本專(zhuān)利公開(kāi)了一種紙基靈敏檢測(cè)mirna的方法，涉及手繪紙電極方法和手動(dòng)制作紙金電極方法和電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，即在一張紙上利用蠟筆和鉛筆通過(guò)手繪技術(shù)制作手繪紙電極再通過(guò)化學(xué)生長(zhǎng)法，生長(zhǎng)金納米金，制作紙芯片，更確切的說(shuō)采用特異性雙鏈核酸酶（duplexspecificnuclease，dsn）在紙芯片上構(gòu)建了mirna的信號(hào)放大機(jī)制，即目標(biāo)mirna與亞甲基藍(lán)標(biāo)簽標(biāo)記巰基修飾的dna發(fā)夾探針sh-cp-21在紙芯片上形成dna/rna的雜交核酸雙鏈，隨后dsn切割rna/dna雙鏈體的氧化還原標(biāo)記的發(fā)夾探針，切割后帶有標(biāo)記發(fā)夾探針又會(huì)與目標(biāo)mirna雜交導(dǎo)致rna/dna雙鏈體的形成，照此循環(huán)，再通過(guò)電化學(xué)方法檢測(cè)。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)在生活節(jié)奏的加快，不健康的飲食和無(wú)規(guī)律的作息時(shí)間等一系列壞習(xí)慣導(dǎo)致了人類(lèi)患上了不同的疾病。癌癥已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的一大殺手，近年來(lái)其發(fā)病率及死亡率更是呈現(xiàn)逐步走高的趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，mirna與癌癥密切相關(guān)，可以作為癌癥早期的檢測(cè)標(biāo)志物。它廣泛存在于各種體液里，包括唾液、血漿、精液、眼淚和尿液等。而且癌癥的發(fā)生與多種mirna的變化密切相關(guān)，用單一mirna的變化來(lái)說(shuō)明癌癥的發(fā)生存在很大的局限性。由幾個(gè)mirna同時(shí)變化造成，以mirna等為代表的基因分析已成為臨床診斷的理想生物標(biāo)記。

mirna是一類(lèi)具有調(diào)節(jié)功能的非編碼rna，它通過(guò)調(diào)節(jié)信使rna影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，長(zhǎng)約為20-25個(gè)核苷酸。每個(gè)mirna可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)mirna也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過(guò)一個(gè)mirna來(lái)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過(guò)幾個(gè)mirna的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。所以mirna與癌癥密切相關(guān)，可以作為癌癥早期的檢測(cè)標(biāo)志物。

由于癌癥的發(fā)生與多種mirna的變化密切相關(guān)，用單一mirna的變化來(lái)說(shuō)明癌癥的發(fā)生存在很大的局限性，而且體液中mirna含量極低。所以同時(shí)檢測(cè)多種mirna和在mirna含量很低時(shí)就能有效快速地檢測(cè)出變得尤為重要。但是到目前為止，這個(gè)過(guò)程仍需要通過(guò)昂貴的實(shí)驗(yàn)室工作，使用顯微鏡和電腦芯片來(lái)實(shí)現(xiàn)，而且檢測(cè)靈敏性低，這在很多經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)是不可能實(shí)現(xiàn)的，因此發(fā)明一種既能檢測(cè)到低濃度又能降低mirna檢測(cè)成本的方法具有重要意義。一方面，dsn通過(guò)循環(huán)切割修飾在紙芯片上的目標(biāo)mirna與發(fā)夾探針形成dna/rna的雜交雙鏈中的發(fā)夾探針，釋放出目標(biāo)mirna，然后目標(biāo)mirna又會(huì)返回到下一輪反應(yīng)，繼續(xù)與有標(biāo)記的發(fā)夾探針結(jié)合，dsn又會(huì)切割目標(biāo)mirna與發(fā)夾探針形成dna/rna的雜交雙鏈中的有標(biāo)記的發(fā)夾探針，照此，dsn通過(guò)多次循環(huán)切割修飾在紙芯片上的目標(biāo)mirna與發(fā)夾探針形成dna/rna的雜交雙鏈中的有標(biāo)記的發(fā)夾探針，發(fā)夾探針被dsn酶裂解成成千上萬(wàn)的探針?lè)肿訌亩剐盘?hào)放大。解決高成本、靈敏性檢測(cè)低問(wèn)題。另一方面，電化學(xué)方法（方波伏安法）檢測(cè)信號(hào)具有響應(yīng)速度快、儀器成本低、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)勢(shì)也可以很好地解決上述問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是昂貴的實(shí)驗(yàn)室工作和使用顯微鏡和電腦芯片來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，而且檢測(cè)靈敏性低。

一種紙基靈敏檢測(cè)mirna的方法，其特征是包括以下步驟：

（1）制備所需要的試劑

焦炭酸二乙酯處理水成分是1l無(wú)菌水、1000μl焦炭酸二乙酯，經(jīng)搖床過(guò)夜、次日高溫高壓滅菌30min得到；生長(zhǎng)溶液是由667μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯金酸、1000μl焦炭酸二乙酯處理水、0.0139g鹽酸羥胺組成；400ml探針dna緩沖溶液成分是1.0412g4-羥乙基哌嗪乙磺酸、24.5g高氯酸鈉，經(jīng)焦炭酸二乙酯處理水稀釋?zhuān)瑵恹}酸調(diào)節(jié)ph到7得到；

（2）納米金修飾紙芯片

將納米金溶液滴加至紙芯片的工作區(qū)域，待其自然干燥后，重復(fù)滴加兩次，將生長(zhǎng)溶液滴加至紙芯片的工作區(qū)域，待其自然干燥后，重復(fù)滴加兩次；

（3）巰基和納米金形成金-硫鍵

紙芯片上滴加5μl10nm用亞甲基藍(lán)標(biāo)簽標(biāo)記巰基修飾的dna發(fā)夾探針sh-cp-21，在黑暗環(huán)境下室溫放置2h，然后用20μl一倍的磷酸鹽緩沖鹽水洗，自然晾干；

（4）巰基乙醇的表面阻擋

紙芯片上滴加8μl巰基己醇自然晾干，最后用20μl一倍的磷酸鹽緩沖鹽水洗，自然晾干；

（5）放大和復(fù)用過(guò)程

取一定量的50fm目標(biāo)分子mirna-21、特異性雙鏈核酸酶和特異性雙鏈核酸酶緩沖液，使總體積為7μl，攪拌離心混勻后滴加至紙芯片工作區(qū)域，孵育2h；

（6）檢測(cè)過(guò)程

將紙芯片置于適量探針dna緩沖溶液中，用方波伏安法檢測(cè)；方波伏安法檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：初始電壓為-0.5v、終止電壓為0.5v、電位增量為0.004v、振幅為0.025v、頻率為25赫茲、靜置時(shí)間為2s。

本發(fā)明的有益效果

（1）可實(shí)現(xiàn)個(gè)性化基因診斷和疾病精準(zhǔn)預(yù)防；

（2）可以在飛摩爾范圍內(nèi)直接檢測(cè)mirna，比傳統(tǒng)的雜交試驗(yàn)的靈敏度高五個(gè)數(shù)量級(jí)；

（3）由于紙的內(nèi)部立體結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部纖維縱橫交錯(cuò)，生長(zhǎng)的金納米可以從上到下布滿(mǎn)整條紙纖維，這樣可以大大地增加比表面積，同時(shí)能夠改善其導(dǎo)電性及生物相容性，進(jìn)而大大提高電極的性能。紙纖維的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)和大的比表面積，為mirna雙特異性酶信號(hào)放大提供了廣闊的空間和平臺(tái)，更有利于雙鏈特異性核酸酶的信號(hào)放大；

（4）本發(fā)明所述方法檢測(cè)成本低、靈敏度高、時(shí)間短、檢測(cè)便捷。

附圖說(shuō)明

圖1為本文所述方法的實(shí)驗(yàn)原理圖。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例和附圖進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施。

實(shí)施例1

一種紙基靈敏檢測(cè)mirna的方法，其特征是包括以下步驟：

（1）制備所需要的試劑

焦炭酸二乙酯處理水成分是1l無(wú)菌水、1000μl焦炭酸二乙酯，經(jīng)搖床過(guò)夜、次日高溫高壓滅菌30min得到；生長(zhǎng)溶液是由667μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯金酸、1000μl焦炭酸二乙酯處理水、0.0139g鹽酸羥胺組成；400ml探針dna緩沖溶液成分是1.0412g4-羥乙基哌嗪乙磺酸、24.5g高氯酸鈉，經(jīng)焦炭酸二乙酯處理水稀釋?zhuān)瑵恹}酸調(diào)節(jié)ph到7得到；

（2）納米金修飾紙芯片

將納米金溶液滴加至紙芯片的工作區(qū)域，待其自然干燥后，重復(fù)滴加兩次，將生長(zhǎng)溶液滴加至紙芯片的工作區(qū)域，待其自然干燥后，重復(fù)滴加兩次；

（3）巰基和納米金形成金-硫鍵

紙芯片上滴加5μl10nm用亞甲基藍(lán)標(biāo)簽標(biāo)記巰基修飾的dna發(fā)夾探針sh-cp-21，在黑暗環(huán)境下室溫放置2h，然后用20μl一倍的磷酸鹽緩沖鹽水洗，自然晾干；

（4）巰基乙醇的表面阻擋

紙芯片上滴加8μl巰基己醇自然晾干，最后用20μl一倍的磷酸鹽緩沖鹽水洗，自然晾干；

（5）放大和復(fù)用過(guò)程

取一定量的50fm目標(biāo)分子mirna-21、特異性雙鏈核酸酶和特異性雙鏈核酸酶緩沖液，使總體積為7μl，攪拌離心混勻后滴加至紙芯片工作區(qū)域，孵育2h；

（6）檢測(cè)過(guò)程

將紙芯片置于適量探針dna緩沖溶液中，用方波伏安法檢測(cè)；方波伏安法檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：初始電壓為-0.5v、終止電壓為0.5v、電位增量為0.004v、振幅為0.025v、頻率為25赫茲、靜置時(shí)間為2s、靈敏度為10^-6a/v。

實(shí)施例2

檢測(cè)步驟同例1，不同之處是：步驟（6）中檢測(cè)參數(shù)靈敏度為10^-5a/v。

sequencelisting

<110>濟(jì)南大學(xué)

<120>一種紙基靈敏檢測(cè)mirna的方法

<130>170409

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>38

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

ccgttctatcaacatcagtctgataagctatagaacgc38

<210>2

<211>22

<212>rna

<213>人工合成

<400>2

uagcuuaucagacugauguuga22