本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及病毒檢測領(lǐng)域，更具體涉及一種hbvpgrna的實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測引物組、探針組、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,hbv)感染呈世界性流行，其感染者已超過二十億，是我國目前危害最嚴(yán)重的傳染病之一。2006年全國乙肝流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國目前仍有乙肝表面抗原攜帶者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬，乙肝和肝癌患者約占全球的四分之一。慢性hbv感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和原發(fā)性肝癌的主要原因，并且每年導(dǎo)致1百余萬人死亡，造成極大的社會(huì)危害。研究表明，共價(jià)閉合環(huán)狀dna(cccdna)，松弛環(huán)狀dna(rcdna)和前基因組rna(pgrna)更可能代表活躍的hbv復(fù)制活動(dòng)，它們的檢測可用于推斷和研究病毒體生產(chǎn)力(vp；rcdna/cccdna)，亞病毒顆粒生產(chǎn)力(svp，hbsag/cccdna)和復(fù)制活性(ra；pgrna/cccdna)。而上述檢測指標(biāo)這些可以用于比較hbeag陰性和陽性患者之間的相對(duì)hbv復(fù)制情況差異(趙克開,繆曉輝,zhaoke-kai,等.乙型肝炎病毒cccdna檢測的方法與臨床意義[j].中華肝臟病雜志,2005,13(4):315-317)，從而可用于hbv感染的檢測或鑒定。還有研究表明，在hbeag陽性期內(nèi)，hbvdna水平的降低，與較低的hbvcccdna以及pgrna水平有強(qiáng)相關(guān)性。在hbeag陰性患者中，ihdna水平較高，血清中的hbvdna水平低于預(yù)期。較低的hbvdna/hbsag比率對(duì)應(yīng)于較低的pgrna/cccdna(p<0.01)和較高的s-rna/cccdna比率(p<0.0001)，表明hbeag陰性患者的pgrna的轉(zhuǎn)錄被抑制了(馬艷麗,任萬華.乙肝病毒cccdna的研究進(jìn)展[j].臨床肝膽病雜志,2006,22(3):221-222.)。另外，還有研究表明，hbvpgrna病毒粒子的存在與慢性乙肝(chb)患者中斷nas藥物治療后病毒反彈的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(jiew,taos,huangx,etal.serumhepatitisbvirusrnaisencapsidatedpregenomernathatmaybeassociatedwithpersistenceofviralinfectionandrebound[j].journalofhepatology,2016,65(4):700-710.)。綜上所述監(jiān)控pgrna水平，可以有效地了解hbv在患者體內(nèi)的復(fù)制情況，進(jìn)而有效地檢測和鑒定hbv感染以及指導(dǎo)乙肝用藥。然而，目前對(duì)于hbv的核酸檢測方法主要集中于hbvcccdna。例如中國專利申請(qǐng)201410755640公開了一種hbvcccdna數(shù)字pcr定量檢測試劑盒及其應(yīng)用。中國專利申請(qǐng)201410453981公開了一種lamp法檢測石蠟包埋肝組織中hbvcccdna的引物和試劑盒。中國專利申請(qǐng)201210576370公開了cccdna標(biāo)準(zhǔn)品及其制備方法、定量檢測乙肝病毒cccdna的方法及試劑盒。目前并沒有針對(duì)hbvpgrna的商品化的熒光pcr檢測試劑盒，而用于hbvpgrna的檢測方法也比較少。例如，中國專利申請(qǐng)201610364652公開了一種檢測乙型肝炎患者血液中hbvpgrna的方法、試劑盒及其應(yīng)用，其有記載的準(zhǔn)確檢出的最低檢出限為1×103copies/ml。現(xiàn)有技術(shù)對(duì)hbvpgrna檢測的靈敏度仍不能滿足實(shí)際需求，其靈敏度僅為1×103copies/ml左右為了有效降低和控制hbv感染造成的經(jīng)濟(jì)損失，需要建立一種有效的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)hbvpgrna的快速和高靈敏性的檢測。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種hbvpgrna的實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測方法以及用于檢測hbvpgrna的引物組和探針組及試劑盒。術(shù)語：“w/v”指質(zhì)量-體積濃度。一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測hbvpgrna的檢測引物組和檢測探針組。所述的檢測引物組和檢測探針組包括：引物組1和探針組1；或引物組2和探針組2。所述的引物組1包括以下4條引物：引物f1：其核苷酸序列為5’-tggtgtcttttggagtgtggat-3’(seqidno：1)，引物r1：其核苷酸序列為5’-ccaccttatgtgtccaaggaatact-3’(seqidno：2)，引物f2：其核苷酸序列為5’-ttcacctcaccatacggcactcaggc-3’(seqidno：3)，和引物r2：其核苷酸序列為5’-atgaatgtcaggaaaagaaggagtttgcc-3’(seqidno：4)。所述的探針組1包括以下兩條探針：探針p1：其核苷酸序列為5’-cgcactcctcctgcatatagaccatcaaa-3’(seqidno：5)，其5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，所述的熒光基團(tuán)為fam、hex、vic、cy5和tet中的一種；其3’端標(biāo)記有的淬滅基團(tuán)，所述的淬滅基團(tuán)為tamra、mgb和bhq中的一種，和探針p2：5’-tctcaatcgccgcgtcgca-3’(seqidno：6)，其5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，所述的熒光基團(tuán)為fam、hex、vic、cy5和tet中的一種；其3’端標(biāo)記有的淬滅基團(tuán)，所述的淬滅基團(tuán)為tamra、mgb和bhq中的一種；探針p1和探針p2應(yīng)具有相同的熒光基團(tuán)。所述的引物組2包括以下4條引物：引物f3：其核苷酸序列為5’-tttggtgtcttttggagtgtgga-3’(seqidno：7)，引物r3：其核苷酸序列為5’-cttatgtgtccaaggaatactaa-3’(seqidno：8)，引物f4：其核苷酸序列為5’-gttcacctcaccatacggcactcagg-3’(seqidno：9)，和引物r4：其核苷酸序列為5’-tgaatgtcaggaaaagaaggagtttgcca-3’(seqidno：10)。所述的探針組2包括以下兩條探針：探針p3：其核苷酸序列為5’-ttcgcactcctcctgcatatagaccatca-3’(seqidno：11)，其5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，所述的熒光基團(tuán)為fam、hex、vic、cy5和tet中的一種；其3’端標(biāo)記有的淬滅基團(tuán)，所述的淬滅基團(tuán)為tamra、mgb和bhq中的一種，和探針p4：其核苷酸序列為5’-ctcaatcgccgcgtcgca-3’(seqidno：12)，其5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，所述的熒光基團(tuán)為fam、hex、vic、cy5和tet中的一種；其3’端標(biāo)記有的淬滅基團(tuán)，所述的淬滅基團(tuán)為tamra、mgb和bhq中的一種；探針p3和探針p4應(yīng)具有相同的熒光基團(tuán)。上述檢測引物組和檢測探針是根據(jù)hbvpgrna序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)完成的，可用于實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)hbvcccdna的檢測。另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測hbvpgrna的試劑盒，所述的試劑盒包括上述檢測引物組和檢測探針組。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的試劑盒還包括酶系；所述的酶系包括：(1)tfldna聚合酶；(2)mmlv反轉(zhuǎn)錄酶；(3)stoffel片段。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的試劑盒還包括反應(yīng)試劑；所述的反應(yīng)試劑包括：(1)tris-硫酸；(2)mops緩沖液；(3)檸檬酸鈉；(4)(nh4)2so4；(5)mgso4；(6)聚氧乙烯月桂醚(brij-35)；(7)乙酰化bsa。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的試劑盒還包括陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。所述的陰性對(duì)照品為生理鹽水。所述的陽性對(duì)照品為采用本發(fā)明所述的檢測引物組對(duì)hbv基因組擴(kuò)增所獲得的擴(kuò)增片段。該擴(kuò)增片段的長度為512bp。再一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種hbvpgrna的實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測方法，所述的檢測方法包括以下步驟：(1)病毒rna的提取；(2)實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr反應(yīng)：實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr反應(yīng)體系為：實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊剑?5℃，20～45分鐘；94～96℃，2分鐘；第二步：94～95℃，15～30秒；65～69℃，30～75秒；68～72℃，30～40秒；6～9個(gè)循環(huán)；第三步：93～95℃，15～20秒；60℃，30秒；68～72℃，30秒；8個(gè)循環(huán)；第四步：93～95℃，15秒；52～55℃，30～60秒；40個(gè)循環(huán)；55℃時(shí)收集熒光；(3)結(jié)果判定：判定：1)陽性：檢測樣本ct值小于等于35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期；2)可疑：檢測樣本ct值大于35.0且小于40.0，重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果ct值小于40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性；3)陰性：檢測不到樣本ct值或ct值為40。所述的檢測方法步驟(1)病毒rna的提取可根據(jù)樣本的類型使用本領(lǐng)域常規(guī)的提取方法，或使用由商業(yè)途徑獲得的試劑盒進(jìn)行提取。所述的檢測方法步驟(2)中的pcrmix包括：48mm的ph8.5的tris-硫酸、18mm的ph7.9的mops緩沖液、3mm的檸檬酸鈉、20mm的(nh4)2so4、7mm的mgso4、0.10％(w/v)的聚氧乙烯月桂醚、0.1mg/ml的乙?；痓sa、300～800nm的檢測引物組、100～300nm的檢測探針組、420mm的dntp。所述的檢測方法步驟(2)中的酶混合液包括tfldna聚合酶、mmlv反轉(zhuǎn)錄酶和stoffel片段。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：(1)本發(fā)明提供了特異性引物探針組，用以擴(kuò)增肝組織中的hbvpgrna，而不會(huì)將hbv的其他轉(zhuǎn)錄本(如s-rna)擴(kuò)增出來。(2)本發(fā)明提供的用于檢測hbvpgrna的檢測引物組和檢測探針組對(duì)于hbvpgrna擴(kuò)增的特異性強(qiáng)，能夠有效地提高檢測準(zhǔn)確性、特異性以及靈敏性。(3)本發(fā)明提供了一種肝組織中hbvpgrna的實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測方法及試劑盒，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)肝組織中的hbvpgrna進(jìn)行快速檢測，應(yīng)用極為方便。由于引入了更適合rna擴(kuò)增的tris、mops緩沖液和檸檬酸鈉，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強(qiáng)，從而避免了普通rt-pcr方法特異性不高，以及無法對(duì)低濃度模版進(jìn)行定量的缺點(diǎn)。(4)本發(fā)明還引入了stoffel片段和tfldna聚合酶的雙聚合酶的擴(kuò)增方法。其中stoffel片段為去除5’-3’外切酶活性結(jié)構(gòu)域的taqdna聚合酶，去除5’-3’外切酶活性的同時(shí)，恢復(fù)了少量3’-5’外切酶的校正活性，彌補(bǔ)了tfldna聚合酶特異性不足的缺陷。而tfldna聚合酶則提供切除taqman探針的5’-3’外切酶活性。(5)stoffel片段和tfldna聚合酶耐抑制劑能力都較強(qiáng)，使得根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的熒光rt-pcr試劑盒中可以加入更多的模版。從而可以用于提升靈敏度。(6)本發(fā)明所提供的檢測方法，與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr不同，本發(fā)明采用多個(gè)循環(huán)程序，并提高引物退火溫度，使檢測方法達(dá)到極高的靈敏度及特異性?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的試劑盒適合在各級(jí)疾控單位和醫(yī)院進(jìn)行推廣，具有廣泛的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為實(shí)驗(yàn)例1中hbvpgrna的檢測結(jié)果。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。對(duì)所公開的實(shí)施例的下述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例中，而是可以應(yīng)用于符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一致的更寬的范圍。除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)試驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行；所述試劑盒生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1一種用于檢測hbvpgrna的檢測引物組和檢測探針組檢測引物組包括以下4條引物：引物f1：其核苷酸序列為5’-tggtgtcttttggagtgtggat-3’(seqidno：1)，引物r1：其核苷酸序列為5’-ccaccttatgtgtccaaggaatact-3’(seqidno：2)，引物f2：其核苷酸序列為5’-ttcacctcaccatacggcactcaggc-3’(seqidno：3)，和引物r2：其核苷酸序列為5’-atgaatgtcaggaaaagaaggagtttgcc-3’(seqidno：4)。檢測探針組包括以下兩條探針：探針p1：其核苷酸序列為5’-cgcactcctcctgcatatagaccatcaaa-3’(seqidno：5)，其5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)fam，其3’端標(biāo)記有的淬滅基團(tuán)bhq1；和探針p2：5’-tctcaatcgccgcgtcgca-3’(seqidno：6)，其5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)fam，其3’端標(biāo)記有的淬滅基團(tuán)bhq1。檢測引物組和探針組的設(shè)計(jì)選擇跨cgene和pgene區(qū)域。實(shí)施例2一種用于檢測hbvpgrna的檢測引物組和檢測探針組檢測引物組包括以下4條引物：引物f3：其核苷酸序列為5’-tttggtgtcttttggagtgtgga-3’(seqidno：7)，引物r3：其核苷酸序列為5’-cttatgtgtccaaggaatactaa-3’(seqidno：8)，引物f4：其核苷酸序列為5’-gttcacctcaccatacggcactcagg-3’(seqidno：9)，和引物r4：其核苷酸序列為5’-tgaatgtcaggaaaagaaggagtttgcca-3’(seqidno：10)。檢測探針組包括以下兩條探針：探針p3：其核苷酸序列為5’-ttcgcactcctcctgcatatagaccatca-3’(seqidno：11)，其5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)fam，其3’端標(biāo)記有的淬滅基團(tuán)bhq1；和探針p4：其核苷酸序列為5’-ctcaatcgccgcgtcgca-3’(seqidno：12)，其5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)fam，其3’端標(biāo)記有的淬滅基團(tuán)bhq1。檢測引物組和探針組的設(shè)計(jì)選擇跨cgene和pgene區(qū)域。實(shí)施例3一種用于檢測hbvpgrna的試劑盒該試劑盒包括：(1)實(shí)施例1中的檢測引物組和檢測探針組；(2)酶系：1)tfldna聚合酶；2)mmlv反轉(zhuǎn)錄酶；3)stoffel片段；(3)反應(yīng)試劑：1)tris-硫酸；2)mops緩沖液；3)檸檬酸鈉；4)(nh4)2so4；5)mgso4；6)聚氧乙烯月桂醚(brij-35)；7)乙酰化bsa；(4)陰性對(duì)照品：生理鹽水。(5)陽性對(duì)照品：以實(shí)施例1中的檢測引物組對(duì)hbv基因組擴(kuò)增所獲得的擴(kuò)增片段，該擴(kuò)增片段的長度為512bp。實(shí)施例4一種用于檢測hbvpgrna的試劑盒該試劑盒包括：(1)實(shí)施例2中的檢測引物組和檢測探針組；(2)酶系：1)tfldna聚合酶；2)mmlv反轉(zhuǎn)錄酶；3)stoffel片段；(3)反應(yīng)試劑：1)tris-硫酸；2)mops緩沖液；3)檸檬酸鈉；4)(nh4)2so4；5)mgso4；6)聚氧乙烯月桂醚(brij-35)；7)乙?；痓sa；(4)陰性對(duì)照品：生理鹽水。(5)陽性對(duì)照品：以實(shí)施例2中的檢測引物組對(duì)hbv基因組擴(kuò)增所獲得的擴(kuò)增片段，該擴(kuò)增片段的長度為512bp。實(shí)施例5一種hbvpgrna的實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測方法及其應(yīng)用一、采用實(shí)施例4所述的試劑盒進(jìn)行檢測。二、樣本來源：肝組織(活檢)樣品，采集自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院。三、檢測方法：(1)病毒rna的提取：稱取50mg肝組織樣本，液氮下研磨成粉末；加入140ml用depc處理水配制的pbs緩沖液溶解；采用購自北京天根tiangen公司的病毒檢測用rna提取試劑盒(離心柱型，貨號(hào)：sd101)，按照說明書方法進(jìn)行病毒rna的提取(在第一次洗滌步驟之前，加入dnasei2u，37℃孵育15min)，獲得待測rna樣品；(2)制備陽性質(zhì)控品：利用實(shí)施例4試劑盒中的陽性對(duì)照品，按常規(guī)方法合成ms2假病毒，作為陽性質(zhì)控品；(3)實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr反應(yīng)：實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr反應(yīng)體系為：其中，pcrmix的成分見下表：成分濃度ph8.5的tris-硫酸48mmph7.9的mops緩沖液18mm檸檬酸鈉3mm(nh4)2so420mmmgso47mmbrij-350.10％(w/v)乙?；痓sa0.1mg/ml引物f380nm引物r380nm引物f4300nm引物r4300nm探針p3120nm探針p4120nmdntp420mm其中，酶混合液的成分見下表：酶添加量tfldna聚合酶2u/μl，(購自美國abi公司)1μlmmlv反轉(zhuǎn)錄酶200u/μl，(購自深圳菲鵬生物)0.5μlstoffel片段5u/μl(購自cetus公司)1μl將上述反應(yīng)體系混勻后，將各反應(yīng)管放入定量pcr儀器(購自安捷倫公司，貨號(hào)mx3000p熒光pcr儀)的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置各檢測的名稱和熒光基團(tuán)種類(設(shè)置hbvpgrna的報(bào)告基團(tuán)為fam，淬滅基團(tuán)選擇none)，設(shè)定rt-pcr反應(yīng)程序：第一步：45℃，40分鐘；94℃，2分鐘；第二步：94℃，15秒；65℃，30秒；72℃，30秒；8個(gè)循環(huán)；第三步：94℃，15秒；60℃，30秒；72℃，30秒；8個(gè)循環(huán)；第四步：94℃，15秒；53℃，50秒；40個(gè)循環(huán)；55℃時(shí)收集熒光；(3)結(jié)果判定：1)陽性質(zhì)控品顯示陽性；2)陰性對(duì)照品顯示陰性；對(duì)比實(shí)驗(yàn)1一、采用實(shí)施例4所述的試劑盒進(jìn)行檢測。二、檢測方法：基本同實(shí)施例5，區(qū)別為：將酶混合液的成分替換為下表：酶添加量tfldna聚合酶2u/μl，(購自美國abi公司)1μlmmlv反轉(zhuǎn)錄酶200u/μl，(購自深圳菲鵬生物)0.5μl對(duì)比實(shí)驗(yàn)2一、采用實(shí)施例4所述的試劑盒進(jìn)行檢測。二、檢測方法：基本同實(shí)施例5，區(qū)別為：將pcrmix的成分替換為下表：對(duì)比實(shí)驗(yàn)3一、采用實(shí)施例4所述的試劑盒進(jìn)行檢測。二、檢測方法：基本同實(shí)施例5，區(qū)別為：將pcrmix的成分替換為下表：成分濃度ph8.5的tris-hcl66mm(nh4)2so420mmmgso47mmbrij-350.10％(w/v)乙?；痓sa0.1mg/ml引物f380nm引物r380nm引物f4300nm引物r4300nm探針p3120nm探針p4120nmdntp420mm并且將酶混合液的成分替換為下表：對(duì)比實(shí)驗(yàn)4一、采用實(shí)施例4所述的試劑盒進(jìn)行檢測。二、檢測方法：基本同對(duì)比實(shí)驗(yàn)3，區(qū)別為：將待測rna樣品的添加量降低至5μl，并使用depc處理水將rt-pcr體系補(bǔ)足50μl。實(shí)驗(yàn)例1特異性和靈敏度試驗(yàn)分別采用實(shí)施例5和對(duì)比實(shí)驗(yàn)1-4中的檢測方法對(duì)對(duì)血清hbvdna檢測為2.57x106iu/ml(使用廣州海力特生物的hbvdna檢測試劑盒，國械注準(zhǔn)20163400199)的病人，取肝組織活檢樣本進(jìn)行檢測，hbvpgrna的檢測結(jié)果如圖1所示，其中曲線1-5分別為實(shí)施例5、對(duì)比實(shí)驗(yàn)1-4的擴(kuò)增曲線。分組樣本量擴(kuò)增結(jié)果(ct值)實(shí)施例525μl18.14對(duì)比實(shí)驗(yàn)125μl無擴(kuò)增對(duì)比實(shí)驗(yàn)225μl19.65對(duì)比實(shí)驗(yàn)325μl無擴(kuò)增對(duì)比實(shí)驗(yàn)45μl20.12檢測結(jié)果顯示：采用對(duì)比實(shí)驗(yàn)1的檢測方法結(jié)果無擴(kuò)增。說明采用常規(guī)方法只采用tfldna聚合酶對(duì)某些樣品無法實(shí)現(xiàn)正常擴(kuò)增，從而影響檢測的準(zhǔn)確性；而本發(fā)明提供的stoffel片段和tfldna聚合酶的雙聚合酶的擴(kuò)增方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)常規(guī)檢測方法難以正常擴(kuò)增的疑難樣品的擴(kuò)增，因此具有更高的靈敏性的正確性。采用對(duì)比實(shí)驗(yàn)2的檢測方法檢測待測樣品的ct值為19.65，顯示陽性。雖然該方法也能獲得陽性檢出，然而根據(jù)靈敏度檢測，對(duì)比實(shí)驗(yàn)1檢測方法的靈敏度明顯低于實(shí)施例5的檢測方法。采用對(duì)比實(shí)驗(yàn)3和4的檢測方法分別得到無擴(kuò)增以及20.12的ct值，說明雖然在樣本添加體積較小時(shí)(例如5μl)，常規(guī)的taqdna聚合酶和mmlv反轉(zhuǎn)錄酶的檢測方法能夠獲得擴(kuò)增，然而當(dāng)樣本體積增加到一定程度時(shí)(比如25μl)，常規(guī)的taqdna聚合酶和mmlv反轉(zhuǎn)錄酶的檢測方法無法對(duì)抗pcr體系中不可避免的抑制劑，因此無法獲得擴(kuò)增。而本發(fā)明提供的檢測方法則能夠在樣本添加體積較大時(shí)(例如25μl)獲得正常的擴(kuò)增，說明本發(fā)明提供的檢測方法耐抑制劑能力較強(qiáng)，也就是rt-pcr反應(yīng)體系中可以加入更多的模版，從而可以用于提升靈敏度和檢測的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)例2最低檢出限待測樣品：肝組織(活檢)樣品，采集自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院。采用hbv陰性血清對(duì)待測樣品進(jìn)行梯度稀釋，分別采用本發(fā)明實(shí)施例5的檢測方法和現(xiàn)有技術(shù)中的檢測方法(例如中國專利申請(qǐng)201610202753、201610364652)對(duì)稀釋后的樣品進(jìn)行hbvpgrna檢測，直至到無法獲得擴(kuò)增的稀釋度為止，檢測結(jié)果如下：檢測方法無法獲得擴(kuò)增的稀釋度本發(fā)明實(shí)施例5106201610202753103201610364652102實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)樣本稀釋度高達(dá)106時(shí)，本發(fā)明提供的檢測方法依然能夠成功獲得擴(kuò)增和檢測結(jié)果。而現(xiàn)有技術(shù)在樣品稀釋度到103和102時(shí)，已無法獲得擴(kuò)增，說明本發(fā)明提供的檢測方法的靈敏度明顯高于現(xiàn)有技術(shù)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>廣州海力特生物科技有限公司<120>一種hbvpgrna的實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測引物組、探針組、試劑盒及方法<130>2017/03/15<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1tggtgtcttttggagtgtggat22<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列<400>2ccaccttatgtgtccaaggaatact25<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列<400>3ttcacctcaccatacggcactcaggc26<210>4<211>29<212>dna<213>人工序列<400>4atgaatgtcaggaaaagaaggagtttgcc29<210>5<211>29<212>dna<213>人工序列<400>5cgcactcctcctgcatatagaccatcaaa29<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6tctcaatcgccgcgtcgca19<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7tttggtgtcttttggagtgtgga23<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8cttatgtgtccaaggaatactaa23<210>9<211>26<212>dna<213>人工序列<400>9gttcacctcaccatacggcactcagg26<210>10<211>29<212>dna<213>人工序列<400>10tgaatgtcaggaaaagaaggagtttgcca29<210>11<211>29<212>dna<213>人工序列<400>11ttcgcactcctcctgcatatagaccatca29<210>12<211>18<212>dna<213>人工序列<400>12ctcaatcgccgcgtcgca18當(dāng)前第1頁12