本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小腸3d類器官模型的構(gòu)建及其在bcrp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，由兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域及兩個(gè)細(xì)胞質(zhì)atp結(jié)合域組成，參與多種內(nèi)源和外源性底物的轉(zhuǎn)運(yùn)，例如膽固醇，肽，藥物，毒素，膽汁鹽，有機(jī)陰離子，核苷，鐵，氯離子以及固醇等。到目前為止，已知發(fā)現(xiàn)49種人的abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員，并分為七個(gè)亞家族(abc-a至abc-g)。其中p-糖蛋白(p-gp，abcb1)，mdr相關(guān)蛋白-1(mrp1，abcc1)和乳腺癌耐藥蛋白(bcrp，abcg2)與多藥耐藥現(xiàn)象密切相關(guān)，因此，abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被認(rèn)為是克服腫瘤耐藥治療的重要靶標(biāo)。

癌細(xì)胞的耐藥性是癌癥化療中的主要問題。耐藥的最主要機(jī)制是atp結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的成員以能量依賴的方式從細(xì)胞中泵出多種結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的抗癌藥物，例如蒽環(huán)霉素，長春花生物堿和紫杉烷，導(dǎo)致藥物在細(xì)胞內(nèi)的積累減少。bcrp是關(guān)鍵的多藥耐藥蛋白之一，顯著影響許多藥物，尤其是抗癌藥物的治療效果。因此，確定某一藥物或化合物是否為bcrp的底物，對該藥物的臨床使用和新藥的研發(fā)具有很重要的意義。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，bcrp可以外排米托蒽醌、甲氨蝶呤、黃酮吡醇、吉非替尼、伊馬替尼和喜樹堿類包括7-乙基-10-羥基喜樹堿(sn-38，伊立替康的活性代謝物)及拓?fù)涮婵?，減少細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，降低這類藥物的治療作用。一些證據(jù)表明，腸道中的bcrp是口服屬于bcrp底物的藥物如拓?fù)涮婵档纳锢枚群凸πУ闹饕獩Q定因素。此外，bcrp高表達(dá)于癌干細(xì)胞中，因此，抑制bcrp介導(dǎo)的藥物外排作用將有利于癌癥的治療。bcrp的小分子抑制劑可用于逆轉(zhuǎn)bcrp介導(dǎo)的耐藥性，改善口服給藥藥物的生物利用度和藥物的治療效果。目前研究顯示煙曲霉c、gf120918、雌激素如雌酮和17b-雌二醇、新生霉素、香豆霉素和羥基類黃酮如染料木素等一些化合物在體外可以逆轉(zhuǎn)bcrp介導(dǎo)的耐藥性。盡管研發(fā)bcrp的抑制劑已經(jīng)成為許多研究的主題，但是在體內(nèi)對bcrp的抑制劑逆轉(zhuǎn)藥物的耐藥性的研究相對較少，并且目前沒有特異性靶向bcrp的抑制劑應(yīng)用于臨床。因此，可應(yīng)用于臨床的高效的特異性bcrp抑制劑的研發(fā)成為極其重要的研究主題。

用于研究bcrp對藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)的模型主要有過表達(dá)bcrp的細(xì)胞株模型以及利用結(jié)腸癌細(xì)胞caco-2建立單細(xì)胞層轉(zhuǎn)運(yùn)模型。目前，部分研究者通過過表達(dá)bcrp得到mdck-bcrp和llc-pk1-bcrp細(xì)胞系用于研究bcrp介導(dǎo)的藥物跨膜運(yùn)輸，該模型需要構(gòu)建過表達(dá)載體，并且需要篩選穩(wěn)定的過表達(dá)細(xì)胞株，操作繁瑣。另外，應(yīng)用最為廣泛的研究bcrp底物跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的模型是利用人的結(jié)腸癌細(xì)胞系caco-2建立單細(xì)胞層轉(zhuǎn)運(yùn)模型，該模型是在碳酸聚酯膜的transwell上培養(yǎng)caco-2細(xì)胞，形成緊密連接的具有極性的單細(xì)胞層，用于研究bcrp底物的吸收和外排。盡管這一模型被認(rèn)為是體外研究bcrp對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的標(biāo)準(zhǔn)，但是仍然存在不足之處，首先caco-2是結(jié)腸癌細(xì)胞系，在形態(tài)和生理功能上與正常的腸上皮細(xì)胞差別較大；其次細(xì)胞的代數(shù)以及培養(yǎng)的條件對單層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型的穩(wěn)定性影響較大；最后caco-2需要21天培養(yǎng)周期才能形成緊密的單細(xì)胞層結(jié)構(gòu)，形成時(shí)間過久不利于bcrp底物和抑制劑的高通量篩選。因此，急需建立一種新型的用于體外研究bcrp介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

由于現(xiàn)有的bcrp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)模型存在各種不足，本發(fā)明直接利用培養(yǎng)小腸的3d類器官模型應(yīng)用于bcrp介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的研究。

本發(fā)明首次利用小鼠小腸的3d類器官應(yīng)用于bcrp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的研究，并且利用熒光酶標(biāo)儀對其底物hoechst33342的濃度進(jìn)行檢測。該方法操作簡便、檢測高效快速，可廣泛應(yīng)用于bcrp底物和抑制劑的體外篩選。

本發(fā)明提出了一種小腸3d類器官的培養(yǎng)方法，所述方法包括以下步驟：

(1)分離小腸隱窩：利用edta消化小鼠(如c57bl/6小鼠)小腸分離得到小腸隱窩；

(2)接種：用基質(zhì)膠混懸后接種于培養(yǎng)板中；

(3)培養(yǎng)：基質(zhì)膠凝固后加入含有生長因子的admem/f12完全培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)。

其中，所述步驟(1)中，所述edta的濃度0.5mm-5mm；優(yōu)選地，為2mm。

其中，所述步驟(1)中，所述消化時(shí)間為15-30分鐘；優(yōu)選地，為25分鐘。

其中，所述步驟(2)中，所述培養(yǎng)板可以但不限于是96孔板或24孔板；96孔板每孔接種基質(zhì)膠5μl，24孔板每孔接種基質(zhì)膠50μl。

其中，所述步驟(2)中，所述基質(zhì)膠為低生長因子，無酚紅基質(zhì)膠。

其中，所述步驟(2)中，所述基質(zhì)膠和小腸隱窩的用量關(guān)系為每微升(μl)基質(zhì)膠中含5-10個(gè)隱窩為宜。

其中，所述步驟(3)中，所述生長因子為respondin-1，m-noggin和m-egf三種細(xì)胞分化生長因子的組合。

其中，所述步驟(3)中，所述admem/f12完全培養(yǎng)基的組分和濃度為1mmn-乙酰，10mm谷氨酰胺，10mmhepes，1xb27，1xn2，和1xprimocin。

其中，所述步驟(3)中，所述admem/f12完全培養(yǎng)基中生長因子的總濃度為650ng/ml；優(yōu)選地，生長因子的濃度分別為500ng/mlrespondin-1，100ng/mlm-noggin和50ng/mlm-egf。

其中，所述步驟(3)中，所述基質(zhì)膠和admem/f12完全培養(yǎng)基的體積比1：20。

其中，所述步驟(3)中，所述培養(yǎng)的溫度為37℃。

其中，所述步驟(3)中，所述培養(yǎng)的時(shí)間為2-6天；優(yōu)選地，為4天。

其中，所述步驟(3)中，優(yōu)選地，每2天換一次培養(yǎng)基。

其中，所述步驟(3)中，所述培養(yǎng)的終點(diǎn)判斷的依據(jù)為小腸類器官形成明顯的三維密閉的球狀結(jié)構(gòu)，且形成新的隱窩結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明中，在小腸隱窩分化培養(yǎng)形成3d類器官的過程中，隱窩首先將其上部的開口迅速密封形成腔狀；隨后，經(jīng)歷持續(xù)的“出芽”過程，形成新的隱窩，體積并進(jìn)一步擴(kuò)大，形成封閉的中空三維球狀結(jié)構(gòu)。小腸3d類器官由上皮細(xì)胞、潘氏細(xì)胞以及干細(xì)胞等組成，其腔內(nèi)側(cè)模擬小腸絨毛結(jié)構(gòu)，表達(dá)bcrp蛋白；相應(yīng)的其外側(cè)相似于小腸的基底側(cè)。

本發(fā)明還提出了如上所述方法培養(yǎng)得到的小腸3d類器官，所述小腸3d類器官由上皮細(xì)胞、潘氏細(xì)胞以及干細(xì)胞等組成，其腔內(nèi)側(cè)模擬小腸絨毛結(jié)構(gòu)，表達(dá)bcrp蛋白；相應(yīng)的其外側(cè)可模擬小腸的基底側(cè)。

本發(fā)明還提出了用于培養(yǎng)上述小腸3d類器官的培養(yǎng)基，包括：1mmn-乙酰，10mm谷氨酰胺，10mmhepes，1xb27，1xn2，1xprimocin和650ng/ml生長因子，其余為水。

其中，所述生長因子為respondin-1，m-noggin和m-egf三種生長因子的組合。

優(yōu)選地，所述admem/f12完全培養(yǎng)基中生長因子的濃度分別為500ng/mlrespondin-1，100ng/mlm-noggin和50ng/mlm-egf。

即，優(yōu)選地，本發(fā)明所述用于培養(yǎng)上述小腸3d類器官的培養(yǎng)基，包括：1mmn-乙酰，10mm谷氨酰胺，10mmhepes，1xb27，1xn2，1xprimocin，500ng/mlrespondin-1，100ng/mlm-noggin和50ng/mlm-egf，其余為水。

本發(fā)明還提出了所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)上述小腸3d類器官中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了一種用于研究bcrp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)模型的構(gòu)建方法，利用小腸3d類器官研究bcrp介導(dǎo)底物如hoechst33342轉(zhuǎn)運(yùn)的方法，具體方法包括以下步驟：(1)對按上述方法培養(yǎng)得到小腸3d類器官中bcrpmrna表達(dá)水平進(jìn)行測定；(2)免疫組織化學(xué)方法檢測小腸3d類器官中bcrp蛋白的表達(dá)水平；(3)通過bcrp底物、bcrp抑制劑對小腸3d類器官進(jìn)行功能驗(yàn)證；即，將小腸3d類器官與bcrp經(jīng)典底物進(jìn)行共孵育，同時(shí)將小腸3d類器官與bcrp抑制劑進(jìn)行共孵育，通過測定底物的量來評(píng)價(jià)抑制劑的作用，進(jìn)而對小腸3d類器官進(jìn)行功能驗(yàn)證。

其中，所述步驟(1)中，所述方法包括：利用trizol提取小腸絨毛、隱窩以及培養(yǎng)的3d類器官中的總rna，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cdna。以合成的cdna為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcp檢測bcrp在小腸絨毛、隱窩以及培養(yǎng)的3d類器官中的mrna表達(dá)水平。定量pcr檢測bcrp的引物序列：正向5’-gaactccagagccgttaggac-3’和反向5’-cagaatagcattaaggccaggtt-3’。

其中，所述步驟(2)中，所述方法包括：小腸組織(絨毛、隱窩)以及小腸3d類器官常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片；組織切片經(jīng)過脫蠟、復(fù)水、抗原表位修復(fù)、滅內(nèi)源性過氧化物酶、封閉后依次孵育抗小鼠bcrp的抗體，hrp標(biāo)記羊抗兔二抗；最后dab顯色后封片拍照。

其中，所述步驟(3)中，所述bcrp底物包括hoechst33342、米托蒽醌、馬兜鈴酸i；優(yōu)選地，為hoechst33342。

其中，所述步驟(3)中，所述bcrp抑制劑包括ko143、yho-13177、yho-13351；優(yōu)選地，為ko143或yho-13177。

其中，所述步驟(3)中，所述bcrp底物的濃度為1-5μm；優(yōu)選地，為2.5μm。

其中，所述步驟(3)中，所述bcrp抑制劑的濃度為15μm～20μm；當(dāng)bcrp抑制劑為ko143時(shí)，其濃度為15μm；當(dāng)bcrp抑制劑為yho-13177時(shí)，其濃度為20μm。

其中，所述步驟(3)中，所述共孵育的時(shí)間為20～100min；優(yōu)選地，為40分鐘。

其中，所述步驟(3)中，采用pbs孵育的方法促使bcrp底物從小腸3d類器官中釋放；其中，所述pbs孵育的溫度為37℃；所述pbs孵育的時(shí)間為2-8小時(shí)，優(yōu)選地，為4小時(shí)。其中，釋放出的底物可通過離心的方式進(jìn)行收集，所述離心的條件可以但不限于200×g離心5分鐘。

其中，所述步驟(3)中，當(dāng)為hoechst33342時(shí)，所述bcrp底物的測定方法為，釋放出的底物離心后，取上清至96孔板中，在λex/λem＝355nm/460nm條件下，對底物進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測。

本發(fā)明中，(1)所述用于bcrp介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)模型的3d類器官培養(yǎng)的時(shí)間選擇為4天，或當(dāng)3d類器官形成明顯的三維密閉的球狀結(jié)構(gòu)，且形成新的隱窩結(jié)構(gòu)，形成的球狀中空的內(nèi)腔可以積累bcrp外排底物的收集，3d類器官具有構(gòu)建bcrp介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的物理結(jié)構(gòu)。(2)其次，3d類器官中bcrp的mrna表達(dá)水平和小腸絨毛以及隱窩中的水平一致時(shí)，說明體外培養(yǎng)形成的隱窩具有體內(nèi)bcrp表達(dá)的生理特征。(3)另外，bcrp蛋白表達(dá)分別位于小鼠小腸絨毛外側(cè)和小腸3d類器官腔內(nèi)側(cè)邊緣時(shí)，說明小腸3d類器官內(nèi)部的腔相當(dāng)于小鼠腸腔，說明3d類器官具有構(gòu)建bcrp介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的生理結(jié)構(gòu)。

在一具體實(shí)施方式中，所述一種用于研究bcrp介導(dǎo)的藥物的模型的構(gòu)建方法包括①按上述方法培養(yǎng)小腸3d類器官，②3d類器官與bcrp底物hoechst33342的共孵育；hoechst33342與bcrp抑制劑ko143或yho-13177和3d類器官的共孵育；③3d類器官中hoechst33342測定。

其中，所述步驟①中，小腸3d類器官的培養(yǎng)天數(shù)為4天。

其中，底物的hoechst33342的濃度為2.5μm；bcrp抑制劑ko143的濃度為15μm；yho-13177的濃度為20μm；所述孵育時(shí)間為20，40，60，80，100min；以5個(gè)時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，yho-13177的濃度為縱坐標(biāo)作圖，觀察bcrp抑制劑對ko143和yho-13177對hoechst33342在類器官中積累的影響。

其中，所述步驟③中，采用pbs37℃條件下孵育的方法促使bcrp底物hoechst33342從類器官中釋放，pbs的孵育時(shí)間為4小時(shí)。

bcrp表達(dá)于3d類器官的腔內(nèi)側(cè)，為一種外排的轉(zhuǎn)運(yùn)體，能夠?qū)⑵涞孜锶鏷oechst33342排到類器官的腔內(nèi)，使hoechst33342在腔內(nèi)積累。bcrp的抑制劑ko143和yho-13177能夠抑制bcrp對hoechst33342的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而減少hoechst33342在3d類器官中的積累。

本發(fā)明還提出了如上所述方法構(gòu)建得到的用于研究bcrp介導(dǎo)的藥物的模型。

本發(fā)明還提出了一種用于研究bcrp介導(dǎo)的藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)方法，所述方法包括：(1)按上述方法培養(yǎng)得到小腸3d類器官，(2)將bcrp與待測藥物進(jìn)行共孵育，將bcrp與抑制劑進(jìn)行共孵育，通過測定待測藥物的濃度，研究bcrp對藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。其中，各操作步驟參見上文內(nèi)容。

本發(fā)明還提出了一種促使bcrp底物從所述小腸3d類器官中釋放的方法，所述方法包括：向所述小腸3d類器官中加入pbs，進(jìn)行孵育，使得3d類器官破裂，釋放腔內(nèi)的bcrp底物。

其中，所述bcrp底物包括hoechst33342、米托蒽醌、馬兜鈴酸；優(yōu)選地，為hoechst33342。

其中，所述pbs孵育的溫度為37℃。

其中，所述pbs孵育的時(shí)間為2-8小時(shí)，優(yōu)選地，為4小時(shí)。

其中，優(yōu)選地，加入前對pbs進(jìn)行預(yù)熱。

其中，96孔板每孔加入100μl的pbs。

其中，釋放出的底物可通過離心的方式進(jìn)行收集，所述離心的條件可以但不限于200×g離心5分鐘；當(dāng)?shù)孜餅閔oechst33342時(shí)，取100μl的上清至96孔板中，在λex/λem＝355nm/460nm條件下進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測。

在一具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提出的促使hoechst33342從3d類器官中釋放的方法，包括：采用加入150μl預(yù)熱的pbs，在37℃的條件下孵育4個(gè)小時(shí)，使得3d類器官破裂釋放腔內(nèi)的hoechst33342，200×g離心5分鐘后取100μl的上清至96孔板中，在λex/λem＝355nm/460nm條件下進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測。

本發(fā)明還提出了一種檢測小腸絨毛、隱窩以及3d類器官中bcrpmrna水平的方法，所述方法包括：利用trizol提取小腸絨毛、隱窩以及培養(yǎng)的3d類器官中的總rna，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cdna；以合成的cdna為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcp檢測bcrp在小腸絨毛、隱窩以及培養(yǎng)的3d類器官中的表達(dá)水平。

其中，bcrp的引物序列：正向5’-gaactccagagccgttaggac-3’和反向5’-cagaatagcattaaggccaggtt-3’。

本發(fā)明還提出了一種免疫組織化學(xué)方法檢測bcrp蛋白表達(dá)水平的方法，所述方法包括：小腸組織和3d類器官常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片；組織切片經(jīng)過脫蠟、復(fù)水、抗原表位修復(fù)、滅內(nèi)源性過氧化物酶、封閉后依次孵育抗小鼠bcrp的抗體，hrp標(biāo)記抗小鼠的二抗；最后dab顯色后封片拍照。

其中，抗小鼠bcrp抗體的稀釋比例為1：100-1:1000；優(yōu)選地，為1:200。

其中，hrp標(biāo)記的羊抗兔二抗的稀釋比例為1：200-1:2000；優(yōu)選地，為1:1000。

本發(fā)明直接利用培養(yǎng)小腸的3d類器官模型應(yīng)用于bcrp介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的研究；首先從c57bl/6小鼠小腸消化分離出隱窩，混懸于基質(zhì)膠后接入細(xì)胞培養(yǎng)板中，利用含有respondin-1、m-noggin和m-egf細(xì)胞分化生長因子的admem/f12培養(yǎng)基促進(jìn)隱窩分化形成3d類器官；然后進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察，并檢測了bcrp在基因和蛋白表達(dá)水平以驗(yàn)證模型理論的可行性；最后采用共孵育的方法，使用bcrp的熒光底物hoechst33342及其抑制劑ko143或yho-13177研究bcrp在3d類器官中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的活性。本發(fā)明的有益效果在于：

(1)與caco-2單層細(xì)胞模型相比，小腸3d類器官是直接由小腸隱窩中的干細(xì)胞分化而成，在結(jié)構(gòu)和生理功能上更接近于小腸，能更好地模擬藥物在體內(nèi)的跨膜外排作用。

(2)caco-2單層細(xì)胞模型培養(yǎng)需要21天，而用于bcrp藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究的小腸3d類器官培養(yǎng)僅需4天，周期短，時(shí)間成本低。

(3)與mdck-bcrp和llc-pk1-bcrp等過表達(dá)bcrp細(xì)胞系相比，小腸3d類器官無需轉(zhuǎn)染和篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，模型建立更加簡便易行。

(4)使用pbs孵育促使hoechst33342從3d類器官中釋放，并且利用熒光酶標(biāo)儀對底物如hoechst33342的濃度進(jìn)行檢測，檢測限較低，且簡單、快速、高效。

(5)本發(fā)明首次構(gòu)建了小鼠小腸3d類器官研究bcrp介導(dǎo)的藥物跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的體外模型，該模型構(gòu)建方法操作簡便、檢測高效快速，可廣泛應(yīng)用于bcrp底物和抑制劑的體外篩選。

附圖說明

圖1分離的小腸隱窩培養(yǎng)分化形成3d類器官的過程。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，隱窩逐漸分化形成3d類器官，隨后隱窩中的干細(xì)胞開始分化“出芽”形成新的隱窩結(jié)構(gòu)。

圖2小鼠小腸絨毛、隱窩以及培養(yǎng)的3d類器官中bcrpmrna的表達(dá)；以及bcrp在不同培養(yǎng)天數(shù)的3d類器官中mrna表達(dá)水平。

圖3小鼠小腸3d類器官中bcrp蛋白水平檢測結(jié)果。箭頭所指為bcrp的表達(dá)位置，bcrp蛋白表達(dá)位于小鼠小腸絨毛外側(cè)和3d類器官囊腔內(nèi)側(cè)邊緣。

圖4bcrp底物hoechst33342的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖5bcrp的抑制劑ko143和yho-13177對hoechst33342跨3d類器官轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。ko143和yho-13177能夠明顯抑制bcrp對hoechst33342向3d類器官囊腔內(nèi)側(cè)的外排作用，減少hoechst33342在3d類器官囊腔內(nèi)的積累。

具體實(shí)施方式

結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

實(shí)施例1小鼠小腸隱窩的分離以及小腸3d類器官的培養(yǎng)

(1)6-8周齡c57bl/6小鼠頸椎脫臼處死后，取出小腸放入預(yù)冷的pbs中。

(2)用鑷子小心去除腸系膜脂肪組織后，從中間剪開，用預(yù)冷的pbs洗凈腸內(nèi)容物，轉(zhuǎn)移至無菌含預(yù)冷pbs的50ml離心管中，置于冰上。

(3)在生物安全柜中，用含有青霉素/鏈霉素(p/s)的預(yù)冷的pbs清洗3-4次，小腸轉(zhuǎn)移至25ml含有2mmedta的pbs中，于4℃冰箱消化25分鐘。

(4)將消化好的小腸轉(zhuǎn)移至含有25ml預(yù)冷pbs的50ml離心管中，搖晃50下左右，收集懸液。

(5)重復(fù)上一步驟，將懸液用70μm的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾到50ml的離心管中，并加入2ml的10％的bsa，于4℃，200g離心5分鐘。

(6)小心棄去上清，沉淀重懸于2ml的admem/f12培養(yǎng)基中；取5μl重懸液在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

(7)根據(jù)所需隱窩的數(shù)量，取重懸液于1.5ml的離心管中，加入終濃度為1％的bsa，4℃，200g離心5分鐘。

(8)小心棄去上清，取所需體積的基質(zhì)膠重懸沉淀，用槍頭小心充分混勻后5μl/孔接入37℃預(yù)熱的96孔板中；置于37℃培養(yǎng)箱中10分鐘，使基質(zhì)膠凝固。

(9)加入100μl/孔含有500ng/mlrespondin-1，100ng/mlm-noggin和50ng/mlm-egf的admem/f12完全培養(yǎng)基，5％co2，37℃培養(yǎng)；每2天更換一次完全培養(yǎng)基。

實(shí)施例2小腸3d類器官形態(tài)學(xué)的觀察

利用olympusdp71倒置顯微鏡觀察并拍攝培養(yǎng)1、2、3、4、5和6天3d類器官形成的過程，結(jié)果如圖1顯示，分離的隱窩隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸分化成3d類器官，并且隱窩中的干細(xì)胞開始分化“出芽”形成新的隱窩結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例3bcrpmrna水平檢測

(1)小腸絨毛的分離：按照實(shí)施例1中分離隱窩的方法，在步驟5后，收集70μm細(xì)胞篩網(wǎng)內(nèi)的小腸絨毛。

(2)小腸隱窩的分離：按照實(shí)施例1中分離的方法獲取得到小鼠小腸隱窩。

(3)3d類器官的獲?。盒∧c隱窩分離培養(yǎng)4天后形成3d類器官，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的pbs洗2遍，然后用1ml移液槍頭破碎基質(zhì)膠，并用pbs將其轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，4℃，200g離心5分鐘，棄上清，沉淀為3d類器官。

(4)mrna的提取及逆轉(zhuǎn)錄：利用trizol提取小腸絨毛、隱窩以及培養(yǎng)的3d類器官中的總rna，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cdna。

(5)利用cdna為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcp分析bcrp在小腸絨毛、隱窩以及培養(yǎng)的3d類器官中的表達(dá)水平。

實(shí)施例4免疫組織化學(xué)方法檢測bcrp蛋白的表達(dá)水平

(1)小腸組織的固定：頸椎脫臼法處死小鼠，取出小腸后縱向剪開，用預(yù)冷的pbs洗凈小腸內(nèi)容物，用鑷子卷起后用針頭固定，放入4％的多聚甲醛中固定過夜。

(2)3d類器官的固定：小腸隱窩分離培養(yǎng)4天后形成3d類器官，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的pbs洗2遍，然后用1ml移液槍頭破碎基質(zhì)膠，并用pbs將其轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，4℃，200g離心5分鐘，棄上清，沉淀重懸于4％的多聚甲醛中固定過夜。

(3)沖洗：為了洗去固定液，小腸組織用自來水沖洗一天；3d類器官用pbs洗3次，每次15分鐘。

(4)脫水：小腸組織和3d類器官依次浸入50％、75％、85％、95％、100％ⅰ、100％ⅱ乙醇中1小時(shí)。

(5)透明：小腸組織和3d類器官依次浸入二甲苯：無水乙醇(1:1,v/v)20分鐘；二甲苯i和二甲苯ii各15分鐘。

(6)浸蠟：將小腸組織和3d類器官浸入蠟i1小時(shí)，蠟ii1小時(shí)，蠟ⅲ2小時(shí)。

(7)包埋：利用組織包埋機(jī)包埋小腸組織和3d類器官。

(8)切片：將蠟塊固定在組織切片機(jī)上，石蠟切片的厚度為5μm。

(9)免疫組織化學(xué)染色：

①脫蠟：將石蠟切片依次放入100％二甲苯ⅰ、100％二甲苯ⅱ中各10min，再放入二甲苯與乙醇1:1混合液中5min，進(jìn)行脫蠟。

②復(fù)水：切片依次浸入100％乙醇ⅰ10分鐘、100％乙醇ⅱ10分鐘、95％乙醇5分鐘、85％乙醇5分鐘、75％乙醇5分鐘、50％乙醇5分鐘。

③蒸餾水洗：復(fù)水后的切片放入蒸餾水中洗5分鐘。

④抗原表位修復(fù)：枸椽酸鹽緩沖液(ph6.0)于微波爐中加熱至沸騰，將切片浸于沸騰的緩沖液中，70℃烘箱保溫10分鐘，自然冷卻至室溫。

⑤pbs洗3次，每次5分鐘。

⑥滅活內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入3％h2o210分鐘滅活內(nèi)源性過氧化物酶。

⑦pbs洗3次，每次5分鐘。

⑧封閉：加入含2％的山羊血清的pbs37℃下封閉2小時(shí)。

⑨一抗孵育：切片甩干后加入封閉液稀釋的bcrp抗體(1:500)，4℃孵育過夜。

⑩pbs洗3次，每次5分鐘。

二抗孵育：加入封閉液稀釋的hrp-羊抗兔(1:1000)，室溫反應(yīng)2小時(shí)。

pbs洗3次，每次5分鐘。

dab顯色：將混勻的dab顯色液加在切片上，顯色10分鐘，流水沖洗去dab顯色液。

蘇木精染色：用蘇木精染色5分鐘，自來水沖洗2-3次之后再用75％酒精(含1％鹽酸)分色20秒。

蒸餾水洗3次，每次5分鐘。

涼干：將切片置于室溫中自然涼干。

透明：二甲苯透明10分鐘。

中性樹膠封片后放入70℃烘箱內(nèi)烘干。

鏡檢：切片置于配備有l(wèi)eicadfc310fx拍照系統(tǒng)的leicadm4000bled顯微鏡下觀察，并進(jìn)行拍攝照片。結(jié)果如圖3所示，bcrp蛋白表達(dá)分別位于小鼠小腸絨毛外側(cè)和小腸3d類器官腔內(nèi)側(cè)邊緣。結(jié)果說明小腸3d類器官內(nèi)部的腔相當(dāng)于小鼠小腸的腔。

實(shí)施例53d類器官中bcrp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究

(1)用pbs梯度稀釋hoechst33342，濃度分別為312.5nm，156.25nm，78.125nm，39.062nm，19.531nm，9.766nm，4.883nm；加入96孔板，每孔100μl，每個(gè)濃度3個(gè)平行。利用熒光酶標(biāo)儀fluostaroptima，在λex/λem＝355nm/460nm條件下進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測。以hoechst33342的濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，并利進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如圖4所示，相關(guān)系數(shù)r²>0.99，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸線性很好。

(2)按照實(shí)施例1描述的方法，在96孔板中培養(yǎng)所需的由小腸隱窩分化而成的3d類器官。

(3)3d類器官培養(yǎng)至4天，用1ml的移液器槍頭小心破碎基質(zhì)膠，然后將3d類器官轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中，4℃，200g離心3分鐘。

(4)棄去上清，用預(yù)冷的1mlpbs重懸沉淀，在冰上靜置10分鐘以融化基質(zhì)膠。

(5)4℃，200g離心3分鐘，棄上清，加入所需體積的培養(yǎng)基重懸。

(6)將3d類器官接入96孔板中，每孔體積為50μl，然后置于顯微鏡下計(jì)數(shù)。

(7)在避光的條件下，對照組加入只含有hoechst33342的50μl培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含ko143或yho-13177與hoechst33342的50μl培養(yǎng)基。

(8)37℃培養(yǎng)箱孵育20、40、60、80、100分鐘，用預(yù)冷的pbs將3d類器官轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，用預(yù)冷的pbs洗3遍，4℃，200g離心3分鐘。

(9)加入150μlpbs37℃培養(yǎng)箱孵育4小時(shí)。

(10)4小時(shí)后，3d類器官破裂，囊腔中的hoechst33342釋放到pbs中，4℃，200g離心3分鐘，取100μl上清加入96孔板中，在λex/λem＝355nm/460nm條件下檢測熒光強(qiáng)度。

(11)利用hoechst33342標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸的方程計(jì)算樣品中的hoechst33342的濃度，并用3d類器官的個(gè)數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)，以消除每孔類器官個(gè)數(shù)差異帶來的濃度差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，bcrp的抑制劑ko143和yho-13177能夠明顯抑制bcrp對hoechst33342的外排作用，最終導(dǎo)致3d類器官中的hoechst33342積累降低。因此，bcrp抑制劑可以明顯抑制3d類器官內(nèi)hoechst33342的積累，說明3d類器官用于bcrp介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)模型建立成功。

本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以上實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。