本發(fā)明涉及一種用于提高微生物次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)量的復合菌劑，尤其涉及一種用于提高多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的液態(tài)復合微生物菌劑，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids，pufas)是指碳原子數(shù)多于或等于18且含有兩個或兩個以上雙鍵的一類脂肪酸。通常按照第一個雙鍵的位置把多不飽和脂肪酸分為3類：n-3pufas，即從甲基端數(shù)第1個雙鍵的位置在第3碳位的多不飽和脂肪酸，如二十二碳六烯酸(22:6n-3,dha)和二十碳五烯酸(20:5n-3,epa)；n-6pufas，指第一個雙鍵的位置在從甲基端數(shù)的第6碳位，如花生四烯酸(20:4n-6,aa)和γ-亞麻酸(18:3n-6，gla)；另外還有第1個雙鍵的位置在第9碳位的n-9類pufas。
pufas大多數(shù)是重要生物活性物質(zhì)的前體，具有多方面的藥用價值和營養(yǎng)價值。pufas具有穩(wěn)定細胞膜功能、降低血中膽固醇和甘油三酯含量、降低血液粘稠度，改善血液微循環(huán)、抗心血管疾病、促進機體生長發(fā)育，增強記憶力和思維能力等生理功能，而且雙鍵愈多，不飽和程度愈高，營養(yǎng)價值也愈高。目前pufas主要來源于深海魚油及某些植物油。然而，魚油和植物油資源有限，pufas含量低，易受氣候、產(chǎn)地等環(huán)境條件的影響，而且純化成本高，在加工過程中容易被氫化。目前的研究方向之一就是尋找能夠代謝產(chǎn)生pufas的細菌、真菌和藻類等微生物。
目前產(chǎn)pufas的微生物多種多樣,包括細菌(嗜酸乳桿菌、混濁紅球菌、弧菌等)、酵母(彎假絲酵母、淺白色隱球酵母、膠黏紅酵母、斯達氏油脂酵母、產(chǎn)油油脂酵母等)、霉菌(深黃被孢霉、高山被孢霉、卷枝毛霉、米曲霉、土曲霉、雅致枝霉、三孢布拉氏霉)和藻類(鹽生杜氏藻、粉核小球藻、等鞭金藻、三角褐指藻、新月菱形藻等)。由于細菌產(chǎn)量低，目前對于pufas的生產(chǎn)主要集中在真菌和藻類。尤其是真菌，其具有生長周期短，培養(yǎng)簡單，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、不受原料、氣候、產(chǎn)地的限制，易規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。真菌中高山被孢霉(moriterellaalpina)、長被孢霉(mortierellaelongata)、水霉(saprolegnia)、輪枝霉(diasporangium)、樟疫霉(phytophthoracinnamomij)、毛霉(mucor)、小克銀漢霉(cucorcircinelloides)等菌含有epa、aa，被孢霉(mortierella)、卷枝毛霉(mucorcircinelloides)、魯氏毛霉(mucorrouxianus)等菌種含有g(shù)la。長被孢霉(mortierellaelongata)、畸雌腐霉(pythiumirregulare)、破囊壺菌(thraustochytriumauneum)、終極腐霉(pythiumultimum)、頭孢霉(cephalosporium)等菌含有epa、dha。藻類的培養(yǎng)受外界條件影響較大，用它生產(chǎn)pufas有一定難度。真菌在自然界分布廣且易培養(yǎng)，所以目前從真菌中尋求高產(chǎn)菌株已成為眾多研究者關(guān)心的問題，且前景可期。但檢索發(fā)現(xiàn)，目前利用真菌發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的研究大多集中在利用單一菌株進行發(fā)酵，而利用功能菌株混合制成的復合菌劑發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的研究卻未見相關(guān)報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種用于提高多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的復合微生物菌劑，以實現(xiàn)快速提升多不飽和脂肪酸的發(fā)酵產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的目的。
本發(fā)明所述用于提高多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的復合微生物菌劑，其中所述復合微生物菌劑為液態(tài)，所述的多不飽和脂肪酸是指：棕櫚酸(c16:0)，硬脂酸(c18:0)，油酸(c18:1)，亞油酸(c18:2)，α-亞麻酸(c18:3)，γ-亞麻酸(c18:3)，花生酸(c20:0)，花生一烯酸(c20:1)，花生二烯酸(c20:2)和/或花生四烯酸(c20:4)；
其特征在于：
所述復合微生物菌劑由深黃被孢霉、高山被孢霉和卷枝毛霉三種活性菌體細胞和液體培養(yǎng)基組成；其中每毫升復合微生物菌劑中三種活性菌體的細胞總數(shù)不少于1×108個，且三種活性菌體細胞數(shù)目的配比為(1～5):(1～5):(1～5)；所述液體培養(yǎng)基的配方是：每升自來水中含80g/l葡萄糖、2ml/l大豆油、1g/l玉米淀粉、4g/l酵母浸提物、2g/l硫酸銨，1g/l磷酸二氫鉀，1g/l磷酸氫二鉀，2g/l檸檬酸鈉，2g/l硫酸鎂。
上述的用于提高多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的復合微生物菌劑中：所述每毫升復合微生物菌劑中黃被孢霉、高山被孢霉與卷枝毛霉三種活性菌體細胞數(shù)目的配比優(yōu)選5:1:2。
本發(fā)明所述用于提高多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的復合微生物菌劑的制備方法，步驟是：按照接種體積比為5％、溫度為26℃、轉(zhuǎn)速為180r/min的培養(yǎng)方式，分別將深黃被孢霉、高山被孢霉和卷枝毛霉在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)42～45h；分別檢測600nm條件下三種菌液的吸光度值，計算各自的菌體細胞濃度；按照每毫升復合微生物菌劑中三種活性菌體的細胞總數(shù)不少于1×108個，且三種活性菌體細胞數(shù)目的配比為(1～5):(1～5):(1～5)的方式將其混合，制得用于提高多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的復合微生物菌劑。
上述用于提高多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的復合微生物菌劑的制備方法中，優(yōu)選按照每毫升復合微生物菌劑中三種活性菌體的細胞總數(shù)不少于1×108個，且三種活性菌體細胞數(shù)目的配比為5:1:2的方式將其混合，制得用于提高多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的復合微生物菌劑。
本發(fā)明公開了一種用于提高多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的復合微生物菌劑，相比于傳統(tǒng)的單一菌株發(fā)酵，利用本發(fā)明所述的復合微生物菌劑發(fā)酵相同天數(shù)后，生物量和產(chǎn)脂率均有了不同程度的提高，多不飽和脂肪酸的發(fā)酵產(chǎn)量也有了明顯的提升，工業(yè)化應用前景廣闊。
附圖說明
圖1.氣相色譜分析圖譜。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明提供的復合微生物菌劑及其發(fā)酵方法進行詳細描述和說明。所描述的實例僅僅是本發(fā)明內(nèi)容的一部分實例，不是全部實例。其內(nèi)容是對本發(fā)明的解釋而非用于限定本發(fā)明的保護范圍。
實施例1：功能菌株的產(chǎn)脂能力分析
(1)菌株活化
將深黃被孢霉(編號3.341，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)、高山被孢霉(編號2557，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)和卷枝毛霉(編號2632，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)在pda試管斜面培養(yǎng)基(馬鈴薯浸出液200ml/l、葡萄糖20g/l、瓊脂15g/l，用自來水配制，ph自然，115℃滅菌30min)上活化，28℃恒溫箱培養(yǎng)5～7天，形成深黃色的分生孢子。
(2)種子液的制備
用無菌鏟挖取(1)中活化后的深黃被孢霉、高山被孢霉和卷枝毛霉，分別接種到液體培養(yǎng)基(80g/l葡萄糖、2ml/l大豆油、1g/l玉米淀粉、4g/l酵母浸提物、2g/l硫酸銨，1g/l磷酸二氫鉀，1g/l磷酸氫二鉀，2g/l檸檬酸鈉，2g/l硫酸鎂，用自來水配制，ph為6.8±0.2，115℃滅菌30min)中，在26℃、180r/min條件下培養(yǎng)42h。
(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的種子液按照體積比為5％的比例轉(zhuǎn)接到100ml新鮮的液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為180r/min，28℃發(fā)酵8天。采用4層無菌紗布過濾回收菌絲體。
(4)生物量的測定
將(3)中收集的菌絲體用自來水沖洗干凈，于60℃烘干，稱重。用g干菌體/l發(fā)酵液來計算生物量。
(5)菌體粗脂質(zhì)的測定
稱取干燥后的菌絲體于研缽中，加入適量石英砂研磨至微粒。將濾紙片疊成紙包后移入烘箱中105±2℃干燥2h。取出放入干燥器中冷卻至室溫。向濾紙包中裝入研細的菌絲體并稱量其總重量。將裝有樣品的濾紙包用長鑷子放入抽提筒中，加入石油醚使樣品包完全浸沒。連接好抽提器各部分，接通冷凝水水流在70-80℃恒溫水浴中進行抽提，每小時回流7次左右，萃取7h。抽提完畢后，用長鑷子取出濾紙包，在通風處使石油醚揮發(fā)。將濾紙包置于105±2℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重為止。再次稱量裝有樣品的濾紙包，減少的重量即為菌體粗脂質(zhì)的重量。粗脂質(zhì)重量/菌體重量即為產(chǎn)脂率(％)。
結(jié)果顯示，在上述條件下發(fā)酵結(jié)束后深黃被孢霉生物量為18.8g/l，產(chǎn)脂量6.43g/l，產(chǎn)脂率34.2％；高山被孢霉生物量為19.4g/l，產(chǎn)脂量4.98g/l，產(chǎn)脂率25.6％；卷枝毛霉生物量為20.4g/l，產(chǎn)脂量4.19g/l，產(chǎn)脂率20.5％。
實施例2：功能菌株的混合比例優(yōu)化
為了制作適用于提高多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的復合微生物菌劑，對深黃被孢霉、高山被孢霉和卷枝毛霉的用量比例進行了l9(34)正交實驗優(yōu)化。設(shè)定實驗因素和水平如表1所示。
表1正交實驗因素水平表
功能菌株的發(fā)酵及產(chǎn)脂分析方法同實施例1。
正交實驗結(jié)果如表2所示。
表2正交試驗結(jié)果
從表2中可以看出，當深黃被孢霉:高山被孢霉:卷枝毛霉＝1:5:5時生物量達到最大值30.95g/l，此時復合微生物菌劑的產(chǎn)脂率為16.79％；其次是當深黃被孢霉:高山被孢霉:卷枝毛霉＝5:5:2時生物量達到29.98g/l，產(chǎn)脂率為36.63％。雖然當深黃被孢霉:高山被孢霉:卷枝毛霉＝2:1:2和5:1:5時復合微生物菌劑的產(chǎn)脂率達到最大，分別是50.86％和50.76％，但是此時發(fā)酵液中的生物量和產(chǎn)油量也偏低。對生物量和產(chǎn)脂率的極差分析表明，對生物量影響最大的是高山被孢霉，其后依次是卷枝毛霉和深黃被孢霉，優(yōu)選方案是b3c2a3；對產(chǎn)脂率影響最大的是高山被孢霉，其后依次是深黃被孢霉和卷枝毛霉，優(yōu)選方案是b1a3c2。
對優(yōu)選的方案b3c2a3、b1a3c2進行搖瓶發(fā)酵后,結(jié)果顯示前一組優(yōu)化比例的復合微生物菌劑的生物量為29.98g/l，產(chǎn)脂量為10.98g/l，產(chǎn)脂率為36.63％；后一組優(yōu)化比例的復合微生物菌劑的生物量為32.87g/l,產(chǎn)脂量達到16.94g/l，產(chǎn)脂率為51.54％。方案b1a3c2優(yōu)于方案b3c2a3，故選定的優(yōu)化方案為b1a3c2，即復合微生物菌劑中深黃被孢霉:高山被孢霉:卷枝毛霉活性菌體細胞數(shù)目的配比優(yōu)選5:1:2。
實施例3復合微生物菌劑的制備
(1)按照實施例1中的方法將深黃被孢霉、高山被孢霉和卷枝毛霉進行活化，并制備種子液。
(2)按照體積比為5％的比例，分別將深黃被孢霉、高山被孢霉和卷枝毛霉接種到50ml新鮮的液體培養(yǎng)基(80g/l葡萄糖、2ml/l大豆油、1g/l玉米淀粉、4g/l酵母浸提物、2g/l硫酸銨，1g/l磷酸二氫鉀，1g/l磷酸氫二鉀，2g/l檸檬酸鈉，2g/l硫酸鎂，用自來水配制，ph為6.8±0.2，115℃滅菌30min)中，在26℃、180r/min條件下培養(yǎng)42h。
(3)分別檢測600nm條件下深黃被孢霉、高山被孢霉和卷枝毛霉菌液的吸光度值，計算各自的菌體細胞濃度。
(4)按照每毫升復合微生物菌劑中三種活性菌體的細胞總數(shù)不少于1×108個，且三種活性菌體細胞數(shù)目的配比為5:1:2的方式將其混合，制得用于提高多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的復合微生物菌劑。
實施例4復合微生物菌劑的發(fā)酵檢測
(1)選用實施例3中制備的復合微生物菌劑進行發(fā)酵。
(2)復合微生物菌劑的發(fā)酵及菌體中脂質(zhì)的提取方法同實施例1。以不接入復合微生物菌劑的液體培養(yǎng)基作為對照組，對照組和實驗組分別設(shè)立3個平行。
(3)多不飽和脂肪酸組分的氣相色譜分析
脂肪酸甲酯化：取脂質(zhì)樣品0.05g，置于10ml試管中，加入28g/l氫氧化鉀-甲醇溶液溶液1ml，60℃水浴皂化15min，冷卻后加入14％的三氟化硼-甲醇溶液1ml，于60℃水浴中振蕩2min進行甲酯化，放冷，準確加入正己烷1ml，振蕩加入飽和氯化鈉1ml，取上清液。
氣相色譜條件：脂肪酸甲酯化樣品采用gc-2010(shimadzuco.,japan)進行分析，色譜柱為db-waxetr(30m×0.32mm，φ0.25μm)。氫火焰離子檢測器檢測，汽化室和檢測器溫度分別為250℃和260℃，分流方式進樣1μl，分流比10:1，載氣為氮氣。程序升溫：初始溫度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以1℃/min升到210℃，保持15min。
多不飽和脂肪酸標準品購自上海甄準生物科技有限公司。
比對樣品和標準品在氣相色譜上出峰的保留時間(圖1)，利用面積歸一化計算復合微生物菌劑發(fā)酵液中不飽和脂肪酸的含量分別為：棕櫚酸(c16:0)1.83g/l，硬脂酸(c18:0)1.68g/l，油酸(c18:1)1.96g/l，亞油酸(c18:2)2.72g/l，α-亞麻酸(ala,c18:3)0.34g/l，γ-亞麻酸(gla,c18:3)0.28g/l，花生酸(c20:0)0.058g/l，花生一烯酸(c20:1)0.023g/l，花生二烯酸(c20:2)0.017g/l,花生四烯酸(c20:4)1.94g/l。
結(jié)果顯示，本發(fā)明所述復合微生物菌劑對發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的提升有明顯的促進效果，生物量和產(chǎn)脂率均有了不同程度的提高，多不飽和脂肪酸的發(fā)酵產(chǎn)量也有了明顯的提升，具有工業(yè)應用前景。