本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及病毒檢測領(lǐng)域，更具體涉及一種hbvcccdna的富集提取方法和檢測hbvcccdna的引物組、探針和方法。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,hbv)感染呈世界性流行，其感染者已超過二十億，是我國目前危害最嚴(yán)重的傳染病之一。2006年全國乙肝流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國目前仍有乙肝表面抗原攜帶者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬，乙肝和肝癌患者約占全球的四分之一。慢性hbv感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和原發(fā)性肝癌的主要原因，并且每年導(dǎo)致1百余萬人死亡，造成極大的社會危害。hbv為嗜肝dna病毒，是引起乙型病毒性肝炎(以下簡稱“乙肝”)的病原體。細胞外乙型肝炎病毒dna是一種松弛環(huán)狀的雙鏈dna(relaxedcirculardna，rcdna)分子，其兩條鏈均不是閉合的，其中負鏈較長，約3200個堿基，含有乙肝病毒基因組的全長基因，在其5’起始端與3’末端之間有一個數(shù)個堿基的“缺刻”(nick)；正鏈較短，有較大的“缺口”(gap)，其3’末端不固定，故長度是可變的，約為負鏈長度的50％～100％。在乙肝病毒的復(fù)制過程中，病毒dna進入宿主細胞核，在dna聚合酶的作用下，兩條鏈的缺口均被補齊，形成超螺旋的共價、閉合、環(huán)狀dna分子(covalentlyclosedcirculardna，cccdna)，作為乙肝病毒前基因組rna復(fù)制的原始模板，開始一系列的復(fù)制過程。雖然其含量較少，每個肝細胞內(nèi)只有約5～50個拷貝，但對乙肝病毒的復(fù)制以及感染狀態(tài)的建立具有十分重要的意義。hbv復(fù)制是一種保守的機制，在轉(zhuǎn)錄后模板cccdna仍然完整，并且可反復(fù)轉(zhuǎn)錄，所以cccdna是嗜肝病毒持續(xù)感染的關(guān)鍵因素。cccdna半衰期長，無法從體內(nèi)徹底清除，臨床中有很多經(jīng)過長期抗病毒治療完全應(yīng)答的患者，停止抗病毒治療后，又常發(fā)生hbv再激活和病情復(fù)發(fā)，主要原因cccdna的持續(xù)存在和難以清除。故cccdna是hbv復(fù)制的突出標(biāo)志，是評價hbv感染狀態(tài)及藥物療效最重要的指標(biāo)。只有清除了細胞核內(nèi)的cccdna，才能徹底消除乙肝患者病毒攜帶狀態(tài)，是抗病毒治療的目標(biāo)。上世紀(jì)80年代，有學(xué)者通過dna電泳和southern雜交技術(shù)，證實cccdna的存在(millerrh,robinsonws.hepatitisbvirusdnaformsinnuclearandcytoplasmicfractionsofinfectedhumanliver[j].virology,1984,137(2):390-399.)，但此方法操作繁瑣、靈敏度低、精確性差。上世紀(jì)90年代開始，pcr技術(shù)開始應(yīng)用于cccdna的檢測，建立了選擇性pcr檢測技術(shù)，并在此基礎(chǔ)上引入競爭pcr，實現(xiàn)初步定量(j,schlichthj.analysisoftheearlieststepsofhepadnavirusreplication:genomerepairafterinfectiousentryintohepatocytesdoesnotdependonviralpolymeraseactivity[j].journalofvirology,1993,67(8):4867-4874.；addisonwr,wongwws,fischerkp,etal.aquantitativecompetitivepcrassayforthecovalentlyclosedcircularformoftheduckhepatitisbvirus[j].antiviralresearch,2000,48(1):27-37.)，到本世紀(jì)初，建立了實時熒光定量pcr檢測cccdna的方法(heml,wuj,cheny,etal.anewandsensitivemethodforthequantificationofhbvcccdnabyreal-timepcr[j].biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2002,295(5):1102-1107.)，實現(xiàn)了真正意義上的定量。同時，也有其他技術(shù)方法應(yīng)用到了cccdna的檢測的報道，如侵入分析法、嵌合引物法、滾環(huán)擴增技術(shù)(rollingcircleamplication，rca)等(jun-bins,zhic,wei-qinn,etal.aquantitativemethodtodetecthbvcccdnabychimericprimerandreal-timepolymerasechainreaction[j].journalofvirologicalmethods,2003,112(1):45-52.；wongdkh,yuenmf,yuanhj,etal.quantitationofcovalentlyclosedcircularhepatitisbvirusdnainchronichepatitisbpatients[j].hepatology,2004,40(3):727-737.；zhongy,hus,xuc,etal.anovelmethodfordetectionofhbvcccdnainhepatocytesusingrollingcircleamplificationcombinedwithinsitupcr[j].bmcinfectiousdiseases,2014,14(1):1.；margeridons,carrouée-durantels,chemini,etal.rollingcircleamplification,apowerfultoolforgeneticandfunctionalstudiesofcompletehepatitisbvirusgenomesfromlow-levelinfectionsandfordirectlyprobingcovalentlyclosedcirculardna[j].antimicrobialagentsandchemotherapy,2008,52(9):3068-3073.)現(xiàn)有cccdna檢測技術(shù)主要面臨的問題是特異性和靈敏度，這也導(dǎo)致cccdna的相關(guān)研究結(jié)果存在很大的爭議。例如，采用相同或不同的技術(shù)，針對慢性乙肝患者外周血單核細胞或血清中cccdna的檢測都有截然不同的報道。對檢測技術(shù)本身的質(zhì)疑，給cccdna的相關(guān)研究造成了很大的困擾，也進一步阻礙了hbv治療藥物的研究。建立cccdna檢測技術(shù)的最大難點在于體內(nèi)有大量與cccdna序列同源性較高的其他形式的hbvdna存在，包括：①rcdna；②在5％～10％的病毒顆粒中存在的雙鏈線性dna分子(double-strandlineardna，dsl-dna)；③由前基因組rna逆轉(zhuǎn)錄形成dna(single-strandeddna，ssdna)。然而在細胞內(nèi)眾多形式的hbvdna中，cccdna僅占總量的極小一部分。選擇性熒光定量pcr技術(shù)具有極高的靈敏度，其檢測cccdna的原理是基于rcdna的正鏈和負鏈上均存在缺口，故可以設(shè)計跨越兩個缺口的引物，使rcdna不會被擴增，而cccdna由于是完整的雙鏈結(jié)構(gòu)則可以被選擇性擴增。對于dsl-dna或ssdna，由于兩條引物的方向相反，也不會被擴增。但是，在反應(yīng)體系中rcdna模板量較高時，以不完整的兩條鏈為模板形成的單鏈延伸產(chǎn)物之間可自身退火(self-annealing)而導(dǎo)致假陽性結(jié)果(zhangyy,zhangbh,theeled,etal.single-cellanalysisofcovalentlyclosedcirculardnacopynumbersinahepadnavirus-infectedliver[j].proceedingsofthenationalacademyofsciences,2003,100(21):12372-12377)。其他，如嵌合引物法和侵入分析法區(qū)分rcdna和cccdna的主要依據(jù)是rcdna的正鏈不完整，因而嵌合引物或初始探針不能與之互補結(jié)合。但是，dsl-dna分子用兩種方法均是可以被擴增的。rca只能擴增環(huán)狀dna模板，經(jīng)證實其能有效區(qū)分cccdna與rcdna，近年來比較多的學(xué)者用這一方法檢測cccdna，但這一方法耗時長(至少4h以上)且無法實現(xiàn)定量。為克服上述技術(shù)方法的缺陷，文獻報道中最常采用的方式是通過采取有效的措施降低其他形式hbvdna的含量，從而消除cccdna他們對cccdna檢測的影響。有報道稱當(dāng)hbvdna在107拷貝/ml(含)以下時，可以防止選擇性熒光定量pcr檢測出現(xiàn)假陽性。有學(xué)者根據(jù)cccdna的分布特點，cccdna僅位于細胞核內(nèi)，而其他幾種dna分子均位于細胞漿內(nèi)，采用細胞核分離技術(shù)，把細胞核分離出來進行cccdna檢測(宋培新,李軍.乙型肝炎病毒cccdna檢測方法及臨床應(yīng)用研究進展.國外醫(yī)學(xué)·流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊2005；32:350-355.)。另外，cccdna不能與蛋白結(jié)合，而其他三種dna均位于核衣殼蛋白中，且末端與p蛋白共價結(jié)合，易于與十二烷基硫酸鈉(sds)結(jié)合，加氯化鉀后即形成沉淀，通過離心可加以分離(kockj,theilmannl,gallep,etal.hepatitisbvirusnucleicacidsassociatedwithhumanperipheralbloodmononuclearcellsdonotoriginatefromreplicatingvirus.hepatology,1996；23:405-13.)。還有，cccdna不能被一些酶如綠豆核酸酶(mungbeannuclease，mbn)、不降解質(zhì)粒的atp依賴dna酶(plasmid-safeatp-dependentdnase,psad)等降解，而其他形式的dna可降解。上述處理方法中，酶處理是最為簡便有效的一種方式，psad酶處理是應(yīng)用最多的一種酶。但是在cccdna檢測中增加酶切步驟會使標(biāo)本稀釋，同時酶切反應(yīng)液中的成分也可能抑制pcr反應(yīng)，會增加假陰性結(jié)果，不利于微量樣本的檢測。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種hbvcccdna的富集提取方法以及用于檢測hbvcccdna的引物組、探針，并構(gòu)建了一種用于檢測hbvcccdna的方法，該方法具有高敏感性，可以檢測低濃度的樣本，最低檢測限為60拷貝/ml。術(shù)語：本發(fā)明中的“v/v”指體積-體積濃度單位；“w/v”指質(zhì)量-體積濃度。一個方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測hbvcccdna的檢測引物組和檢測探針。所述的檢測引物組為引物組1或引物組2。所述的引物組1由以下4條引物序列或以下4條引物序列的互補序列組成：引物1：其核苷酸序列如seqidno：1所示，5’-actccccgtctgtgccttct-3’；引物2：其核苷酸序列如seqidno：2所示，5’-ttctttatacgggtcaatgtcca-3’；引物3：其核苷酸序列如seqidno：3所示，5’-aggaggctgtaggcataaat-3’；引物4：其核苷酸序列如seqidno：4所示，5’-tcccgatacaaagcagag-3’。所述的引物組2由以下4條引物序列或以下4條引物序列的互補序列組成：引物5：其核苷酸序列如seqidno：5所示，5’-acgaccgaccttgaggcatacttc-3’；引物6：其核苷酸序列如seqidno：6所示，5’-attcatcaactcaccccaacacag-3’；引物7：其核苷酸序列如seqidno：7所示，5’-taggaggctgtaggcataaat-3’；引物8：其核苷酸序列如seqidno：8所示，5’-caaagcagaggcggtgtc-3’。所述的檢測探針的核苷酸序列為seqidno：9(5’-ctgttcaagcctccaagctg-3’)所示的核苷酸序列或其互補序列；所述的檢測探針的核苷酸序列的5’端標(biāo)記有熒光基團，所述的熒光基團為fam、hex、vic、cy5和tet中的一種；所述的檢測探針的3’端標(biāo)記有的淬滅基團，所述的淬滅基團為tamra、mgb和bhq中的一種。上述檢測引物組和檢測探針是根據(jù)hbvcccdna序列特點設(shè)計完成的，可用于實時熒光定量pcr(qpcr)技術(shù)，實現(xiàn)對hbvcccdna的檢測。另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測hbvcccdna的試劑盒，所述的試劑盒包括上述檢測引物組和檢測探針。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的試劑盒還包括內(nèi)控引物組和內(nèi)控探針，所述的內(nèi)控引物組和內(nèi)控探針作為陽性參照，用于對試劑盒的質(zhì)量控制，所述的內(nèi)控引物組包括下兩條引物：引物9：其核苷酸序列如seqidno：10所示，5’-cggggtcacccacactgtgcccatctacg-3’；引物10：其核苷酸序列如seqidno：11所示，5’-ggtcacccacactgtgcccatctacg-3’；所述的內(nèi)控探針的序列為seqidno：12(5’-atgccctcccccatgccatcct-3’)所示的核苷酸序列或其互補序列；所述的內(nèi)控探針的核苷酸序列的5’端標(biāo)記有熒光基團，所述的熒光基團為fam、hex、vic、cy5和tet中的一種；所述的內(nèi)控探針的3’端標(biāo)記有的淬滅基團，所述的淬滅基團為tamra、mgb和bhq中的一種，所述的內(nèi)控探針上的熒光基團應(yīng)不同于檢測探針上的熒光基團。再一個方面，本發(fā)明提供了一種hbvcccdna的富集提取方法，所述的富集提取方法包括以下步驟：(1)獲得待測樣本：將待測組織樣品切碎后，放入離心管中，向離心管中加入裂解液、蛋白酶k和磁珠，渦旋混勻后置于50～60℃振蕩孵育，孵育至肝組織完全溶解，即得到待測樣本；如果為血清樣本：則取血清樣本放入離心管中，向離心管中加入裂解液、蛋白酶k和磁珠，渦旋混勻后置于50～60℃振蕩孵育15分鐘，即得到待測樣本；(2)將步驟(1)得到的待測樣本轉(zhuǎn)移至磁力架上放置5-10分鐘收集磁珠，吸棄離心管中的上清液；(3)向步驟(2)得到的收集有磁珠的離心管中加入洗脫液1，渦旋混勻后，將離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置3-5分鐘收集磁珠，吸棄離心管中的上清液；(4)向步驟(3)得到的收集有磁珠的離心管中加入洗脫液2，旋混勻后，把離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置3-5分鐘收集磁珠，吸棄離心管中的上清液；(5)向步驟(4)得到的收集有磁珠的離心管中加入洗脫液2，旋混勻后，把離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置3-5分鐘收集磁珠，吸棄離心管中的上清液；(6)向步驟(5)得到的收集有磁珠的離心管中加入酶切處理液，渦旋混勻后，37℃孵育1h后，立即于70℃孵育30min；(7)短暫離心收集步驟(6)孵育后的離心管管壁上的液滴后，把離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置1分鐘，吸棄所有的殘液，打開離心管管蓋干燥5-10分鐘；(8)向步驟(7)得到的干燥后的離心管中加入洗脫液3，渦旋混勻后，靜置3-10分鐘，將離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置3-5分鐘收集磁珠，分離上清液；(9)把步驟(8)得到的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，保存于-20℃或直接用于加樣。所述的富集提取方法中的裂解液包括：異硫氰酸胍2m～6m、ph8.0的tris10mm、ph8.0的edta10mm、tritonx-1001％～10％(v/v)和sds1％～5％(w/v)，溶劑為無菌水。所述的富集提取方法中的洗脫液1包括：nacl0.5m～5m、ph8.0的tris100mm、ph8.0的edta1mm和無水乙醇40％(v/v)，溶劑為無菌水。所述的富集提取方法中的洗脫液2為體積濃度60％～80％的乙醇。所述的富集提取方法中的酶切處理液包括：10μl25mmatp、25μlreactionbuffer、30-60upsad酶，去離子水補加至250μl；所述的reactionbuffer包括：330mmph7.5的tris-acetate、660mm醋酸鉀、100mm醋酸鎂和5.0mmdtt，溶劑為無菌水。所述的富集提取方法中的的洗脫液3為滅菌ddh2o或te緩沖液。再一個方面，本發(fā)明提供了一種檢測乙型肝炎病毒(hbv)cccdna的pcr檢測方法，所述的pcr檢測方法包括以下步驟：(1)hbvcccdna的富集提取：即為上述一種hbvcccdna的富集提取方法，以獲得待測dna樣品；(2)pcr擴增：1)配制pcr反應(yīng)體系：pcr反應(yīng)體系，50μl體系：所述的pcr反應(yīng)液含有15～25mmtris-hcl(ph8.0)，15～25mmkcl，2.5～5mm(nh4)so4，2～5mmmgcl2，0.5～2mmdntp/utp，200～600nm檢測引物組，100～300nm檢測探針，200～600nm內(nèi)控引物組，100～300nm內(nèi)控探針；2)實時熒光定量pcr：實時熒光定量pcr程序為：第一步：37℃，5分鐘；第二步：95℃，10分鐘；第三步：95℃，15秒；62～68℃，15秒；72℃，20秒；5～15個循環(huán)；第四步：95℃，1秒；60℃，1分鐘；40個循環(huán)；60℃時采集熒光；(3)結(jié)果分析：采用含有已知濃度的hbvcccdna的質(zhì)粒作為定量參考品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算待測dna樣品中的hbvcccdna的濃度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：(1)本發(fā)明提供的hbvcccdna的富集提取方法，首創(chuàng)性地將磁珠提取法和psad酶處理法相結(jié)合，既降低了線性dna，又避免了酶處理過程對樣本的稀釋，同時利用磁珠的吸附提取作用富集cccdna，提高了檢測的特異性和靈敏度。(2)本發(fā)明提供的hbvcccdna的富集提取方法中提供的洗脫液能夠有效地去除反應(yīng)體系中的雜質(zhì)，使得cccdna的收率和純度大大提高。(3)本發(fā)明提供的用于檢測hbvcccdna的檢測引物組和檢測探針對于hbvcccdna擴增的特異性強，能夠有效地提高檢測準(zhǔn)確性。(4)本發(fā)明提供的hbvcccdna的pcr檢測方法，具有高敏感性，可以檢測低濃度的樣本，其最低檢測限為60拷貝/ml。(5)本發(fā)明提供的富集提取方法中的裂解液、洗脫液1、洗脫液2和酶切處理液為本發(fā)明自行研發(fā)配置，不同于常規(guī)試劑，使得hbvcccdna提取純度和效率比現(xiàn)有技術(shù)更高。附圖說明圖1為實施例5中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖2為實施例5中36例臨床血清樣本的擴增曲線。圖3為實施例6中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實施方式以下實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。對所公開的實施例的下述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例中，而是可以應(yīng)用于符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的更寬的范圍。除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。實施例1一種用于檢測hbvcccdna的檢測引物組和檢測探針檢測引物組由以下4條引物序列組成：引物1：其核苷酸序列如seqidno：1所示；引物2：其核苷酸序列如seqidno：2所示；引物3：其核苷酸序列如seqidno：3所示；引物4：其核苷酸序列如seqidno：4所示；檢測探針核苷酸序列為seqidno：9所示的核苷酸序列，檢測探針的核苷酸序列的5’端標(biāo)記有熒光基團fam，檢測探針的3’端標(biāo)記有的淬滅基團tamra。實施例2一種用于檢測hbvcccdna的檢測引物組和檢測探針檢測引物組由以下4條引物序列組成：引物5：其核苷酸序列如seqidno：5所示；引物6：其核苷酸序列如seqidno：6所示；引物7：其核苷酸序列如seqidno：7所示；引物8：其核苷酸序列如seqidno：8所示；檢測探針核苷酸序列為seqidno：9所示的核苷酸序列，檢測探針的核苷酸序列的5’端標(biāo)記有熒光基團fam，檢測探針的3’端標(biāo)記有的淬滅基團mgb。實施例3一種用于檢測hbvcccdna的試劑盒該試劑盒包括實施例1中的檢測引物組和檢測探針；還包括內(nèi)控引物組和內(nèi)控探針；內(nèi)控引物組包括下兩條引物：引物9：其核苷酸序列如seqidno：10所示；引物10：其核苷酸序列如seqidno：11所示；內(nèi)控探針的序列為seqidno：12所示的核苷酸序列，內(nèi)控探針的核苷酸序列的5’端標(biāo)記有熒光基團vic，內(nèi)控探針的3’端標(biāo)記有的淬滅基團tamra。實施例4一種用于檢測hbvcccdna的試劑盒該試劑盒包括實施例2中的檢測引物組和檢測探針；還包括內(nèi)控引物組和內(nèi)控探針；內(nèi)控引物組包括下兩條引物：引物9：其核苷酸序列如seqidno：10所示；引物10：其核苷酸序列如seqidno：11所示；內(nèi)控探針的序列為seqidno：12所示的核苷酸序列，內(nèi)控探針的核苷酸序列的5’端標(biāo)記有熒光基團hex，內(nèi)控探針的3’端標(biāo)記有的淬滅基團tamra。實施例5一種檢測乙型肝炎病毒(hbv)cccdna的pcr檢測方法及其應(yīng)用一、采用實施例3中的檢測試劑盒二、樣本來源36例hbv感染者血清樣本。三、檢測方法(1)hbvcccdna的富集提取：①獲得待測樣本：取200μl血清樣本，放入離心管中，向離心管中加入300μl裂解液、20μl蛋白酶k和20μl磁珠，渦旋混勻后置于50～60℃振蕩孵育15分鐘，即得到待測樣本；所述的裂解液包括：異硫氰酸胍2m、ph8.0的tris10mm、ph8.0的edta10mm、tritonx-1001％(v/v)和sds1％(w/v)，溶劑為無菌水；②將步驟①得到的待測樣本轉(zhuǎn)移至磁力架上放置5-10分鐘收集磁珠，吸棄離心管中的上清液；③向步驟②得到的收集有磁珠的離心管中加入500μl洗脫液1，渦旋混勻后，將離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置3-5分鐘收集磁珠，吸棄離心管中的上清液；所述的洗脫液1包括：nacl0.5m、ph8.0的tris100mm、ph8.0的edta1mm和無水乙醇40％(v/v)，溶劑為無菌水；④向步驟③得到的收集有磁珠的離心管中加入500μl洗脫液2，旋混勻后，把離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置3-5分鐘收集磁珠，吸棄離心管中的上清液；所述的洗脫液2為體積濃度60％的乙醇；⑤向步驟④得到的收集有磁珠的離心管中加入500μl洗脫液2，旋混勻后，把離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置3-5分鐘收集磁珠，吸棄離心管中的上清液；所述的洗脫液2為體積濃度60％的乙醇；⑥向步驟⑤得到的收集有磁珠的離心管中加入300μl酶切處理液，渦旋混勻后，37℃孵育1h后，立即于70℃孵育30min；所述的酶切處理液包括：10μl25mmatp、25μlreactionbuffer、30upsad酶，去離子水補加至250μl；所述的reactionbuffer包括：330mmph7.5的tris-acetate、660mm的醋酸鉀、100mm的醋酸鎂和5.0mm的dtt，溶劑為無菌水；⑦短暫離心收集步驟⑥孵育后的離心管管壁上的液滴后，把離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置1分鐘，吸棄所有的殘液，打開離心管管蓋干燥5-10分鐘；⑧向步驟⑦得到的干燥后的離心管中加入30μl洗脫液3，渦旋混勻后，靜置3-10分鐘，將離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置3-5分鐘收集磁珠，分離上清液；所述的洗脫液3為滅菌ddh2o；⑨把步驟⑧得到的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為待測dna樣品；(2)hbvcccdna定量參考品制備將含有hbvcccdna目的片段的質(zhì)粒用od值測定方法計算出質(zhì)粒濃度，用hbv陰性血清稀釋至hbvcccdna含量分別為107拷貝/ml、106拷貝/ml、105拷貝/ml、104拷貝/ml作為標(biāo)準(zhǔn)品，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，與(1)中樣本進行同步提取，hbvcccdna陰性血清作為陰性對照品也同步進行提??；(3)pcr擴增：1)配制pcr反應(yīng)體系：pcr反應(yīng)體系，50μl體系：所述的pcr反應(yīng)液含有15mmtris-hcl(ph8.0)，15mmkcl，2.5mm(nh4)so4，2mmmgcl2，0.5mmdntp/utp，600nm檢測引物組，300nm檢測探針，200nm內(nèi)控引物組，100nm內(nèi)控探針；其中引物1-4的濃度均為：150nm，引物9和引物10的濃度均為100nm；2)實時熒光定量pcr：實時熒光定量pcr程序為：第一步：37℃，5分鐘；第二步：95℃，10分鐘；第三步：95℃，15秒，62℃，15秒，72℃，20秒，15個循環(huán)；第四步：95℃，1秒，60℃，1分鐘，40個循環(huán)；60℃時采集熒光；(3)結(jié)果分析：hbvcccdna陰性血清的檢測結(jié)果為陰性，采用標(biāo)準(zhǔn)品擴增結(jié)果繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其r2為0.999；36例臨床血清樣本的擴增曲線如圖2所示；用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量血清樣本中hbvcccdna的濃度，36例臨床血清樣本的定量結(jié)果如下表1所示。表1血清樣本定量結(jié)果undet.：undetected。實施例6一種檢測乙型肝炎病毒(hbv)cccdna的pcr檢測方法及其應(yīng)用一、采用實施例4中的檢測試劑盒二、樣本來源4例hbv感染者肝組織樣本。三、檢測方法三、檢測方法(1)hbvcccdna的富集提?。孩佾@得待測樣本：取20mg肝組織樣本，切碎后，放入離心管中，向離心管中加入300μl裂解液、20μl蛋白酶k和20μl磁珠，渦旋混勻后置于50～60℃振蕩孵育，孵育至肝組織完全溶解；所述的裂解液包括：異硫氰酸胍6m、ph8.0的tris10mm、ph8.0的edta10mm、tritonx-10010％(v/v)和sds5％(w/v)，溶劑為無菌水；②將步驟①得到的待測樣本轉(zhuǎn)移至磁力架上放置5-10分鐘收集磁珠，吸棄離心管中的上清液；③向步驟②得到的收集有磁珠的離心管中加入500μl洗脫液1，渦旋混勻后，將離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置3-5分鐘收集磁珠，吸棄離心管中的上清液；所述的洗脫液1包括：nacl5m、ph8.0的tris100mm、ph8.0的edta1mm和無水乙醇40％(v/v)，溶劑為無菌水；④向步驟③得到的收集有磁珠的離心管中加入500μl洗脫液2，旋混勻后，把離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置3-5分鐘收集磁珠，吸棄離心管中的上清液；所述的洗脫液2為體積濃度80％的乙醇；⑤向步驟④得到的收集有磁珠的離心管中加入500μl洗脫液2，旋混勻后，把離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置3-5分鐘收集磁珠，吸棄離心管中的上清液；所述的洗脫液2為體積濃度80％的乙醇；⑥向步驟⑤得到的收集有磁珠的離心管中加入300μl酶切處理液，渦旋混勻后，37℃孵育1h后，立即于70℃孵育30min；所述的酶切處理液包括：10μl25mmatp、25μlreactionbuffer、60upsad酶，去離子水補加至250μl；所述的reactionbuffer包括：330mmph7.5的tris-acetate、660mm的醋酸鉀、100mm的醋酸鎂和5.0mm的dtt，溶劑為無菌水；⑦短暫離心收集步驟⑥孵育后的離心管管壁上的液滴后，把離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置1分鐘，吸棄所有的殘液，打開離心管管蓋干燥5-10分鐘；⑧向步驟⑦得到的干燥后的離心管中加入30μl洗脫液3，渦旋混勻后，靜置3-10分鐘，將離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上放置3-5分鐘收集磁珠，分離上清液；所述的洗脫液3為te緩沖液；⑨把步驟⑧得到的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為待測dna樣品；(2)hbvcccdna定量參考品制備將含有hbvcccdna目的片段的質(zhì)粒用od值測定方法計算出質(zhì)粒濃度，用te緩沖液稀釋至hbvcccdna含量分別為106拷貝/μl、105拷貝/μl、104拷貝/μl和103拷貝/μl、作為標(biāo)準(zhǔn)品，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品直接進行pcr擴增，te緩沖液作為陰性對照品也直接進行pcr擴增；(3)pcr擴增：1)配制pcr反應(yīng)體系：pcr反應(yīng)體系，50μl體系：所述的pcr反應(yīng)液含有25mmtris-hcl(ph8.0)，25mmkcl，5mm(nh4)so4，5mmmgcl2，2mmdntp/utp，400nm檢測引物組，100nm檢測探針，200nm內(nèi)控引物組，100nm內(nèi)控探針；其中引物5-8的濃度均為：100nm，引物9和引物10的濃度均為100nm；2)實時熒光定量pcr：實時熒光定量pcr程序為：第一步：37℃，5分鐘；第二步：95℃，10分鐘；第三步：95℃，15秒，66℃，15秒，72℃，20秒，15個循環(huán)；第四步：95℃，1秒，60℃，1分鐘，40個循環(huán)；60℃時采集熒光；(3)結(jié)果分析：陰性對照品無ct值顯示，采用標(biāo)準(zhǔn)品擴增結(jié)果繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，其r2為0.999；36例臨床血清樣本的擴增曲線如圖2所示；用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量血清樣本中hbvcccdna的濃度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量肝組織dna樣本中hbvcccdna的濃度，肝樣本hbvcccdna(拷貝/mg)＝dna樣本中hbvcccdna的濃度*30μl/20mg，4例肝組織樣本cccdna的定量結(jié)果如下表2所示。表2肝組織樣本定量結(jié)果標(biāo)本號1234定量結(jié)果(拷貝/mg)3.09e+036.58e+037.90e+002.89e+02以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>廣州海力特生物科技有限公司<120>hbvcccdna的富集提取方法及檢測引物組、探針和方法<130>20170314<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1actccccgtctgtgccttct20<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2ttctttatacgggtcaatgtcca23<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3aggaggctgtaggcataaat20<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<400>4tcccgatacaaagcagag18<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列<400>5acgaccgaccttgaggcatacttc24<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列<400>6attcatcaactcaccccaacacag24<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7taggaggctgtaggcataaat21<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列<400>8caaagcagaggcggtgtc18<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9ctgttcaagcctccaagctg20<210>10<211>29<212>dna<213>人工序列<400>10cggggtcacccacactgtgcccatctacg29<210>11<211>26<212>dna<213>人工序列<400>11ggtcacccacactgtgcccatctacg26<210>12<211>22<212>dna<213>人工序列<400>12atgccctcccccatgccatcct22當(dāng)前第1頁12