本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酸聯(lián)產(chǎn)維生素b12的裝置及方法，尤其涉及膜分離技術(shù)和層析技術(shù)耦合發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)維生素b12和丙酸的工藝。
背景技術(shù)：
費氏丙酸桿菌(propionibacteriumfreudenreichii)是美國fda和美國飼料控制官員協(xié)會(aafco)批準(zhǔn)使用的飼用微生物菌種，也是厭氧法發(fā)酵生產(chǎn)維生素b12的生產(chǎn)菌株。維生素b12厭氧發(fā)酵工藝的動力消耗低，一直被大多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)采用。但是，近年來隨著脫氮假單孢菌(pscudomonasdenitrificans)好氧發(fā)酵維生素b12的水平逐步提高，厭氧發(fā)酵工藝的優(yōu)勢已經(jīng)無法突顯。因此，提高費氏丙酸桿菌厭氧發(fā)酵維生素b12的效率，具有重要的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景。
費氏丙酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b12的同時，會產(chǎn)生以丙酸為主的胞外代謝產(chǎn)物，而發(fā)酵液中丙酸的不斷積累會對菌體細胞生長及丙酸自身代謝產(chǎn)生反饋抑制作用。為了解除丙酸對發(fā)酵的反饋抑制作用，研究人員對生產(chǎn)菌株進行了基因改造(biotechnologyandbioengineering,2009,104:766-773；metabolicengineering,2015,27:46-56)，研究了丙酸的反饋抑制機理(journalofbiotechnology,2013,167:56-63)，并采取適當(dāng)?shù)恼{(diào)控策略(bioresourcetechnology,2012,105:128-133；bioresourcetechnology,2013,135:504-512)來提高批次發(fā)酵過程中丙酸的產(chǎn)量。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中采用過程工程手段及時移除丙酸，可有效效減緩或消除其對發(fā)酵的反饋抑制作用，提高發(fā)酵效率。“appliedmicrobiologyandbiotechnology,2001,56:676-680”報道了goswami構(gòu)建了一種原位細胞截留反應(yīng)器，通過不銹鋼旋轉(zhuǎn)過濾器將菌體細胞截留，使含高濃度丙酸的發(fā)酵清液濾過，從而實現(xiàn)了菌體細胞與丙酸的分離。“journalofbiotechnology,2012,164:202-210”報道了，南京工業(yè)大學(xué)歐陽平凱院士構(gòu)建了一種多孔纖維床反應(yīng)器將發(fā)酵過程中產(chǎn)生的丙酸及時分離出來，提高了發(fā)酵產(chǎn)率?！癰ioresourcetechnology,2012,112:248-253”報道了，浙江大學(xué)徐志南教授通過將菌體細胞固定化在纖維床反應(yīng)器上，采用流加葡萄糖的方式，提高了發(fā)酵效率?！癰ioresourcetechnology,2012,104：652-659”報道了，中科院過程所王云山研究員將擴張床層析技術(shù)與發(fā)酵過程耦合起來，建立了一種以擴張床原位吸附為特征的新型發(fā)酵過程，提高了維生素b12的產(chǎn)量。但是，在工業(yè)生產(chǎn)過程中，上述工藝普遍面臨著難以放大、成本高等問題。
為了進一步提高發(fā)酵效率和底物轉(zhuǎn)化率，降低發(fā)酵成本，中科院過程所王云山研究員提出，應(yīng)該將丙酸從副產(chǎn)物的角色轉(zhuǎn)變成目標(biāo)產(chǎn)物，在擴張床耦合發(fā)酵的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)維生素b12和丙酸的聯(lián)產(chǎn)，達到“一菌兩用”的目標(biāo)?！癮ppliedmicrobiologyandbiotechnology,2014,98:7761-7772”研究發(fā)現(xiàn)，費氏丙酸桿菌代謝合成丙酸與emp途徑和wood-werkmman途徑密切相關(guān)。從丙酸發(fā)酵和維生素b12的代謝途徑可以看出，coa轉(zhuǎn)移酶可以將丙酰coa上的輔酶轉(zhuǎn)移至琥珀酸上，從而生成丙酸和琥珀酰coa，而琥珀酰coa和甘氨酸縮合反應(yīng)后可生成維生素b12合成的關(guān)鍵代謝中間體5-氨基乙酰丙酸，然后再經(jīng)過聚合、重排、環(huán)化、甲基化、去碳酸基、鈷離子插入以及環(huán)縮作用等生成維生素b12。因此，從這個角度講，維生素b12和丙酸的合成代謝是相輔相成的，具備了維生素b12和丙酸雙產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)的理論基礎(chǔ)。
費氏丙酸桿菌的胞內(nèi)代謝產(chǎn)物腺苷鈷啉醇酰胺(ado-cbi)是維生素b12的一個關(guān)鍵代謝中間體，其磷酸化后可與α-吡咯核糖反應(yīng)生成維生素b12。但是，由于胞內(nèi)的α-吡咯核糖濃度較低，限制了ado-cbi的轉(zhuǎn)化速率，并使其在胞內(nèi)不斷積累，因此，α-吡咯核糖是該反應(yīng)的一個關(guān)鍵限速因子。生產(chǎn)過程中常通過人為添加其結(jié)構(gòu)類似物5,6-二甲基苯并咪唑(dmb)來促進維生素b12的合成。
不足之處就是，dmb的添加會影響維生素b12代謝中間體的合成，不利于費氏丙酸桿菌的連續(xù)發(fā)酵，因此，為了實現(xiàn)維生素b12和丙酸的雙產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)，“中國生物工程雜志，2016,36(4):104-109；過程工程學(xué)報，2016,16(2):298-302”中科院過程所王云山研究員提出了“細胞離位轉(zhuǎn)化”的概念，不僅避免了前體物質(zhì)dmb對發(fā)酵的影響，還有助于在分批補料發(fā)酵的基礎(chǔ)上實現(xiàn)半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)。即當(dāng)發(fā)酵進行到某個時間節(jié)點時，采用適合的方法(離心或膜分離)將菌體細胞從發(fā)酵液中分離出來，轉(zhuǎn)移至另一個反應(yīng)體系中，加入dmb進行維生素b12的后期合成，而原有發(fā)酵體系繼續(xù)運行。
cn101402913a公開了一種批式發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸聯(lián)產(chǎn)維生素b12的裝置，包括丙酸固定化生產(chǎn)單元和維生素b12的生產(chǎn)單元，兩個生產(chǎn)單元通過恒流泵相連接。所述丙酸發(fā)酵中，采用甘蔗渣的織物纖維固定化柱將丙酸桿菌進行固定，后續(xù)容易將丙酸桿菌和丙酸發(fā)酵液分離，但是固定化丙酸桿菌是一個周期長，難度大的步驟，其需要耗費大量的時間，且容易固定失敗。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的工業(yè)化放大生產(chǎn)難、擴張床填充率低、丙酸桿菌不易與丙酸發(fā)酵液分離等問題，本發(fā)明的目的在于提供一種半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酸聯(lián)產(chǎn)維生素b12的裝置及方法，所述方法在膜分離細胞的基礎(chǔ)上，耦合固定床層析技術(shù)，吸附分離發(fā)酵液中的丙酸，解除了丙酸對發(fā)酵的反饋抑制作用，并采用再次接種的方法，在分批補料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)了維生素b12和丙酸的半連續(xù)發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)，提高了發(fā)酵效率和底物轉(zhuǎn)化率，降低了發(fā)酵成本。
為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一方面，本發(fā)明的提供了一種半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酸聯(lián)產(chǎn)維生素b12的裝置，所述裝置包括發(fā)酵單元、膜分離單元、丙酸分離單元和維生素b12的轉(zhuǎn)化單元，所述發(fā)酵單元的出料口通過膜分離單元與丙酸分離單元和維生素b12的轉(zhuǎn)化單元的進料口相連接，所述丙酸分離單元的出料口與發(fā)酵單元的回流口相連接；
所述膜分離單元包括膜分離設(shè)備21，所述膜分離設(shè)備21包括膜芯，所述膜芯的孔徑為0.1-0.22μm。
本發(fā)明中，所述轉(zhuǎn)置通過膜分離設(shè)備將發(fā)酵液進行分離，而通過選擇膜芯的孔徑大小，將發(fā)酵液中的費氏丙酸桿菌細胞截留濃縮，將含有丙酸的發(fā)酵清液分離，不僅不需要將費氏丙酸桿菌進行固定就可以達到分離細胞和發(fā)酵清液的目的，還通過分流，將細胞和發(fā)酵清液進入兩個不同的循環(huán)，解除了丙酸對發(fā)酵的反饋抑制作用，同時將細胞進行維生素b12的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，而丙酸分離后的廢液又可以回流如發(fā)酵單元中，進行循環(huán)發(fā)酵。
優(yōu)選地，所述膜芯的孔徑為0.1-0.22μm，例如可以是0.1μm或0.22μm，優(yōu)選為0.22μm。
優(yōu)選地，所述膜芯為聚醚砜類卷式有機膜、聚醚砜類卷式平板膜或氧化鋯類管式陶瓷膜中的任意一種，優(yōu)選為聚醚砜類卷式有機膜。
優(yōu)選地，所述膜芯的膜面積為不小于0.12m2，例如可以是0.12m2、0.25m2、0.5m2、1m2、1.2m2、1.5m2、1.8m2、2m2、2.2m2、2.5m2、2.8m2、3m2、3.2m2、3.5m2、4m2、4.5m2、5m2、5.5m2、6m2、7m2、8m2、9m2或10m2，優(yōu)選為0.12-3m2。
優(yōu)選地，所述發(fā)酵單元包括發(fā)酵罐11，所述發(fā)酵罐11的罐體的上半部設(shè)置有發(fā)酵罐進料口12，所述發(fā)酵罐11的罐頂設(shè)置有攪拌裝置13。
本發(fā)明中，所述發(fā)酵罐的體積本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進行選擇，在此不做特殊限定，本發(fā)明優(yōu)選體積為10l的發(fā)酵罐，料液裝填系數(shù)為0.7.
本發(fā)明中，所述進料口12用于料液的補充及營養(yǎng)物質(zhì)的添加。
優(yōu)選地，所述丙酸分離單元包括與膜分離單元相連的層析柱31，所述層析柱31的出料口與發(fā)酵罐11的回流口相連。
本發(fā)明中，所述層析柱的出料口與與發(fā)酵罐11的回流口相連為了將層析柱吸附后的廢液回流入發(fā)酵罐中進行再次發(fā)酵生產(chǎn)。
優(yōu)選地，所述層析柱31中的填充材料為陰離子交換樹脂，優(yōu)選為zgd630陰離子交換樹脂。
優(yōu)選地，所述層析柱31的數(shù)量為1-8，例如可以是1、2、3、4、5、6、7或8，優(yōu)選為2-6，進一步優(yōu)選為3。
本發(fā)明中所述層析柱多于1個時，采用并聯(lián)的方式將多個層析柱相連接。
本發(fā)明中所述層析柱中的陰離子交換樹脂zgd630在吸附完丙酸后經(jīng)過洗脫裝置的洗脫后得到丙酸。
優(yōu)選地，所述維生素b12的轉(zhuǎn)化單元包括與膜分離單元相連的轉(zhuǎn)化反應(yīng)器41，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)器41的上半部設(shè)置有轉(zhuǎn)化反應(yīng)器進料口12。
所述半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酸聯(lián)產(chǎn)維生素b12的裝置的工作過程如下：
在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種費氏丙酸桿菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，將膜分離裝置中的各管道清洗干凈，裝入待用的膜芯，然后用0.5％w/w的亞硫酸氫鈉進行清洗，使其在系統(tǒng)中循環(huán)40-60min；當(dāng)發(fā)酵進行至84h時，然后開機運行，并調(diào)整膜設(shè)備的壓力及流量，使發(fā)酵液從出料口中流出進入膜分離單元，在膜分離裝置中循環(huán)，隨著含丙酸等有機酸組分的濾液不斷滲出，原有的發(fā)酵液逐步得到濃縮，并使得菌體細胞與發(fā)酵清液分離開來，實現(xiàn)了菌體細胞的在線分離；分離的發(fā)酵清液從膜分離轉(zhuǎn)置中進入丙酸分離單元的層析柱中進行丙酸分離，隨著zgd630樹脂對濾過清液中的丙酸等有機酸的不斷吸附，使得濾液中的有機酸濃度逐漸降低，當(dāng)丙酸濃度低至10g/l時，停止吸附，從層析柱中流出的廢液回流至發(fā)酵單元的發(fā)酵罐中補入營養(yǎng)物質(zhì)和費氏丙酸桿菌進行再次發(fā)酵，將層析柱中的zgd630樹脂進行洗脫，可得到丙酸；而分離的菌體細胞進入維生素b12的轉(zhuǎn)化單元，進入dmb進行維生素b12的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)。
另一方面，本發(fā)明提供一種利用如第一方面所述的裝置發(fā)酵生產(chǎn)丙酸聯(lián)產(chǎn)維生素b12的方法，包括如下步驟：
(1)在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種費氏丙酸桿菌進行發(fā)酵培養(yǎng)；
(2)將步驟(1)發(fā)酵培養(yǎng)后的培養(yǎng)液通過膜分離裝置分離，得到發(fā)酵清液和濃縮的菌體細胞；
(3)將步驟(2)處理后的發(fā)酵清液通過層析柱進行丙酸分離；
(4)將步驟(3)丙酸分離后的廢液回流入發(fā)酵罐中，補加營養(yǎng)物質(zhì)后，接入費氏丙酸桿菌，繼續(xù)發(fā)酵；
(5)將步驟(2)處理后的菌體細胞轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)化反應(yīng)器中，進行維生素b12的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)。
優(yōu)選地，步驟(1)所述的接種費氏丙酸桿菌為將保存的費氏丙酸桿菌接種到種子培養(yǎng)基中一次活化，再將活化后的費氏丙酸桿菌接種到二級搖瓶種子培養(yǎng)基中二次活化，將二次活化后的費氏丙酸桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)。
本發(fā)明中的費氏丙酸桿菌為本領(lǐng)域可購買得到的費氏丙酸桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要自行購買，本發(fā)明中的費氏丙酸桿菌購買于微生物保藏中心，并沒有經(jīng)過任何的馴化，而不同購買地的費氏丙酸桿菌及不同批次的費氏丙酸桿菌對丙酸和維生素b12的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)率都不盡相同，而本發(fā)明都采用同樣購買地同一批次的費氏丙酸桿菌進行試驗，而不同購買地和不同批次的費氏丙酸桿菌對本發(fā)明的方法不構(gòu)成影響。
優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基為：葡萄糖35g/l，玉米漿21g/l，硫酸銨5g/l，磷酸二氫鉀4g/l，氯化鈷0.005g/l，ph6.8-7.0。
本發(fā)明中通過流加高濃度葡萄糖(50wt％)的方式，使得葡萄糖的濃度不低于10g/l，利于發(fā)酵的進行和丙酸的產(chǎn)生。
優(yōu)選地，所述活化的溫度為25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，優(yōu)選為28-32℃，優(yōu)選為30℃。
優(yōu)選地，所述一次活化和二次活化的時間獨立地為40-80h，例如可以是40h、41h、42h、43h、45h、46h、48h、50h、51h、52h、53h、54h、55h、56h、58h、60h、62h、63h、65h、68h、70h、72h、75h、76h、78h或80h，優(yōu)選為45-55h，進一步優(yōu)選為48h。
優(yōu)選地，步驟(1)發(fā)酵培養(yǎng)的碳源為葡萄糖、甘油，優(yōu)選為葡萄糖。
優(yōu)選地，步驟(1)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖60g/l，玉米漿41g/l，磷酸二氫鉀4.6g/l，氯化鈷0.0127g/l，ph6.8-7.0。
優(yōu)選地，步驟(1)所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃，優(yōu)選為28-32℃，進一步優(yōu)選為30℃。
優(yōu)選地，步驟(1)發(fā)酵培養(yǎng)的攪拌速率為30-100r/min，例如可以是30r/min、40r/min、50r/min、60r/min、70r/min、80r/min、90r/min、100r/min，優(yōu)選為40-80r/min，進一步優(yōu)選為50r/min。
優(yōu)選地，步驟(1)發(fā)酵培養(yǎng)的ph為6-8，例如可以是6、6.1、6.3、6.5、6.8、7、7.1、7.3、7.5、7.8、8，優(yōu)選為6.8-7.2。
優(yōu)選地，步驟(1)所述發(fā)酵的時間為80-90h，例如可以80h、81h、82h、83h、84h、85h、86h、87h、88h、89h或90h，優(yōu)選為82-85h，進一步優(yōu)選為84h。
優(yōu)選地，所述膜分離裝置中的膜芯為聚醚砜類卷式有機膜、聚醚砜類卷式平板膜或氧化鋯類管式陶瓷膜中的任意一種，優(yōu)選為聚醚砜類卷式有機膜。
優(yōu)選地，所述膜分離裝置中的膜芯的孔徑為0.1-0.22μm，例如可以是0.1μm或0.22μm，優(yōu)選為0.22μm。
優(yōu)選地，所述膜芯的膜面積為不小于0.12m2，例如可以是0.12m2、0.25m2、0.5m2、1m2、1.2m2、1.5m2、1.8m2、2m2、2.2m2、2.5m2、2.8m2、3m2、3.2m2、3.5m2、4m2、4.5m2、5m2、5.5m2、6m2、7m2、8m2、9m2或10m2，優(yōu)選為0.12-3m2。
優(yōu)選地，所述膜分離裝置運行前進行清洗，所述清洗液為亞硫酸氫鈉。
優(yōu)選地，所述亞硫酸氫鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-2％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％或2％，優(yōu)選為0.3-0.8％。
優(yōu)選地，所述清洗的時間為30-80min，例如可以是30min、31min、32min、33min、35min、36min、38min、40min、42min、45min、48min、50min、52min、55min、58min、60min、62min、65min、68min、70min、72min、75min、78min或80min，優(yōu)選為40-60min。
本發(fā)明中，所述膜分離裝置的壓力和流量本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進行調(diào)節(jié)，在此不做特殊限定，本發(fā)明所述裝置的壓力為10bar，流量為8lpm。
優(yōu)選地，步驟(2)所述分離的溫度為25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，優(yōu)選為28-32℃，進一步優(yōu)選為30℃。
優(yōu)選地，步驟(2)所述分離的時間為30-80min，例如可以是30min、31min、32min、33min、35min、36min、38min、40min、42min、45min、48min、50min、52min、55min、58min、60min、62min、65min、68min、70min、72min、75min、78min或80min，優(yōu)選為40-60min。
優(yōu)選地，所述濃縮的菌體細胞的濃縮過程需要控制在2-3h，即膜的平均通量為2.5-3.5l/h，所述濃縮倍數(shù)為2-4倍，例如可以是2倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍，優(yōu)選為4倍。
優(yōu)選地，步驟(3)所述層析柱中的填充材料為陰離子交換樹脂，優(yōu)選為zgd630陰離子交換樹脂。
優(yōu)選地，所述陰離子交換樹脂zgd630的裝填量相對于7l的發(fā)酵液時，為不小于2.5l，例如可以是2.5l、3l、3.5l、4l、4.5l、5l、5.5l、6l、6.5l、7l、7.5l、8l、8.5l、9l、9.5l或10l，優(yōu)選為2.5-5l。
本發(fā)明中，陰離子交換樹脂zgd630對丙酸吸附量為44.1mg/g(ph6.80)，將發(fā)酵液中的丙酸從30g/l降至10g/l，樹脂需量為大于等于2500l，所以本發(fā)明中陰離子交換樹脂zgd630的裝填量是根據(jù)7l的發(fā)酵液來限定的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)發(fā)酵液的體積來調(diào)節(jié)陰離子交換樹脂zgd630的裝填量。
優(yōu)選地，步驟(3)所述層析柱的上樣速度為1-4bv/h，例如可以是1bv/h、1.2bv/h、1.3bv/h、1.5bv/h、1.6bv/h、1.8bv/h、2bv/h、2.1bv/h、2.3bv/h、2.5bv/h、2.6bv/h、2.8bv/h、3bv/h、3.1bv/h、3.3bv/h、3.5bv/h、3.8bv/h或4bv/h，優(yōu)選的是3bv/h。
優(yōu)選地，所述陰離子交換樹脂zgd630在吸附完丙酸后經(jīng)過洗脫得到丙酸；
優(yōu)選地，步驟(4)回流的廢液的丙酸濃度低于10g/l，例如可以是1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l或10g/l，優(yōu)選為3-8g/l。
優(yōu)選地，步驟(4)所述的營養(yǎng)物質(zhì)為葡萄糖和玉米漿。
優(yōu)選地，步驟(4)所述費氏丙酸桿菌的接種量為8-12％，例如可以是8％、9％、10％、11％或12％，優(yōu)選為10％。
優(yōu)選地，步驟(5)所述進行維生素b12的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)前補加前體物質(zhì)5,6二甲基苯并咪唑(dmb)。
本發(fā)明中，所述dmb的添加量可參照其他批次發(fā)酵時dmb的用量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進行選擇，本發(fā)明中，當(dāng)菌體細胞的濃縮4倍時，dmb的添加量為3.6mg/l。
優(yōu)選地，步驟(5)所述的轉(zhuǎn)化的溫度為25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，優(yōu)選為28-32℃，進一步優(yōu)選為30℃。
優(yōu)選地，步驟(5)所述的轉(zhuǎn)化的時間為65-80h，例如可以是65h、66h、67h、68h、69h、70h、71h、72h、73h、74h、75h、76h、77h、78h、79h或80h，優(yōu)選為70-75h。
優(yōu)選地，步驟(5)所述的轉(zhuǎn)化的ph為6-7.5，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，優(yōu)選為6.5-7.3，優(yōu)選為6.8-7.2。
本發(fā)明未詳細闡述部分屬于本領(lǐng)域公知技術(shù)。
作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述方法包括如下步驟：
(1)將保存的費氏丙酸桿菌接種到種子培養(yǎng)基中在溫度25-35℃一次活化40-80h，再將活化后的費氏丙酸桿菌接種到二級搖瓶種子培養(yǎng)基中在溫度25-35℃二次活化40-80h，將二次活化后的費氏丙酸桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中在溫度25-35℃、攪拌速率30-100r/min、ph6-8下厭氧發(fā)酵培養(yǎng)80-90h；
(2)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-2％的亞硫酸氫鈉清洗孔徑為0.1-0.22μm、膜面積為不小于0.12m2的聚醚砜類卷式有機膜的膜分離裝置30-80min，將步驟(1)發(fā)酵培養(yǎng)后的培養(yǎng)液通過膜分離裝置在溫度25-35℃分離30-80min，得到發(fā)酵清液和濃縮倍數(shù)為2-4倍的菌體細胞；
(3)將步驟(2)處理后的發(fā)酵清液通過陰離子交換樹脂zgd630層析柱，上樣速度為1-4bv/h進行丙酸分離，所述陰離子交換樹脂zgd630在吸附完丙酸后經(jīng)過洗脫得到丙酸，其中，所述陰離子交換樹脂zgd630的裝填量相對于7l的發(fā)酵液為不小于2.5l；
(4)當(dāng)步驟(3)丙酸分離后得到的丙酸濃度低于10g/l的廢液回流入發(fā)酵罐中，補加葡萄糖、玉米漿等營養(yǎng)物質(zhì)后，接入接種量為10％的費氏丙酸桿菌，繼續(xù)發(fā)酵；
(5)將步驟(2)處理后的菌體細胞轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)化反應(yīng)器中，補加前體物質(zhì)5,6二甲基苯并咪唑(dmb)，在溫度25-35℃、ph為6-7.5進行維生素b12的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時間為65-80h，收集菌體，進行維生素b12的提取純化。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
(1)本發(fā)明的費氏丙酸桿菌半連續(xù)發(fā)酵工藝，通過模塊化單元操作和過程集成，采用再次接種的方法，完成半連續(xù)發(fā)酵，實現(xiàn)了維生素b12和丙酸的聯(lián)產(chǎn)，丙酸的生產(chǎn)率可達0.332g/(l·h)，維生素b12生產(chǎn)率可達0.149mg/(l·h)，提高了發(fā)酵效率和底物轉(zhuǎn)化率，丙酸的轉(zhuǎn)化率相比于批次發(fā)酵提高了33.98％，維生素b12轉(zhuǎn)化率相比于批次發(fā)酵提高了44.56％；
(2)本發(fā)明方法在膜分離細胞的基礎(chǔ)上，耦合固定床層析技術(shù)，吸附分離發(fā)酵液中的丙酸，不僅有效解決了丙酸對發(fā)酵的反饋抑制作用，還克服了擴張床填充效率低，難以放大的劣勢，而且也解決了菌體細胞固定時間長，固定難度大的問題；
(3)本發(fā)明有效解決了dmb添加對發(fā)酵廢水資源化利用的不利影響，實現(xiàn)了發(fā)酵廢液的循環(huán)利用。
附圖說明
圖1為本發(fā)明半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酸聯(lián)產(chǎn)維生素b12的裝置結(jié)構(gòu)示意圖，其中，11-發(fā)酵罐，22-發(fā)酵罐進料口，13-攪拌裝置，21-膜分離裝置，31-層析柱，41-轉(zhuǎn)化反應(yīng)器進料口，42-轉(zhuǎn)化反應(yīng)器。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖并通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
實施例1
一種半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酸聯(lián)產(chǎn)維生素b12的裝置，如圖1所示，所述裝置包括發(fā)酵單元、膜分離單元、丙酸分離單元和維生素b12的轉(zhuǎn)化單元，所述發(fā)酵單元的出料口通過膜分離單元與丙酸分離單元和維生素b12的轉(zhuǎn)化單元的進料口相連接，所述丙酸分離單元的出料口與發(fā)酵單元的回流口相連接；
所述發(fā)酵單元包括發(fā)酵罐11，所述發(fā)酵罐11的罐體的上半部設(shè)置有發(fā)酵罐進料口12，所述發(fā)酵罐11的罐頂設(shè)置有攪拌裝置13，所述進料口12用于料液的補充及營養(yǎng)物質(zhì)的添加；
所述丙酸分離單元包括與膜分離單元相連的層析柱31，所述層析柱31的出料口與發(fā)酵罐11的回流口相連，所述層析柱的出料口與與發(fā)酵罐11的回流口相連為了將層析柱吸附后的廢液回流入發(fā)酵罐中進行再次發(fā)酵生產(chǎn)；
所述維生素b12的轉(zhuǎn)化單元包括與膜分離單元相連的轉(zhuǎn)化反應(yīng)器41，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)器41的上半部設(shè)置有轉(zhuǎn)化反應(yīng)器進料口12；
所述膜分離單元包括膜分離設(shè)備21，所述膜分離設(shè)備21包括膜芯，所述膜芯的孔徑為0.1-0.22μm；
所述膜芯為聚醚砜類卷式有機膜，所述膜芯的膜面積為不小于0.12m2；
所述層析柱31中的填充材料為陰離子交換樹脂zgd630，所述層析柱31的數(shù)量為3，3個層析柱并聯(lián)。
所述裝置的工作過程如下：
在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種費氏丙酸桿菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，將膜分離裝置中的各管道清洗干凈，裝入待用的膜芯，然后用0.5％w/w的亞硫酸氫鈉進行清洗，使其在系統(tǒng)中循環(huán)40-60min；當(dāng)發(fā)酵進行至84h時，然后開機運行，并調(diào)整膜設(shè)備的壓力及流量，使發(fā)酵液從出料口中流出進入膜分離單元，在膜分離裝置中循環(huán)，隨著含丙酸等有機酸組分的濾液不斷滲出，原有的發(fā)酵液逐步得到濃縮，并使得菌體細胞與發(fā)酵清液分離開來，實現(xiàn)了菌體細胞的在線分離；分離的發(fā)酵清液從膜分離轉(zhuǎn)置中進入丙酸分離單元的層析柱中進行丙酸分離，隨著zgd630樹脂對濾過清液中的丙酸等有機酸的不斷吸附，使得濾液中的有機酸濃度逐漸降低，當(dāng)丙酸濃度低至10g/l時，停止吸附，從層析柱中流出的廢液回流至發(fā)酵單元的發(fā)酵罐中補入營養(yǎng)物質(zhì)和費氏丙酸桿菌進行再次發(fā)酵，將層析柱中的zgd630樹脂進行洗脫，可得到丙酸；而分離的菌體細胞進入維生素b12的轉(zhuǎn)化單元，進入dmb進行維生素b12的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)。
實施例2：半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酸聯(lián)產(chǎn)維生素b12的方法
(1)費氏丙酸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)
菌種活化培養(yǎng)：將甘油管或斜面保存的菌種進行平板劃線活化，置于30℃恒溫厭氧培養(yǎng)72h；
種子液培養(yǎng)：取活化后的斜面種子接入液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48h；
發(fā)酵罐培養(yǎng)：按照10％的接種量接種至10l發(fā)酵罐中，于30℃，50r/min條件下培養(yǎng)，當(dāng)葡萄糖濃度低于10g/l時補加高濃度葡萄糖，同時用氨水調(diào)節(jié)ph為6.8-7.2，定期取樣測定菌體的od600值。當(dāng)發(fā)酵進行至84h時，胞內(nèi)的維生素b12代謝中間體ado-cbi積累至最大值，此時發(fā)酵液的od600達到48，丙酸濃度達到了33.34g/l，開始進行菌體的膜分離；
(2)費氏丙酸桿菌菌體的膜分離
將膜分離設(shè)備中的各管道清洗干凈，裝入0.22μm卷式膜膜芯(0.12m2)。當(dāng)費氏丙酸桿菌發(fā)酵進行至84h時，將發(fā)酵罐與膜分離設(shè)備連接，開機運行，調(diào)節(jié)壓力為10bar，流量為8lpm，使發(fā)酵液在系統(tǒng)中循環(huán)。卷式膜的初始通量可達到55.63l/(h·m2)，隨時發(fā)酵清液的濾出及菌體濃度的逐漸增大，通量逐漸下降，平均通量可達23.86l/(h·m2)。7l發(fā)酵液濃縮4倍時，濾出液為5.25l，需要2h；
取濃縮液進行稀釋后，進行平板涂布，細胞存活率得到了99.5％；
(3)發(fā)酵液中丙酸的在線的吸附分離
將預(yù)處理好的陰離子交換樹脂zgd630裝填于層析柱中，樹脂裝填量為2.5l，并將層析柱的上樣管道與膜分離設(shè)備的濾過液管道連接，使得膜分離設(shè)備的濾過清液上樣至層析柱中，上樣速度與膜分離設(shè)備的清液濾出速度相同，為2.86l/h，約為1.15bv/h。上樣結(jié)束后，穿柱液中丙酸的含量為10.28g/l，zgd630樹脂對丙酸的吸附載量達到了50.73mg/g；
(4)維生素b12的細胞離位濃縮轉(zhuǎn)化
將膜分離得到的濃縮了4倍的費氏丙酸桿菌濃縮液轉(zhuǎn)移至另一無菌的反應(yīng)罐內(nèi)，加入3.6mg/l的前體物質(zhì)dmb，于30℃條件下轉(zhuǎn)化72h，轉(zhuǎn)化過程中用氨水調(diào)節(jié)ph為6.8-7.2，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液于10000r/min條件下離心收集菌體，使用醋酸鹽緩沖液(ph3.5)重懸至原來體積，95℃熱破碎30min，離心取上清，使用hplc分析維生素b12的產(chǎn)量，最終產(chǎn)量為53.9mg/l，ado-cbi轉(zhuǎn)化率達78.8％，折算到發(fā)酵液的體積時，維生素b12的產(chǎn)量為13.48mg/l；
(5)費氏丙酸桿菌桿菌的半連續(xù)發(fā)酵
向步驟(4)中得到的部分移除丙酸后的發(fā)酵穿柱液中補加一定濃度的葡萄糖和玉米漿，使其濃度分別達到60g/l和41g/l，然后接入新鮮的種子培養(yǎng)液，繼續(xù)進行發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵進行至84h時，即維生素b12代謝中間體ado-cbi積累至最大值時，繼續(xù)進行細胞的膜濃縮分離和丙酸的吸附移除，參照實施例1-4。
當(dāng)將上述操作循環(huán)一次時，丙酸的濃度可達到55.87g/l，維生素b12的濃度達到了24.98mg/l。
實施例3：半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酸聯(lián)產(chǎn)維生素b12的方法
(1)費氏丙酸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)
菌種活化培養(yǎng)：將甘油管或斜面保存的菌種進行平板劃線活化，置于35℃恒溫厭氧培養(yǎng)40h；
種子液培養(yǎng)：取活化后的斜面種子接入液體培養(yǎng)基中，35℃靜置培養(yǎng)42h；
發(fā)酵罐培養(yǎng)：按照10％的接種量接種至10l發(fā)酵罐中，于35℃，30r/min條件下培養(yǎng)，當(dāng)葡萄糖濃度低于10g/l時補加高濃度葡萄糖，同時用氨水調(diào)節(jié)ph為6-8，定期取樣測定菌體的od600值。當(dāng)發(fā)酵進行至80h時，胞內(nèi)的維生素b12代謝中間體ado-cbi積累到最大值，此時發(fā)酵液的od600達到45，丙酸濃度達到了32.15g/l，開始進行菌體的膜分離；
(2)費氏丙酸桿菌菌體的膜分離
將膜分離設(shè)備中的各管道清洗干凈，裝入0.25μm卷式膜膜芯(0.34m2)。當(dāng)費氏丙酸桿菌發(fā)酵進行至80h時，將發(fā)酵罐與膜分離設(shè)備連接，開機運行，調(diào)節(jié)壓力為10bar，流量為8lpm，使發(fā)酵液在系統(tǒng)中循環(huán)。卷式膜的初始通量可達到52.16l/(h·m2)，隨時發(fā)酵清液的濾出及菌體濃度的逐漸增大，通量逐漸下降，平均通量可達21.54l/(h·m2)。7l發(fā)酵液濃縮2倍時，濾出液為3.43l，需要2.5h；
取濃縮液進行稀釋后，進行平板涂布，細胞存活率得到了99.3％；
(3)發(fā)酵液中丙酸的在線的吸附分離
將預(yù)處理好的陰離子交換樹脂zgd630裝填于層析柱中，樹脂裝填量為2.5l，并將層析柱的上樣管道與膜分離設(shè)備的濾過液管道連接，使得膜分離設(shè)備的濾過清液上樣至層析柱中，上樣速度與膜分離設(shè)備的清液濾出速度相同，為2.86l/h，約為2.15bv/h。
上樣結(jié)束后，穿柱液中丙酸的含量為8.65g/l，zgd630樹脂對丙酸的吸附載量達到了46.52mg/g；
(4)維生素b12的細胞離位濃縮轉(zhuǎn)化
將膜分離得到的濃縮了2倍的費氏丙酸桿菌濃縮液轉(zhuǎn)移至另一無菌的反應(yīng)罐內(nèi)，加入1.8mg/l的前體物質(zhì)dmb，于35℃條件下轉(zhuǎn)化65h，轉(zhuǎn)化過程中用氨水調(diào)節(jié)ph為6-7.5，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液于10000r/min條件下離心收集菌體，使用醋酸鹽緩沖液(ph3.5)重懸至原來體積，95℃熱破碎30min，離心取上清，使用hplc分析維生素b12的產(chǎn)量，最終產(chǎn)量為48.6mg/l，ado-cbi轉(zhuǎn)化率達75.3％，折算到發(fā)酵液的體積時，維生素b12的產(chǎn)量為11.34mg/l；
(5)費氏丙酸桿菌桿菌的半連續(xù)發(fā)酵
向步驟(4)中得到的部分移除丙酸后的發(fā)酵穿柱液中補加一定濃度的葡萄糖和玉米漿，使其濃度分別達到60g/l和41g/l，然后接入新鮮的種子培養(yǎng)液，繼續(xù)進行發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵進行至84h時，即維生素b12代謝中間體ado-cbi積累至最大值時，繼續(xù)進行細胞的膜濃縮分離和丙酸的吸附移除，參照步驟(1)-(4)。
當(dāng)將上述操作循環(huán)一次時，丙酸的濃度可達到49.23g/l，維生素b12的濃度達到了20.12mg/l。
實施例4：半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酸聯(lián)產(chǎn)維生素b12的方法
(1)費氏丙酸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)
菌種活化培養(yǎng)：將甘油管或斜面保存的菌種進行平板劃線活化，置于25℃恒溫厭氧培養(yǎng)80h；
種子液培養(yǎng)：取活化后的斜面種子接入液體培養(yǎng)基中，25℃靜置培養(yǎng)48h；
發(fā)酵罐培養(yǎng)：按照10％的接種量接種至10l發(fā)酵罐中，于25℃，100r/min條件下培養(yǎng)，當(dāng)葡萄糖濃度低于10g/l時補加高濃度葡萄糖，同時用氨水調(diào)節(jié)ph為6-8，定期取樣測定菌體的od600值。當(dāng)發(fā)酵進行至90h時，胞內(nèi)的維生素b12代謝中間體ado-cbi積累到最大值，此時發(fā)酵液的od600達到43，丙酸濃度達到了30.23g/l，開始進行菌體的膜分離；
(2)費氏丙酸桿菌菌體的膜分離
將膜分離設(shè)備中的各管道清洗干凈，裝入0.1μm卷式膜膜芯(0.25m2)。當(dāng)費氏丙酸桿菌發(fā)酵進行至90h時，將發(fā)酵罐與膜分離設(shè)備連接，開機運行，調(diào)節(jié)壓力為10bar，流量為8lpm，使發(fā)酵液在系統(tǒng)中循環(huán)。卷式膜的初始通量可達到50.34l/(h·m2)，隨時發(fā)酵清液的濾出及菌體濃度的逐漸增大，通量逐漸下降，平均通量可達20.12l/(h·m2)。7l發(fā)酵液濃縮4倍時，濾出液為4.42l，需要3h；
取濃縮液進行稀釋后，進行平板涂布，細胞存活率得到了99.1％；
(3)發(fā)酵液中丙酸的在線的吸附分離
將預(yù)處理好的陰離子交換樹脂zgd630裝填于層析柱中，樹脂裝填量為2.5l，并將層析柱的上樣管道與膜分離設(shè)備的濾過液管道連接，使得膜分離設(shè)備的濾過清液上樣至層析柱中，上樣速度與膜分離設(shè)備的清液濾出速度相同，為4.86l/h，約為3.43bv/h。
上樣結(jié)束后，穿柱液中丙酸的含量為7.35g/l，zgd630樹脂對丙酸的吸附載量達到了44.23mg/g；
(4)維生素b12的細胞離位濃縮轉(zhuǎn)化
將膜分離得到的濃縮了4倍的費氏丙酸桿菌濃縮液轉(zhuǎn)移至另一無菌的反應(yīng)罐內(nèi)，加入3.6mg/l的前體物質(zhì)dmb，于25℃條件下轉(zhuǎn)化80h，轉(zhuǎn)化過程中用氨水調(diào)節(jié)ph為6-7.5，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液于10000r/min條件下離心收集菌體，使用醋酸鹽緩沖液(ph3.5)重懸至原來體積，95℃熱破碎30min，離心取上清，使用hplc分析維生素b12的產(chǎn)量，最終產(chǎn)量為48.6mg/l，ado-cbi轉(zhuǎn)化率達73.2％，折算到發(fā)酵液的體積時，維生素b12的產(chǎn)量為10.25mg/l；
(5)費氏丙酸桿菌桿菌的半連續(xù)發(fā)酵
向步驟(4)中得到的部分移除丙酸后的發(fā)酵穿柱液中補加一定濃度的葡萄糖和玉米漿，使其濃度分別達到60g/l和41g/l，然后接入新鮮的種子培養(yǎng)液，繼續(xù)進行發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵進行至90h時，即維生素b12代謝中間體ado-cbi積累至最大值時，繼續(xù)進行細胞的膜濃縮分離和丙酸的吸附移除，參照步驟(1)-(4)。
當(dāng)將上述操作循環(huán)一次時，丙酸的濃度可達到45.12g/l，維生素b12的濃度達到了18.23mg/l。
從實施例2-4可以看出，本發(fā)明的費氏丙酸桿菌半連續(xù)發(fā)酵工藝，通過模塊化單元操作和過程集成，采用再次接種的方法，完成半連續(xù)發(fā)酵，實現(xiàn)了維生素b12和丙酸的聯(lián)產(chǎn)，丙酸的生產(chǎn)率可達45.12g/l以上，維生素b12生產(chǎn)率可達18.23mg/l以上。
對比例1：批次發(fā)酵
與實施例1相比，除了發(fā)酵進行至48h時，直接在發(fā)酵罐中添加dmb進行維生素b12的轉(zhuǎn)化合成，沒有將細胞與發(fā)酵液進行分離，其他條件與實施例1相同。
實施例2和對比例1的發(fā)酵周期相同，但實施例2的半連續(xù)發(fā)酵提高了丙酸和維生素b12的合成效率，結(jié)果如下表1所示：
表1
從實施例2和對比例1的對比可以看出，本發(fā)明方法提高了發(fā)酵效率和底物轉(zhuǎn)化率，丙酸的轉(zhuǎn)化率相比于批次發(fā)酵提高了33.98％，維生素b12轉(zhuǎn)化率相比于批次發(fā)酵提高了44.56％。
綜上所述，本發(fā)明方法和裝置不僅有效解決了丙酸對發(fā)酵的反饋抑制作用，還克服了擴張床填充效率低，難以放大的劣勢，不僅有效解決了丙酸對發(fā)酵的反饋抑制作用，還克服了擴張床填充效率低，難以放大的劣勢，還有效解決了dmb添加對發(fā)酵廢水資源化利用的不利影響，實現(xiàn)了發(fā)酵廢液的循環(huán)利用。
本發(fā)明未詳細闡述部分屬于本領(lǐng)域公知技術(shù)。
申請人聲明，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，任何屬于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。