本發(fā)明涉及一種新的二氫高異黃酮及其制備方法和應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著我國城鄉(xiāng)居民生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，高血脂癥發(fā)病率逐年上升并有發(fā)病年齡年輕化的趨勢。因高血脂引起的心梗、腦梗、中風(fēng)、偏癱等致死人數(shù)以每年12％的速度遞增。高血脂癥的危害是隱匿、逐漸和全身性的，目前已成為危害人類健康的“頭號殺手”。目前臨床上使用的降脂類藥以合成藥物為主，其中應(yīng)用最廣的是他汀類，主要用于治療高膽固醇血癥，可顯著降低血液中的ldl-c濃度，但長期服用會引起肝功能損害、肌肉毒性，因此在肝功能不全的患者中的應(yīng)用受到限制。與此相比，中藥在治療高血脂癥具有獨特優(yōu)勢：藥源豐富，療效確切，不良反應(yīng)較小，又能通過多種途徑和多靶點在體內(nèi)發(fā)揮降脂作用。因此，從我國傳統(tǒng)中草藥中尋找出具有顯著降血脂活性、化學(xué)結(jié)構(gòu)明確且不良反應(yīng)少的藥物，對新型降血脂藥物的研究與開發(fā)具有極大的意義。黃精(polygonatumsibiricum)，別名土靈芝、太陽草、雞頭參，為百合科(liliaceae)黃精屬多年生草本植物。藥用其根莖，始載于《名醫(yī)別錄》，列為上品，具有補(bǔ)腎益精、滋陰潤燥等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明黃精在抗衰老、降血糖、降血脂、提高機(jī)體免疫力、抗病毒等方面均具有較好的藥理活性。自20世紀(jì)80年代開始，國內(nèi)外學(xué)者對黃精的化學(xué)成分進(jìn)行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)了多種化學(xué)成分，其中以多糖和甾體皂苷類含量較大，為其主要藥效成分，研究較為深入，文獻(xiàn)報道較多。除此之外，高異黃酮類成分也是黃精屬植物中一類特征成分，其結(jié)構(gòu)比異黃酮多一個碳原子，是黃酮化合物中特殊的一類。高異黃酮類在自然界分布較少，主要存在于百合科、豆科的少數(shù)屬植物中，具有抗炎、抗誘變、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞毒和雌激素等作用。目前從黃精中僅發(fā)現(xiàn)1種高異黃酮，屬于微量成分，且針對黃精中高異黃酮成分的制備方法以及降血脂活性研究尚未見文獻(xiàn)報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種從黃精中提取的新的二氫高異黃酮及其制備方法和應(yīng)用，該方法能夠有效解決快速從黃精中提取新二氫高異黃酮類化合物的問題，且提取的新二氫高異黃酮具有良好的降血脂作用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種新的二氫高異黃酮，所述的二氫高異黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：一種新的二氫高異黃酮，所述的二氫高異黃酮提取自黃精。一種新的二氫高異黃酮的制備方法，具體為：(1)粗提物的制備：取黃精新鮮塊莖切片后，將黃精加入黃精重量8倍量的體積濃度95％的乙醇溶液中回流提取3次，提取溫度為80～95℃，提取時間為1～2h，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，得到濃縮物；在濃縮物中加入蒸餾水混懸，得到濃縮物相對密度為1.1～1.2的混懸液，再用與混懸液等體積的乙酸乙酯萃取3～5次，合并乙酸乙酯層，回收溶劑，得到乙酸乙酯萃取物；(2)硅膠柱色譜初步分離：乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜初步分離，依次用體積比為100:0～0:100的石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫比例為100:50和100:100的洗脫液，薄層色譜檢識，硫酸-乙醇噴霧105℃加熱顯色，合并薄層顯色為紅色斑點的洗脫液，40～45℃減壓濃縮，得到含有目標(biāo)成分的總樣；(3)flash快速制備色譜及制備液相純化：將上述含有目標(biāo)成分的總樣，采用反相ods色譜柱，依次用體積濃度10～100％的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集體積濃度50％的甲醇水溶液洗脫部位，45～50℃減壓濃縮，進(jìn)一步經(jīng)制備型高效液相分離，用體積濃度65％甲醇水溶液洗脫，流速為7ml/min，檢測波長為210nm，按色譜圖收集洗脫時間為37min的色譜峰流出液，45～50℃減壓濃縮，得到黃褐色粉末，即為二氫高異黃酮。一種所述的二氫高異黃酮在制備降血脂藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：1、本發(fā)明從傳統(tǒng)中藥黃精中分離提取得到一種新的二氫高異黃酮類化合物，實驗證明，該二氫高異黃酮可顯著抑制hep-g2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積，并能顯著降低該細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯(tg)和總膽固醇(tc)含量，其中在降低tg方面優(yōu)于陽性對照藥辛伐他汀，具有優(yōu)異的降血脂活性。因此本發(fā)明新二氫高異黃酮的發(fā)現(xiàn)為研制新的降血脂藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。2、本發(fā)明制備工藝簡單，穩(wěn)定可靠，化合物的純度高(98％以上)，易于工業(yè)化推廣，為降血脂藥物的研發(fā)開辟了新的途徑，具有良好的社會和經(jīng)濟(jì)效益。具體實施方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實施例1黃精中總高異黃酮類化合物的提取方法，包括以下步驟：(1)粗提物的制備：取黃精新鮮塊莖切片后，將黃精加入黃精重量8倍量的體積濃度95％的乙醇溶液中回流提取3次，提取溫度為95℃，提取時間為2h，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，得到濃縮物；在濃縮物中加入蒸餾水混懸，得到濃縮物相對密度為1.1的混懸液，再用與混懸液等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，回收溶劑(乙酸乙酯)，得到乙酸乙酯萃取物；(2)硅膠柱色譜初步分離：乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜初步分離，依次用體積比為100:0、100:5、100:10、100:20、100:50、100:100、0:100的石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫比例為100:50和100:100的洗脫液，薄層色譜檢識(具體方法參考中國藥典2010年版一部附錄ⅵb法)，硫酸-乙醇噴霧105℃加熱顯色，合并薄層顯色為紅色斑點的洗脫液，40℃減壓濃縮，得到含有目標(biāo)成分的總樣；(3)flash快速制備色譜及制備液相純化：將上述含有目標(biāo)成分的總樣，采用反相ods色譜柱，依次用體積濃度10％、30％、50％、70％和100％的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集體積濃度50％的甲醇水溶液洗脫部位，50℃減壓濃縮，進(jìn)一步經(jīng)制備型高效液相分離，用體積濃度65％甲醇水溶液洗脫，流速為7ml/min，檢測波長為210nm，按色譜圖收集洗脫時間為37min的色譜峰流出液，50℃減壓濃縮，得到黃褐色粉末，命名為polygonatina?；衔锏募兌葯z測：采用高效液相色譜檢測新化合物的純度。色譜條件如下，色譜柱：kromasil100-5，c-18(250×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈/水梯度(5％→95％)；時間：65min；流速：1ml/min；檢測波長：210nm；254nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣：10μl。經(jīng)面積歸一化法測定，polygonatina的純度為98.37％?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)鑒定：所述的從黃精中分離得到的新成分polygonatina，其結(jié)構(gòu)經(jīng)高分辨質(zhì)譜(hr-esi-ms)、紫外光譜(uv)、紅外光譜(ir)、核磁共振氫譜(1h-nmr)、碳譜(13c-nmr)、二維譜(1h-1hcosy、dept、hsqc、hmbc、noesy)及圓二色譜鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)：polygonatina為黃褐色粉末，易溶于甲醇；hr-esi-msm/z:329.1026[m-h]-；結(jié)合1h-nmr譜和13c-nmr譜數(shù)據(jù)推出其分子式為c18h18o6，不飽和度為10，提示其可能具有2個或2個以上苯環(huán)結(jié)構(gòu)。ir(kbr)vmaxcm-1:在3379、1638和1600cm-1處顯示羥基、不飽和羰基和苯環(huán)的特征吸收峰。uvλmaxnm(logξ)202(4.67),225sh(4.46),288(4.29),330(3.56)，顯示高黃酮類化合物的特征紫外吸收峰。1h-nmr譜中芳香區(qū)在δ6.96(1h,d,j＝8.0hz)，6.37(1h,d,j＝2.5hz)和6.35(1h,dd,j＝8.0,2.5hz)處的3個氫信號，根據(jù)其化學(xué)位移和偶合常數(shù)提示分子中存在一個abx系統(tǒng)取代的苯環(huán)。此外，在δ6.01(1h,d,j＝2.0hz)，5.98(1h,d,j＝2.0hz)的2個氫信號分別為黃酮類a環(huán)c-8和c-6位間位偶合的典型氫信號，提示a環(huán)c-5位和c-7位均被取代。高場區(qū)在δ4.26(1h,dd,j＝11.5,4.5hz,h-2α)，4.13(1h,dd,j＝11.5,7.5hz,h-2β)，3.18(1h,dd,j＝13.5,4.5hz,h-9)，2.98(1h,m,h-3)和2.60(1h,dd,j＝13.5,9.5hz)處的氫信號，結(jié)合1h-1hcosy圖譜提示分子中存在一個(2)ch2—(3)ch—(9)ch2—片段，提示polygonatina為高異黃酮類化合物。此外，在δ3.79(3h,s)和3.72(3h,s)的氫信號提示分子中存在2個與苯環(huán)相連的甲氧基。13c-nmr和dept-135圖譜顯示18個碳信號，以上信息進(jìn)一步證實polygonatina為一個高異黃酮類化合物。polygonatina的結(jié)構(gòu)中c-7位被甲氧基取代，這一推測可被hmbc譜和noesy譜證實：在hmbc圖譜中，δ3.79處的甲氧基氫信號與δc169.3(c-7)上的碳有遠(yuǎn)程相關(guān)信號；noesy圖譜中δ3.79處的甲氧基氫信號與c-6上的氫有noe相關(guān)。此外，在hmbc圖譜中h-9(δh3.18和2.60)與c-1′(δc118.0)，c-2′(δc157.6)和c-6′(δc132.6)有遠(yuǎn)程相關(guān)信號；h-3′(δh6.37)與c-1′(δc118.0)和c-5′(δc105.7)有遠(yuǎn)程相關(guān)信號。在noesy圖譜中h-9與h-6′有noe相關(guān)；δ3.72處的甲氧基氫信號與h-5′有相關(guān)信號。以上信息證實分子中b環(huán)為1,2,4-三取代，由此可確定polygonatina的平面結(jié)構(gòu)。polygonatina的旋光值為-8.0(c0.21,甲醇)，cd圖譜在287-295nm區(qū)域顯示負(fù)的cotton效應(yīng)，結(jié)合文獻(xiàn)[ganls,chenjj,shimf,etal,nat.prod.commun.2013,8:597]，確定其c-3位手性碳為r構(gòu)型。因此，polygonatina的結(jié)構(gòu)可確定為(3r)-5-hydroxy-7-methoxyl-3-(2′-hydroxy-4′-methoxybenzyl)-chroman-4-one，即(3r)-3-(2-羥基-4-甲氧基芐基)-5-羥基-7-甲氧基苯并二氫吡喃-4-酮。表1.化合物polygonatina的1h-nmr(500mhz,cd3od)和13cnmr譜數(shù)據(jù)(125mhz,cd3od)(δinppm,jinhz)為進(jìn)一步說明本發(fā)明在醫(yī)藥領(lǐng)域中的作用，下面通過體外降血脂實驗來說明。1、hep-g2細(xì)胞體外脂質(zhì)堆積模型的建立hep-g2細(xì)胞使用胰酶消化后，均勻接種至96孔板中，待細(xì)胞生長至80％匯合后，用10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12h。吸棄培養(yǎng)基，用含有1.2μm的脂肪酸(油酸)的dmem培養(yǎng)基(10％胎牛血清)分組孵育細(xì)胞24h，取出后，吸棄培養(yǎng)基，pbs洗1～3次。4％多聚甲醛在4℃下固定12h。取出后，每孔加油紅o染色液20μl染色15min，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞脂質(zhì)堆積情況。2、hep-g2細(xì)胞體外脂質(zhì)堆積實驗hep-g2細(xì)胞使用胰酶消化后，均勻接種至96孔板中，待細(xì)胞生長至80％匯合后，用10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12h。吸棄培養(yǎng)基，實驗分為正常組、模型組、陽性對照組、樣品組。正常對照組僅加入dmem培養(yǎng)基(10％胎牛血清)，模型組加入僅含有脂肪酸(1.2μm)的dmem培養(yǎng)基(10％胎牛血清)，陽性對照組加入含有脂肪酸(1.2μm)及陽性藥辛伐他汀(10μm)的dmem培養(yǎng)基(10％胎牛血清)，樣品組加入含有脂肪酸(1.2μm)及篩選樣品polygonatina(10μm)的dmem培養(yǎng)基(10％胎牛血清)，各組孵育細(xì)胞24h。吸棄培養(yǎng)基，pbs洗1～3次。4％多聚甲醛在4℃下固定12h。取出后，每孔加油紅o染色液20μl染色15min。每孔加dmso100μl溶解，置于358nm下測定吸光度(od值)。結(jié)果見表2。表2hep-g2細(xì)胞脂質(zhì)堆積實驗結(jié)果組別od值統(tǒng)計學(xué)意義正常對照組0.1799±0.0071/模型組0.2524±0.1274/陽性對照組0.2027±0.1076*樣品組0.1803±0.0021**注：與模型組(model)比較*p<0.05；**p<0.01。3、hep-g2細(xì)胞中甘油三酯(tg)及總膽固醇(tc)含量測定：hep-g2細(xì)胞使用胰酶消化后，均勻接種至24孔板中，待細(xì)胞生長至80％匯合后，用10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12h。吸棄培養(yǎng)基，實驗分為正常組、模型組、陽性對照組、樣品組。正常對照組僅加入dmem培養(yǎng)基(10％胎牛血清)，模型組加入僅含有脂肪酸(1.2μm)的dmem培養(yǎng)基(10％胎牛血清)，陽性對照組加入含有脂肪酸(1.2μm)及陽性藥辛伐他汀(10μm)的dmem培養(yǎng)基(10％胎牛血清)，樣品組加入含有脂肪酸(1.2μm)及篩選樣品polygonatina(10μm)的dmem培養(yǎng)基(10％胎牛血清)，各組孵育細(xì)胞24h。取出，吸棄培養(yǎng)基，預(yù)冷pbs洗1～3次，每孔加100μl裂解液(蛋白裂解液：蛋白酶抑制劑按99：1配制)，置冰上35min使其充分裂解。按照試劑盒說明書方法使用甘油三酯(tg)測試盒(即gpo-pap酶法)和總膽固醇(t-cho)測試盒(即cod-pap法)分別對甘油三酯(tg)及總膽固醇(tc)含量進(jìn)行測定。結(jié)果見表3。表3hep-g2細(xì)胞中甘油三酯(tg)及總膽固醇(tc)含量測定實驗結(jié)果組別tg含量tc含量正常對照組0.2848±0.02190.1382±0.0254模型組0.5148±0.03710.2591±0.0282陽性對照組0.3107±0.0096**0.1320±0.0154**樣品組0.2903±0.0331**0.1506±0.0580**注：與模型組(model)比較*p<0.05；**p<0.01。以上實驗表明，本發(fā)明制備出的polygonatina可顯著抑制hep-g2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積，并能顯著降低該細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯(tg)和總膽固醇(tc)含量，其中在降低tg方面優(yōu)于陽性對照藥辛伐他汀。本發(fā)明為研制新的降血脂藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。以上所述僅為本發(fā)明最佳的實施例，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12