mmp2-2含量相當(dāng)，差異不顯著。肺癌腦轉(zhuǎn)移組織中l(wèi)nc-mmp2-2表達(dá)得分為10.0000±1.1550，說明lnc-mmp2-2在肺癌腦轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)量顯著升高，與正常組織和原位肺癌組織相比，lnc-mmp2-2表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
由以上結(jié)果可以看出，與正常人群和原位肺癌患者相比，肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的lnc-mmp2-2表達(dá)水平顯著升高(p<0.05)，說明肺癌腦轉(zhuǎn)移與lnc-mmp2-2表達(dá)水平呈正相關(guān)，lnc-mmp2-2的高表達(dá)會(huì)顯著提高肺癌腦轉(zhuǎn)移的可能性，因此，可以通過檢測(cè)待檢肺癌患者的腦組織lnc-mmp2-2的表達(dá)水平，預(yù)測(cè)待檢肺癌患者腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，以開展相應(yīng)的預(yù)防及治療措施。
實(shí)施例2本發(fā)明檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2表達(dá)水平的試劑盒的組成及其使用方法
1、試劑盒的組成
fam-lncrna-mmp2-2核酸探針，序列為：
5’-fam-accctaggctgcaggctcctgctttgggct-3’；
原位雜交用：10x蛋白酶k、預(yù)雜交液、乙酸酐、三乙醇胺水溶液ph8.0、20xsscph4.5、20xsscph7.5。
depc水及dapi染料、防淬滅封片劑。
2、試劑盒的使用方法
將待檢樣本腦組織，按照原位雜交方法檢測(cè)lncrna-mmp2-2的表達(dá)水平。
對(duì)疑似轉(zhuǎn)移的肺癌患者，可分別取腦部異常部位組織、肺部組織，比較lncrna-mmp2-2表達(dá)水平，進(jìn)而評(píng)價(jià)其肺癌腦轉(zhuǎn)移的可能性，作為臨床肺癌腦轉(zhuǎn)移的輔助診斷手段。
綜上，本發(fā)明通過檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2的表達(dá)水平，可以判斷肺癌患者與疑似肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的長(zhǎng)鏈非編碼rnalnc-mmp2-2表達(dá)水平差異，進(jìn)而篩查待檢肺癌患者腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)：若lnc-mmp2-2的表達(dá)水平高，則肺癌腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高，若lnc-mmp2-2的表達(dá)水平低，則肺癌腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)低，可用于臨床肺癌轉(zhuǎn)移的輔助診斷，為患者采取相關(guān)的治療措施或者決策提供有效的依據(jù)，臨床應(yīng)用前景良好。