本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及pcr技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種用于高gc片段擴增的pcr反應(yīng)體系及試劑盒。

背景技術(shù)：

聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction，pcr)是一種用于放大擴增特定的dna片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊dna復(fù)制，pcr的最大特點，是能將微量的dna大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的dna，就能用pcr加以放大，進行比對。這也是"微量證據(jù)"的威力之所在。由1983年美國mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡易dna擴增法，意味著pcr技術(shù)的真正誕生。到如今2013年，pcr已發(fā)展到第三代技術(shù)。

pcr是利用dna在體外攝氏高溫(通常是95℃)時變性會變成單鏈，低溫(經(jīng)常是60℃左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至dna聚合酶最適反應(yīng)溫度(72℃左右)，dna聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的pcr儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

由于dna分子中，堿基a和t之間形成2對氫鍵，而堿基g和c之間形成3對氫鍵，因此打開堿基g和c之間的鏈接需要的能量相對較高，也就導(dǎo)致高gc含量的模板在進行變性時所需的能量更高，變性困難；并且模板中容易形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)妨礙dna聚合酶在模板上進行dna合成而導(dǎo)致擴增失敗。因此通常pcr技術(shù)難以擴增gc含量＞80％以上的dna片段。

研究人員也嘗試了許多方法提高高gc含量核酸的特異性擴增效率，如熱啟動和兩步pcr等，然而這些方法只針對某些特性靶基因擴增有一定的效果，并不具有普適性。

除此之外，也有人開始對pcr反應(yīng)的添加劑進行研究，很多文獻有報道，在pcr擴增體系中加入水溶性亞砜、酰胺類化合物、季銨鹽、甜菜堿、海藻糖、甘油、聚乙二醇等添加劑，以及這些添加劑的組合使用，使得gc含量70％的某些dna片段得以擴增。

例如，中國專利申請cn200810167573公開了一種擴增高gc含量片段的pcr專用混合液及其應(yīng)用，所述混合液為2×gc-richmastermix，其特征在于：該混合液含有40mmtris-hclph8.0，40mmkcl，3mmmgcl2，1-20％甘油，1-2％tween-20，1mmdntp，0.1utaqdna聚合酶，0.02upfudna聚合酶，0.1-1m甜菜堿和0.1-1m脯氨酸。該混合液能獲得保真度較高的dna并能對一些有特殊結(jié)構(gòu)如gc含量高(60％<gc％<74.8％)，有二級結(jié)構(gòu)模板等進行很好地擴增。

然而，在面對gc含量高達80％以上，甚至是86％以上的dna片段時，上述混合液仍無法完成pcr擴增；另外，通常pcr反應(yīng)結(jié)束后，還會對pcr產(chǎn)物進行后續(xù)操作，上述混合液引入大量pcr反應(yīng)體系的非必須添加劑(如tween-20、脯氨酸等)，這些物質(zhì)如果不能去除完全，往往會影響后續(xù)的酶切等操作，加大了后續(xù)純化工作難度，同時也給后續(xù)實驗操作帶來風(fēng)險。

除此之外，研究表明：7-deaza-dgtp是dgtp的結(jié)構(gòu)類似物，但和c只形成雙鍵，因此可以用來擴增gc含量高達80％的dna片段。

中例如，國專利申請cn201410120471公開了一種用于高gc含量基因的pcr擴增添加劑組合物及高gc含量基因的pcr擴增方法。其中，擴增添加劑選自7-deaza-dgtp、甜菜堿或甜菜堿類似物、dmso、甘油、甲酰胺和聚乙二醇中的2種或2種以上的組合。

上述方法能夠擴增出gc含量80％的dna片段，然而對于gc含量大于80％的dna片段并不能成功擴增。另外由于7-deaza-dgtp的價格十分昂貴，上述方法的使用成本非常高，因此上述方法的普遍適用性和市場前景均相對不好。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于高gc含量dna片段擴增的pcr反應(yīng)體系和試劑盒，能夠擴增gc含量高達90％的dna片段，并且使用成本遠低于使用7-deaza-dgtp進行pcr擴增的方法。

一個方面，本發(fā)明提供了一種用于高gc含量dna片段擴增的pcr反應(yīng)體系，所述的pcr反應(yīng)體系包括：dntps、tris-hcl、mgso4、(nh4)2so4和pcr助劑。

所述的pcr反應(yīng)體系中的pcr助劑為becl2、二甲基亞砜(dmso)、甜菜堿和二硫蘇糖醇(dtt)中的一種或多種。

所述的pcr反應(yīng)體系中還可以包括kcl和mgcl2中的一種或兩種。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的pcr反應(yīng)體系中的pcr助劑為becl2、dmso和dtt。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的pcr反應(yīng)體系中的pcr助劑為becl2、dmso、甜菜堿和dtt。

所述的pcr反應(yīng)體系中的dntps的終濃度為200～600μm，優(yōu)選為300～500μm，進一步優(yōu)選360μm。

所述的pcr反應(yīng)體系中的tris-hcl的ph值為8.7；tris-hcl的終濃度為10～100mm，優(yōu)選40～100mm，進一步優(yōu)選45～60mm。

所述的pcr反應(yīng)體系中的mgso4的終濃度為2.5～7mm，優(yōu)選3～5mm，進一步優(yōu)選5mm。

所述的pcr反應(yīng)體系中的(nh4)2so4的終濃度為10～20mm，優(yōu)選15～20mm，進一步優(yōu)選18mm。

所述的pcr反應(yīng)體系中的becl2的終濃度為10～50mm，優(yōu)選20～40mm，進一步優(yōu)選25mm。

所述的pcr反應(yīng)體系中的kcl的終濃度為10～50mm，優(yōu)選20～40mm，進一步優(yōu)選25mm。

所述的pcr反應(yīng)體系中的mgcl2的終濃度為10～50mm，優(yōu)選20～40mm，進一步優(yōu)選25mm。

所述的pcr反應(yīng)體系中的dmso的終濃度為2～10％，優(yōu)選為3～8％，進一步優(yōu)選為5％。

所述的pcr反應(yīng)體系中的甜菜堿的終濃度為36～72mm，優(yōu)選為47～61mm，進一步優(yōu)選為54mm。

所述的pcr反應(yīng)體系中的dtt的終濃度為0.86～1.69mm，優(yōu)選為1.04～1.50mm，進一步優(yōu)選為1.34mm。

本發(fā)明中所述的dmso的濃度百分數(shù)為體積百分數(shù)。

另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于高gc含量dna片段擴增的pcr試劑盒，所述的pcr試劑盒包括：(1)dntps、(2)ph8.7的tris-hcl、(3)mgso4、(4)(nh4)2so4和(5)pcr助劑。

所述的pcr試劑盒中的pcr助劑為becl2、二甲基亞砜(dmso)、甜菜堿和二硫蘇糖醇(dtt)中的一種或多種。

所述的pcr試劑盒中還可以包括kcl和mgcl2中的一種或兩種。

在一個優(yōu)選地實施方案中，所述的pcr試劑盒中的pcr助劑為becl2。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的pcr試劑盒中的pcr助劑為becl2、dmso、甜菜堿和dtt。

所述的pcr試劑盒還包括dna聚合酶。

再一個方面，本發(fā)明提供了一種用于高gc含量dna片段擴增的pcr混合試劑，所述的pcr混合試劑包括：dntps、ph8.7的tris-hcl、mgso4、(nh4)2so4和pcr助劑。

所述的pcr混合試劑中的pcr助劑為becl2、kcl、mgcl2、二甲基亞砜(dmso)、甜菜堿和二硫蘇糖醇(dtt)中的一種或多種。

所述的pcr混合試劑中還可以包括kcl和mgcl2中的一種或兩種。

在一個優(yōu)選地實施方案中，所述的pcr混合試劑中的pcr助劑為becl2。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的pcr混合試劑中的pcr助劑為becl2、dmso、甜菜堿和dtt。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明提供的pcr反應(yīng)體系和pcr試劑盒中的非pcr反應(yīng)必須成分相對有現(xiàn)有技術(shù)更少，使得后續(xù)的純化更為方便，對后續(xù)pcr產(chǎn)物的酶切等反應(yīng)引入的影響因素更少。

(2)本發(fā)明提供的pcr反應(yīng)體系和pcr試劑盒與7-deaza-dgtp擴增高片段的方法相比，大大降低了成本。7-deaza-dgtp價格十分昂貴，本發(fā)明中并沒有價格昂貴的成分。

(3)本發(fā)明改變了傳統(tǒng)的pcr擴增體系，創(chuàng)新性地采用becl2替代常規(guī)pcr擴增體系中的kcl或mgcl2，由此提供的擴增體系非常適用于擴增高gc含量dna片段，與現(xiàn)有的擴增高gc含量的方法相比，本發(fā)明可擴增gc含量更高的dna片段，本發(fā)明可擴增高達80％以上的gc含量的dna片段，甚至能夠擴增gc含量高達90％的dna片段。

附圖說明

圖1為實施例2中的pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2為實施例3中的pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3為實施例4中的pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖4為實施例5中的pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖5為對比例1中的pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖6為對比例2中的pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖7為對比例3中的pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖8為對比例4中的pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖9為對比例5中的pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖10為對比例6中的pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖11為對比實驗1中的pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖12為實驗例1中be²⁺可以嵌入gc三鍵的示意圖。

具體實施方式

以下實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。對所公開的實施例的下述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例中，而是可以應(yīng)用于符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的更寬的范圍。

除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。

以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)試驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行；所述試劑盒生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1一種用于高gc含量dna片段擴增的pcr試劑盒

所述的pcr試劑盒包括：

(1)dntps、(2)ph8.7的tris-hcl、(3)mgso4、(4)(nh4)2so4、(5)becl2、(6)dmso、(7)甜菜堿、(8)dtt和(9)dna聚合酶。

實施例2一種用于高gc含量dna片段擴增的pcr反應(yīng)體系及其應(yīng)用

以insr基因(ncbi編號為ah002851.2)作為目的擴增片段并設(shè)計相應(yīng)的pcr引物，目標擴增產(chǎn)物的核酸序列為：

cgcggcccccagcgcctcttgggtggccgcctcggagcatgacccccgcgggccagcgccgcgcgctctgatccgaggagaccccgcgctcccgcagccatgggcaccgggggccggcggggagcggcggccgcgccgctgctggtggcggtggccgcgctgctactgggcgccgcgggc

目的擴增產(chǎn)物的片段長度為180bp，片段的gc含量為82.8％。

(1)pcr引物為：

上游引物：5’-cgcggcccccagcgcctctt-3’

下游引物：5’-gcccgcggcgcccagtagca-3’。

(2)pcr模板為：擴增樣本為人全血。

(3)pcr反應(yīng)體系為：

上述試劑添加至pcr管后，加入taqdna聚合酶后，補齊至50μl體系。

(4)按以下pcr程序進行pcr反應(yīng)：

95℃，10min；

95℃，15sec；62℃，15sec；72℃，30sec；40個循環(huán)；

72℃，45sec。

(5)對pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖1所示，其中1和2號泳道為本實施例的擴增產(chǎn)物，可明顯看出，采用本實施例的擴增體系能夠擴增獲得gc含量高達82.8％的目的dna片段。

實施例3一種用于高gc含量dna片段擴增的pcr反應(yīng)體系及其應(yīng)用

目的擴增片段：同實施例2。

(1)pcr引物：同實施例2。

(2)pcr模板：同實施例2。

(3)pcr反應(yīng)體系：

上述試劑添加至pcr管后，加入taqdna聚合酶后，補齊至50μl體系。

(4)按以下pcr程序進行pcr反應(yīng)：

95℃，10min；

95℃，15sec；62℃，15sec；72℃，30sec；40個循環(huán)；

72℃，45sec。

(5)對pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖2所示，其中3和4號泳道為本實施例的擴增產(chǎn)物，可明顯看出，采用本實施例的擴增體系能夠擴增獲得gc含量高達82.8％的目的dna片段。

實施例4一種用于高gc含量dna片段擴增的pcr反應(yīng)體系及其應(yīng)用

目的擴增片段：同實施例2。

(1)pcr引物：同實施例2。

(2)pcr模板：同實施例2。

(3)pcr反應(yīng)體系：

上述試劑添加至pcr管后，加入taqdna聚合酶后，補齊至50μl體系。

(4)按以下pcr程序進行pcr反應(yīng)：

95℃，10min；

95℃，15sec；62℃，15sec；72℃，30sec；40個循環(huán)；

72℃，45sec。

(5)對pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。對pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖3所示，其中5和6號泳道為本實施例的擴增產(chǎn)物，可明顯看出，采用本實施例的擴增體系能夠擴增獲得gc含量高達82.8％的目的dna片段。

實施例5一種pcr反應(yīng)體系及其應(yīng)用

目的擴增片段：同實施例2。

(1)pcr引物：同實施例2。

(2)pcr模板：同實施例2。

(3)pcr反應(yīng)體系：

除了kcl用替換becl2以外，其余同實施例2。

(4)pcr程序：同實施例2。

(5)對pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖4所示，其中7和8號泳道為本實施例的擴增產(chǎn)物，看不到目的條帶?？煽闯?，采用本實施例的擴增體系不能擴增目的dna片段。

實施例6一種用于高gc含量dna片段擴增的pcr試劑盒

所述的pcr試劑盒包括：

(1)dntps、(2)ph8.7的tris-hcl、(3)mgso4、(4)(nh4)2so4、(5)becl2。

實施例7一種用于高gc含量dna片段擴增的pcr混合試劑，

所述的pcr混合試劑包括：dntps、ph8.7的tris-hcl、mgso4、(nh4)2so4和becl2。

實施例8一種用于高gc含量dna片段擴增的pcr混合試劑，

所述的pcr混合試劑包括：dntps、ph8.7的tris-hcl、mgso4、(nh4)2so4、becl2、dmso、甜菜堿和dtt。

對比例1

目的擴增片段：同實施例2。

(1)pcr引物：同實施例2。

(2)pcr模板：同實施例2。

(3)pcr反應(yīng)體系：

除了不添加becl2以外，其余同實施例2。

(4)pcr程序：同實施例2。

(5)對pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖5所示：其中9和10號泳道為本對比例的擴增產(chǎn)物，由電泳結(jié)果可看出：本對比例擴增產(chǎn)物中看不到目的條帶，說明本對比例沒有擴增出目的片段。

對比例2

目的擴增片段：同實施例2。

(1)pcr引物：同實施例2。

(2)pcr模板：同實施例2。

(3)pcr反應(yīng)體系：

除了不添加dmso以外，其余同實施例2。

(4)pcr程序：同實施例2。

(5)對pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖6所示：其中泳道11和泳道12為本對比例的擴增產(chǎn)物。電泳結(jié)果顯示：本對比例擴增獲得目的dna片段條帶明顯暗于實施例2，說明本對比例擴增獲得的目的片段的產(chǎn)量明顯低于實施例2。

對比例3

目的擴增片段：同實施例2。

(1)pcr引物：同實施例2。

(2)pcr模板：同實施例2。

(3)pcr反應(yīng)體系：

除了將becl2的終濃度改為5mm以外，其余同實施例2。

(4)pcr程序：同實施例2。

(5)對pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖7所示：其中泳道13和泳道14為本對比例的擴增產(chǎn)物，本對比例擴增產(chǎn)物中看不到目的條帶。電泳結(jié)果表明：本對比例不能擴增獲得目的dna片段。

對比例4

目的擴增片段：同實施例2。

(1)pcr引物：同實施例2。

(2)pcr模板：同實施例2。

(3)pcr反應(yīng)體系：

除了將tris-hcl的ph值改為8.0以外，其余同實施例2。

(4)pcr程序：同實施例2。

(5)對pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖8所示：其中泳道15和泳道16為本對比例的擴增產(chǎn)物。電泳結(jié)果顯示：本對比例擴增獲得目的dna片段條帶明顯暗于實施例2，說明本對比例擴增獲得的目的片段的產(chǎn)量明顯低于實施例2。

對比例5

目的擴增片段：同實施例2。

(1)pcr引物：同實施例2。

(2)pcr模板：同實施例2。

(3)pcr反應(yīng)體系：

除了不添加甜菜堿以外，其余同實施例2。

(4)pcr程序：同實施例2。

(5)對pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖9所示：其中泳道17和泳道18為本對比例的擴增產(chǎn)物。電泳結(jié)果顯示：本對比例擴增獲得目的dna片段條帶明顯暗于實施例2，說明本對比例擴增獲得的目的片段的產(chǎn)量明顯低于實施例2。

對比例6

目的擴增片段：同實施例2。

(1)pcr引物：同實施例2。

(2)pcr模板：同實施例2。

(3)pcr反應(yīng)體系：

除了不添加dtt以外，其余同實施例2。

(4)pcr程序：同實施例2。

(5)對pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖10所示：其中泳道19和泳道20為本對比例的擴增產(chǎn)物。電泳結(jié)果顯示：本對比例擴增獲得目的dna片段條帶明顯暗于實施例2，說明本對比例擴增獲得的目的片段的產(chǎn)量明顯低于實施例2。

對比實驗1

將實施例2-5和對比例1-6的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖11所示，其中泳道1、3、5、7、9、11、13、15、17、19分別為實施例2-5和對比例1-6的擴增產(chǎn)物。實驗結(jié)果顯示實施例2-4提供的擴增體系擴增出的目的條帶最亮，說明其擴增出的目的序列含量最高，也就是其擴增效率最好；實施例5、對比例1、對比例3并未出現(xiàn)目的條帶，說明其不能擴增出目的序列，也就是說如果擴增體系中沒有becl2或者其濃度不在本發(fā)明所述的濃度范圍之內(nèi)，均無法擴增出高gc含量的dna片段；對比例2和對比例4-6也能顯示出目的片段，然而其亮度明顯低于實施例2，說明其擴增出的目的序列的量低于實施例2，說明其擴增效率明顯低于實施例2。

實驗例1機理試驗

對becl2和dna形成的混合物進行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)be²⁺可以嵌入gc三鍵，代替gc三鍵最中間的氫鍵，其示意圖如圖12所示。而對kcl和dna的混合物的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)k⁺并不能嵌入gc三鍵，這可能是由于k⁺半徑較大。

因此，本發(fā)明提供的pcr反應(yīng)體系或試劑盒能夠擴增高gc含量的dna片段可能是由于be²⁺嵌入gc三鍵，進而降低了打開gc三鍵所需的能量，使得gc三鍵容易打開，pcr反應(yīng)更加容易進行。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。