本發(fā)明屬于分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及蓮霧est-ssr分子標(biāo)記。

背景技術(shù)：

蓮霧[syzygiumsamarangense(blume)merri.etperry]原產(chǎn)于馬來半島及安達(dá)曼群島，是桃金娘科（myrtaceae）蒲桃屬（syzygium）的熱帶常綠果樹，別名洋蒲桃、南洋蒲桃、爪哇蒲桃、甜霧、水石榴等。蓮霧富含多種藥用成分，如黃酮類、查耳酮類、己烷等，具有止瀉、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗高血糖、抗膽堿酯酶、抗炎、提高免疫力等功效。蓮霧果實(shí)色澤艷麗，形態(tài)獨(dú)特，清甜爽口，口感佳，富含酚類物質(zhì)，是極具保健價(jià)值的水果之一，受國內(nèi)外消費(fèi)者喜愛。在馬來西亞、泰國、印度尼西亞等地均有廣泛種植，是當(dāng)?shù)毓麡I(yè)的重要組成部分，鮮果常銷往歐美國家。我國最早開始商品化種植蓮霧的地區(qū)是臺灣，近年來，隨著傳統(tǒng)熱區(qū)優(yōu)勢果樹如荔枝、龍眼、柑桔等價(jià)格的回落，蓮霧成為新興的熱帶果樹，栽培面積逐步擴(kuò)增，主產(chǎn)區(qū)為臺灣、海南、福建、廣東和廣西等地，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2014年我國蓮霧種植面積6.87萬畝，產(chǎn)量13.6萬噸，每公斤售價(jià)30~50元，經(jīng)濟(jì)效益高，具發(fā)展?jié)摿Α?/p>

蓮霧有具有豐富的遺傳多樣性，但相關(guān)研究報(bào)道比較少。臺灣根據(jù)果實(shí)顏色將蓮霧分為大（深）紅種、淡紅種、粉紅種、青種和白種等五類（林正忠等，2004）。王家保等(2004)對海南的11份蓮霧資源進(jìn)行同工酶研究，結(jié)果表明11份資源根據(jù)顏色不同聚成紅色果皮、白色果皮、綠色果皮3大類，紅色果皮與白色果皮親緣關(guān)系較綠色果皮近。但何橋等(2006)對12份蓮霧資源和2個(gè)蓮霧近緣種進(jìn)行了issr分析，聚類分析結(jié)果顯示蓮霧并不以果皮顏色相同聚為一類，而以成熟期相近聚為一類，因此他指出成熟期可能在蓮霧親緣關(guān)系和分類地位中有重要作用。蓮霧自從爪哇、馬來西亞等國引入我國后，在長期的適應(yīng)性栽培下產(chǎn)生了許多地方品種及資源，這些地方品種多以果實(shí)顏色命名，如‘大紅蓮霧’、‘粉紅蓮霧’、‘青蓮霧’等，這極有可能造成同名異物和同物異名，不僅給蓮霧種質(zhì)資源收集、保存、鑒定及利用造成難度，也制約了優(yōu)良品種的選育和推廣應(yīng)用。

dna分子標(biāo)記是鑒定種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要手段，其中微衛(wèi)星序列（即簡單重復(fù)序列simplesequencerepeat，ssr）分子標(biāo)記因其位點(diǎn)特異、高多態(tài)性、高穩(wěn)定性、重復(fù)性好、呈共顯性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜建立等方面。est-ssr標(biāo)記來源于dna序列的轉(zhuǎn)錄區(qū)，比基于基因組序列開發(fā)的ssr標(biāo)記種間通用性更高，也更經(jīng)濟(jì)方便，近年來被廣泛地應(yīng)用于多種植物的ssr分子標(biāo)記開發(fā)上，在刺梨、洋蔥、藍(lán)靛果忍冬、絲瓜等園藝植物上均有報(bào)道。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)錄組測序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行ssr標(biāo)記搜索，分析其分布及組成特征，進(jìn)行初步可用性評價(jià)，以期為蓮霧的品種鑒定、種質(zhì)資源多樣性分析、建立核心種質(zhì)和分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供蓮霧est-ssr分子標(biāo)記，利用蓮霧轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行ssr標(biāo)記開發(fā)能獲得較高頻率的ssr位點(diǎn)，且類型豐富，為蓮霧遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建提供更加豐富可靠的標(biāo)記選擇。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

蓮霧est-ssr分子標(biāo)記編號為wassr3、wassr12-13、wassr37-39、wassr41-42、wassr44、wassr50、wassr55、wassr60、wassr63、wassr70、wassr72、wassr74、wassr80、wassr85、wassr87-88、wassr91-92，各編號所對應(yīng)的蓮霧est-ssr分子標(biāo)記的引物序列如seqidno.1-44所示。

所述的蓮霧est-ssr分子標(biāo)記在蓮霧遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用。

本發(fā)明的具體方法是：

（1）采用ctab法提取蓮霧基因組dna；

（2）使用misa程序（http://pgrc.ikp-gatersleben.de/misa）進(jìn)行ssr位點(diǎn)搜索，以二至六核苷酸最少重復(fù)次數(shù)分別為6、5、5、5、和5次為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行搜索。用primer3.0軟件對ssr重復(fù)單元前后的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)及評價(jià)，每條ssr產(chǎn)生3條引物。引物序列長度18~27bp，gc含量40%~60%，退火溫度57~63℃，上、下游引物的tm值相差≤2℃，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度100~280bp；且無二級結(jié)構(gòu)和二聚體；

（3）est-ssr引物篩選：pcr反應(yīng)體系為20ul，其中2.5mmol/ldntp4μl，5utaq酶0.3μl，100ngdna1.5μl，10μmol/l的上下游引物各1μl，10×buffer（mg2+）2.5μl，加ddh2o補(bǔ)至20μl。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，56℃退火30s（退火溫度因不同引物而異），72℃延伸1min；最后72℃延伸7min。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明對來自3個(gè)蓮霧品種果實(shí)的21153條unigene（4.75mb）序列進(jìn)行est-ssr搜索，得到11641個(gè)ssr位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率為55.03%，高于藍(lán)靛果忍冬（32.51%）、刺梨（20.37%）、荔枝（16.35%）、柑橘（21.74%，5.2kb）、梨（7.1%，7.2%）等木本果樹，也高于蘿卜（23.79%）、絲瓜（14.97%）、辣椒（7.84%）、歐薄荷（9.88%）等草本植物。從前人對植物的研究結(jié)果來看，大多數(shù)植物的est-ssr以二、三核苷酸重復(fù)類型為主，而主導(dǎo)重復(fù)基序因物種而異。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)蓮霧以單核苷酸重復(fù)類型（43.44%）為主，其次是二核苷酸重復(fù)類型（30.98%）和三核苷酸重復(fù)類型（24.38%），四、五和六核苷酸重復(fù)類型雖有出現(xiàn)，但所占比例很小（1.21%），這與芙蓉李、杜仲和連翹的研究結(jié)果相似，不同于荔枝、枇杷和藍(lán)靛果忍冬。蓮霧的單核苷酸重復(fù)基序中，以a/t最為豐富，這與柑橘和芙蓉李等果樹研究結(jié)果一致；二核苷酸重復(fù)基序中ag/ct最多，與已有報(bào)道的多數(shù)果樹相同，不同于荔枝（ga/tc）；三核苷酸重復(fù)基序以ccg/cgg為主，與獼猴桃、柑橘和草莓等以aag/ctt為主不同，也不同于荔枝（gaa/ttc）和梨（acc/ggt）。

本發(fā)明隨機(jī)從25734對引物種中選擇14~25bp的ssr引物100對進(jìn)行合成，其中67對引物能擴(kuò)增出理想pcr產(chǎn)物，有效擴(kuò)增率為67.00%。其中，30對引物中22對ssr引物呈現(xiàn)多態(tài)性，占有效引物的73.33%。這個(gè)比率高于刺梨（52.17%）、芙蓉李（42.5%）、藍(lán)靛果忍冬（62.5%）、荔枝（66.67%）等多種果樹。這說明蓮霧est序列中的ssr位點(diǎn)較多，引物擴(kuò)增效率較高，且其多態(tài)性也相對較高。22對多態(tài)性差異引物對30份蓮霧材料進(jìn)行upgma聚類，被分為2大類，以遺傳距離0.68為閾值，第1類可分為4小類，以果皮顏色或來源地相近聚為一類，第2類可分為2小類，以果皮顏色不同來區(qū)分，比較準(zhǔn)確的反映了30份蓮霧材料之間的差異。本發(fā)明利用蓮霧轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)出的ssr標(biāo)記可用性較高，為蓮霧種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及克隆及分子標(biāo)記輔助育種等奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1引物63在30個(gè)蓮霧材料中的多態(tài)性。品種編號名稱見表1。

圖2供試蓮霧材料的upgma聚類圖，品種編號名稱見表1。

具體實(shí)施方式

1材料與方法

1.1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

蓮霧轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于本課題組2016年對果實(shí)進(jìn)行illumina高通量深度測序的結(jié)果。測序時(shí)采集‘紫紅’、‘黑珍珠’、‘青鉆’3個(gè)蓮霧品種果實(shí)，每個(gè)品種均取來自3個(gè)不同單株的蓮霧果實(shí)各20個(gè)，液氮速凍，-80℃保存。測序時(shí)，每個(gè)單株構(gòu)建1個(gè)文庫。測序委托北京百邁客生物科技有限公司采用illuminahiseqtm2500pe125系統(tǒng)進(jìn)行rna-seq轉(zhuǎn)錄組測序（無參），采用trinity進(jìn)行序列組裝，經(jīng)過濾獲得7.80g的有效數(shù)據(jù)。

1.2材料及其dna提取

用于ssr引物篩選和可用性評價(jià)的材料為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所蓮霧種質(zhì)資源圃的30份種質(zhì)資源（表1）?；蚪Mdna提取采用ctab法進(jìn)行。

表1蓮霧ssr多態(tài)性分析材料

1.3轉(zhuǎn)錄組ssr位點(diǎn)鑒別及ssr引物設(shè)計(jì)

使用misa程序（http://pgrc.ikp-gatersleben.de/misa）進(jìn)行ssr位點(diǎn)搜索，以二至六核苷酸最少重復(fù)次數(shù)分別為6、5、5、5、和5次為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行搜索。用primer3.0軟件對ssr重復(fù)單元前后的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)及評價(jià)，每條ssr產(chǎn)生3條引物。引物序列長度18~27bp，gc含量40%~60%，退火溫度57~63℃，上、下游引物的tm值相差≤2℃，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度100~280bp；且無二級結(jié)構(gòu)和二聚體。

1.4est-ssr引物篩選

pcr反應(yīng)體系為20ul，其中2.5mmol/ldntp4μl，5utaq酶0.3μl，100ngdna1.5μl，10μmol/l的上下游引物各1μl，10×buffer（mg2+）2.5μl，加ddh2o補(bǔ)至20μl。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，56℃退火30s（退火溫度因不同引物而異），72℃延伸1min；最后72℃延伸7min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖檢測，6%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測，160v電壓，3h，銀染顯色后觀察拍照。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

ssr發(fā)生頻率為ssr的unigene數(shù)量與總unigene數(shù)量之比，ssr的出現(xiàn)頻率為ssr的個(gè)數(shù)與總unigene的數(shù)量比，ssr平均分布距離為1kb以上的unigene的堿基數(shù)與ssr數(shù)量之比。采用人工讀帶的方法，將電泳圖上可重復(fù)的清晰條帶記為“1”，同一位置無帶或不易分辨的弱帶記為“0”，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。利用軟件ntsys2.10按系統(tǒng)聚類進(jìn)行聚類繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組中ssr的分布及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

蓮霧轉(zhuǎn)錄組經(jīng)組裝后共獲得87538條unigene（序列總長約75156717bp），用misa軟件對1kb以上的unigene（21153條，序列全長為47491726bp）進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)其中8115條unigene序列中含有11641個(gè)ssr位點(diǎn)，其中2773條unigene含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的est-ssr位點(diǎn)。ssr發(fā)生頻率為38.36%，出現(xiàn)頻率為55.03%，平均4.08kb出現(xiàn)1個(gè)ssr，其中復(fù)合ssr有1432個(gè)，占12.3%。ssr重復(fù)類型6種均有，即單核苷酸至六核苷酸重復(fù)。其中單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)出現(xiàn)頻率占優(yōu)勢，分別占總ssr的43.44%、30.98%和24.38%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少，分別占總數(shù)的0.92%、0.14%和0.15%（表2）。

蓮霧轉(zhuǎn)錄組ssr重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布在5~23次之間，其中5~10次的ssr共有8753個(gè)，占總數(shù)的75.19%；其次為11~20次的ssr，共有2880個(gè)，占總數(shù)的24.74%；20次重復(fù)以上的僅有8個(gè)，僅占0.07%。蓮霧轉(zhuǎn)錄組ssr的長度主要集中在10~256bp，其中長度小于12bp的ssr有2873個(gè)（24.68%），長度在12~20bp的ssr達(dá)7094個(gè)，占總數(shù)的60.94%，長度在20bp以上的ssr有920個(gè)，只占7.90%。

表2蓮霧ssr的類型、數(shù)量及分布頻率

2.2轉(zhuǎn)錄組中ssr基序重復(fù)類型和頻率特征

蓮霧轉(zhuǎn)錄組中11641個(gè)ssr位點(diǎn)共含72種重復(fù)基序，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)分別有2、4、10、24、15和17種。從分布頻率來看（表3），以單核苷酸重復(fù)類型a/t出現(xiàn)最多，占總ssr的40.15%，占單核苷酸重復(fù)基序的總數(shù)的92.43%。其次是二核苷酸重復(fù)類型ag/ct，占總ssr的26.99%，占二核苷酸總數(shù)的87.13%。此外，三核苷酸重復(fù)基序中以ccg/cgg、agg/cct和aag/ctt占優(yōu)勢，分別占三核苷酸總數(shù)的33.62%、20.05%和16.98%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基序分布較為分散，出現(xiàn)的頻率較低。

表3蓮霧轉(zhuǎn)錄中不同微衛(wèi)星重復(fù)基序(motif)出現(xiàn)的頻率

2.3蓮霧轉(zhuǎn)錄組ssr引物設(shè)計(jì)與篩選

利用primer3.0對含ssr位點(diǎn)的8115條unigene序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)出引物25734對。隨機(jī)挑選100對不同重復(fù)單元（二、三、四、五、六核苷酸）的引物對蓮霧‘粉紅種’dna進(jìn)行ssr-pcr擴(kuò)增以驗(yàn)證其有效性。結(jié)果表明76對引物實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，占100對ssr引物的76%。在76對有效擴(kuò)增引物中，67對（88.12%）pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小相符，有9對（13.43%）擴(kuò)增產(chǎn)物長度超過預(yù)期。

2.4多態(tài)性分析

選取30份蓮霧，利用30對有效的est-ssr引物進(jìn)行擴(kuò)增及多態(tài)性評價(jià)。其中22對引物存在多態(tài)性差異（表4），占有效擴(kuò)增引物的73.33%。每對引物產(chǎn)生的多態(tài)性片段數(shù)在2~6之間，23對引物共得到63條條帶，其中多態(tài)性片段52個(gè)，每對引物平均產(chǎn)生2.36個(gè)多態(tài)性片段，圖1為引物63的擴(kuò)增情況。

表422對蓮霧ssr引物信息

利用22對多態(tài)性ssr引物對30份蓮霧材料進(jìn)行聚類分析，在遺傳距離0.60處，供試材料被分成2大類（圖2）。第1類包含26份材料，以遺傳距離0.68為閾值，該類被分為4小類，其中以‘印尼大葉’、‘黑鉆石’和‘紫紅’為代表的紅色果皮蓮霧聚為一類，以‘翡翠’、‘泰國青種’和‘pethjinda’為代表的綠色果皮蓮霧聚在一起，‘龍文實(shí)生’和‘印度紅’歸為一類，來源于同一果園的‘長泰青種’、‘青鉆’和‘長泰粉紅種’聚為一類。第2類包含4份材料，其中紅色果皮蓮霧（‘紅寶石’、‘香水’、‘農(nóng)科4號’）歸為一類，‘白蓮霧’果皮為白色，自成一類。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所

<120>蓮霧est-ssr分子標(biāo)記

<130>44

<160>44

<170>patentinversion3.3

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<213>人工序列

<400>31

gggtttgggtttgagttgtg20

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>32

aaaagcaaacggggctactt20

<210>33

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>33

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<210>34

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>34

tcgttataatcgtccggctt20

<210>35

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>35

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<210>36

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>36

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<210>37

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>37

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<210>38

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>38

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<210>39

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<213>人工序列

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<210>40

<211>20

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<213>人工序列

<400>40

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>41

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<210>42

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>42

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<210>43

<211>20

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<213>人工序列

<400>43

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<210>44

<211>20

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<213>人工序列

<400>44

aatgccgtcaatttctcacc20