本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種用于檢測支原體的pcr引物、陽性質(zhì)粒及其構(gòu)建方法、試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
：支原體(mycoplasma)也稱作霉形體，其是一類缺乏細胞壁的原核微生物。支原體介于細菌和病毒之間，可在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖，其結(jié)構(gòu)簡單、個體微小，形態(tài)成分枝狀或絲狀，能通過一般的微孔濾膜濾器(0.22-0.45μm)。自1956年robinson等首次從細胞培養(yǎng)中分離出支原體以來，國內(nèi)外關(guān)于支原體污染細胞和疫苗等生物制品的報道屢見不鮮，細胞培養(yǎng)物被支原體污染成為了極普遍的問題。kuppeve等應(yīng)用多種檢測方法發(fā)現(xiàn)歐洲各實驗室的細胞系均有不同程度的支原體污染。在中國，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所通過檢測發(fā)現(xiàn)國內(nèi)來源的細胞株系受支原體污染率達到60％。目前已知有20多種支原體可以造成細胞培養(yǎng)的污染，其中又以口腔支原體、精氨酸支原體、發(fā)酵支原體、萊氏無膽甾原體和豬鼻支原體5種支原體為主。在細胞培養(yǎng)過程中，工作環(huán)境、實驗器材、培養(yǎng)基及操作者本身都是污染的來源，因此都會存在支原體污染的風(fēng)險。而支原體污染后會與細胞長期共存，對細胞生長產(chǎn)生不同程度的抑制作用，改變生產(chǎn)細胞的目的基因及其蛋白的表達，也會造成細胞轉(zhuǎn)染效率降低，并且在污染的后期導(dǎo)致細胞變形，對教學(xué)、科研以及生產(chǎn)都會產(chǎn)生嚴重的影響。因此，檢測細胞培養(yǎng)中支原體污染十分必要，且應(yīng)該進行定期檢測監(jiān)控。用于檢測細胞培養(yǎng)中支原體污染的方法有多種，常用的有分離培養(yǎng)法、dna熒光染色法、pcr法、探針法、elisa等多種方法。其中pcr技術(shù)作為一種快速、靈敏、特異且簡便的基因診斷技術(shù)已廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和疾病的診斷。1989年首次報告有應(yīng)用pcr方法檢測診斷支原體感染，隨后不斷出現(xiàn)用pcr方法檢測各種支原體。至今很多檢測支原體的pcr方法在引物選擇上都使用16srrna序列的保守區(qū)，但若使用一步法pcr，這些設(shè)計的引物都難以避免與生態(tài)學(xué)上相關(guān)的細菌有交叉反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，又或者出現(xiàn)部分特異性好的引物不能擴增出多數(shù)常見支原體的dna，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于此，有必要提供一種檢測準(zhǔn)確性高、且能夠用于多種別支原體檢測的用于檢測支原體的pcr引物、陽性質(zhì)粒及其構(gòu)建方法、試劑盒及檢測方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下。一種用于檢測支原體的pcr引物，所述pcr引物的序列分別如seqidno:1和seqidno:2所示。本發(fā)明創(chuàng)造性地通過比較選擇不同種別的支原體中所共有的保守序列進行pcr引物的設(shè)計選擇，設(shè)計特異性的pcr引物用于擴增支原體16srna和23srna間的間隔區(qū)的一端基因片段(序列如seqidno:5所示)，該基因片段涵蓋多數(shù)的支原體種別，因而可以用于針對多種別的支原體進行pcr擴增檢測。并且由于各種別間隔區(qū)基因結(jié)構(gòu)不同，從而可以根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小和酶切部位的不同，作為鑒別種別的根據(jù)，為支原體的種別鑒定提供了技術(shù)支持。一種用于檢測支原體的陽性質(zhì)粒的構(gòu)建方法，使用含限制性內(nèi)切酶識別位點序列及seqidno:1所示序列的上游引物和含限制性內(nèi)切酶識別位點序列及seqidno:2所示序列的下游引物對含有支原體的模板進行pcr擴增，并將pcr擴增得到的產(chǎn)物酶切后轉(zhuǎn)入同樣酶切的表達載體中，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌細胞，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒即得。在其中一個實施例中，所述上游引物中限制性內(nèi)切酶識別位點序列為bamhi識別位點序列，所述上游引物的序列如seqidno:3所示；所述下游引物中限制性內(nèi)切酶識別位點序列為ecori識別位點序列，所述下游引物的序列如seqidno:4所示。在其中一個實施例中，pcr擴增程序為：95℃變性2～5min后進入循環(huán)，循環(huán)的參數(shù)為95℃，30s；58℃，30s；72℃，30～40s，30～40個循環(huán)后在72℃延伸5～7min。在其中一個實施例中，所述表達載體是pcdna3.1(+)。在其中一個實施例中，在將pcr擴增得到的產(chǎn)物酶切后轉(zhuǎn)入同樣酶切的表達載體中時，將pcr擴增得到的產(chǎn)物與表達載體分別酶切后，再按照物質(zhì)的量8～3:1的比例將酶切后的pcr擴增得到的產(chǎn)物與酶切后的表達載體混合，并加入t4dna連接酶進行連接反應(yīng)。在其中一個實施例中，所述細菌細胞為e.colidh5α感受態(tài)細胞。一種用于檢測支原體的陽性質(zhì)粒，采用上述任一實施例所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到。一種用于檢測支原體的試劑盒，包括含有pcr引物的試劑和陽性質(zhì)粒，所述含有pcr引物的試劑中的pcr引物的序列分別如seqidno:1和seqidno:2所示，所述陽性質(zhì)粒為上述用于檢測支原體的陽性質(zhì)粒。在其中一個實施例中，所述含有pcr引物的試劑中pcr引物的濃度是4μm，所述含有pcr引物的試劑中還含有1～1.5u的taqdna聚合酶、濃度為150～200μm的dntp以及濃度為1.8～2.5mm的mg2+。一種細胞培養(yǎng)時支原體的檢測方法，使用上述用于檢測支原體的試劑盒，所述檢測方法包括如下步驟：直接將待測的細胞培養(yǎng)樣品與所述含有pcr引物的試劑混合，進行pcr擴增；以所述陽性質(zhì)粒為模板與所述含有pcr引物的試劑混合，進行pcr擴增；比較所述待測的細胞培養(yǎng)樣品與所述陽性質(zhì)粒的pcr擴增結(jié)果。在檢測時(包括上述陽性質(zhì)粒的構(gòu)建時)，pcr擴增通過優(yōu)化的pcr擴增程序，可以有效的擴增出所需的片段，如在其中一個實施例中，優(yōu)化的pcr擴增程序為：95℃變性2～5min后進入循環(huán)，循環(huán)的參數(shù)為95℃，30s；58℃，30s；72℃，30～40s，30～40個循環(huán)后在72℃延伸5～7min。上述用于檢測支原體的pcr引物、陽性質(zhì)粒及其構(gòu)建方法、試劑盒及檢測方法靈敏度和檢測準(zhǔn)確性高，可檢測出核酸含量低至103拷貝/μl以及稀釋倍數(shù)高達64倍的受污染的細胞培養(yǎng)樣品。該試劑盒及檢測方法使用簡單，可以免去樣品預(yù)處理(煮沸)節(jié)省操作時間和污染風(fēng)險，操作簡便，可大批量生產(chǎn)和推廣應(yīng)用于支原體尤其是細胞培養(yǎng)物中支原體的檢測。附圖說明圖1為16srrna和23srrna間的間隔區(qū)特異性片段獲取電泳圖，其中m為dnamaker，dnamakeriii；1、2均為陽性細胞樣品模板；3為以ddh2o為模板的陰性對照。圖2為重組的陽性參照質(zhì)粒zyt-pcdna的菌液pcr鑒定結(jié)果圖，其中m為dnamaker，dnamakeriii；1～5：篩選后的菌液樣品；6：以ddh2o為模板的陰性對照。圖3為重組質(zhì)粒zyt-pcdna酶切鑒定圖，其中m為dnamaker，dnamakeri；1：ecori和bamhi兩種內(nèi)切酶雙酶切的質(zhì)粒zyt-pcdna；2：不酶切的質(zhì)粒zyt-pcdna；3：以ddh2o為模板的陰性對照。圖4為基于陽性參照的靈敏度測試結(jié)果圖，其中m為dnamaker，dnamakeriii；1：拷貝數(shù)為1.16×109拷貝/μl的陽性參照質(zhì)粒；2：拷貝數(shù)為1.16×108拷貝/μl的陽性參照質(zhì)粒；3：拷貝數(shù)為1.16×107拷貝/μl的陽性參照質(zhì)粒；4：拷貝數(shù)為1.16×106拷貝/μl的陽性參照質(zhì)粒；5：拷貝數(shù)為1.16×105拷貝/μl的陽性參照質(zhì)粒；6：拷貝數(shù)為1.16×104拷貝/μl的陽性參照質(zhì)粒；7：拷貝數(shù)為1.16×103拷貝/μl的陽性參照質(zhì)粒；8：陰性對照。圖5為檢測陽性細胞樣品的靈敏度測試結(jié)果圖，其中m為dnamaker，50kbdnaladder；1：稀釋倍數(shù)為8倍的細胞樣品；2：稀釋倍數(shù)為16倍的細胞樣品；3：稀釋倍數(shù)為32倍的細胞樣品；4：稀釋倍數(shù)為64倍的細胞樣品；5：陽性參照；6：陰性對照。圖6為預(yù)混pcr反應(yīng)試劑2×mycoplasmapcrmastermix對細胞培養(yǎng)物的檢測分析結(jié)果圖，其中m為dnamaker，dnamakeri；1：受污染的細胞培養(yǎng)上清液(cho)；2：受污染的細胞培養(yǎng)上清液(293t)；3：受污染的細胞懸液(jurkat)；4：無污染的細胞培養(yǎng)上清液(cho)；5：無污染的細胞培養(yǎng)上清液(293t)；6：無污染的細胞培養(yǎng)上清液(jurkat)；7：無污染的細胞懸液(cho)；8：無污染的細胞懸液(jurkat)；9：陽性參照；10：陰性對照。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對本發(fā)明進行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。下述實施例中的實驗材料，若無特別說明，均是來源于商業(yè)途徑。所述的實驗方法，若無特別說明，均為通用實驗方法。實施例1：陽性質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定(1)16srrna和23srrna間的間隔區(qū)特異性片段的獲取以已知受支原體污染的細胞培養(yǎng)物為模板，利用引物p1/p2擴增16srrna和23srrna間的間隔區(qū)特異性片段，并在上下游中分別引入bamhi和ecori酶切位點，并在酶切位點前添加5個保護性堿基，引物序列如下：p1：5'-gatcagaattcgggagcaaacaggattagtatccct-3'(seqidno:3)；p2：5'-catacggatcctgcaccatctgtcactctgttaccctc-3'(seqidno:4)。引物p1/p2擴增條件為：95℃變性2min后進入循環(huán)；循環(huán)參數(shù)為：95℃30s，58℃30s，72℃30s；35個循環(huán)后72℃延伸7min。將圖1所示的pcr產(chǎn)物純化回收后于-20℃保存?zhèn)溆谩?2)質(zhì)粒zyt-pcdna的構(gòu)建與鑒定分別以擴增的16srrna和23srrna間的間隔區(qū)特異性片段和載體pcdna3.1(+)(賽默飛公司)為底物，用bamhi和ecori雙酶切后，兩者按照物質(zhì)的量比例為3:1混合，利用takara公司的t4dnaligase按照使用說明于16℃下過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh5α感受態(tài)細胞，進行氨芐抗性平板篩選，進行菌液pcr(如圖2)獲得陽性質(zhì)粒種菌。陽性質(zhì)粒種菌進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，獲得重組的陽性質(zhì)粒zyt-pcdna。用bamhi和ecori對獲得的質(zhì)粒進行酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示，并對該質(zhì)粒進行序列測定，如seqidno:1所示，鑒定結(jié)果證實構(gòu)建正確。將菌液按3:1與石蠟混合，作種菌保存于-20℃。(3)陽性參照的獲得取保存的種菌擴大培養(yǎng)，按1:1000比例加入新的lb培養(yǎng)基中，培育16h后，提取質(zhì)粒zyt-pcdna，溶于eb溶液中，作為陽性參照。實施例2：預(yù)混pcr反應(yīng)試劑2×mycoplasmapcrmastermix的配制將引物p3/p4按照4μm的濃度溶解于含有1u的taqdna聚合酶、150μmdntp以及2.0mmmg2+的mix溶液中，獲得2×mycoplasmapcrmastermix，其引物序列如下：p3：5'-gggagcaaacaggattagtatccct-3'(seqidno:1)；p4：5'-tgcaccatctgtcactctgttaccctc-3'(seqidno:2)。實施例3：支原體檢測試劑盒靈敏度分析(1)基于陽性參照質(zhì)粒的靈敏度分析將陽性質(zhì)粒種菌進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，利用dna濃度測定儀測定質(zhì)粒濃度。根據(jù)公式：拷貝數(shù)(copies/μl)＝[(質(zhì)粒濃度ng/μl×10-9)×(6.02×1023)]÷(陽性參照質(zhì)粒長度×660)，計算陽性參照質(zhì)粒的拷貝數(shù)。將陽性參照質(zhì)粒按10倍梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別從10倍到107倍。以各稀釋倍數(shù)的陽性參照質(zhì)粒為模板，利用2×mycoplasmapcrmastermix進行pcr擴增，其反應(yīng)體系如下：pcr擴增條件為：95℃變性2min后進入循環(huán)；循環(huán)參數(shù)為：95℃30s，58℃30s，72℃30s；30個循環(huán)后72℃延伸7min。pcr產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠上跑電泳，電壓100v下進行40min。于紫外下觀察，本檢測方法靈敏度高，在103拷貝/μl下仍可以擴增出270bp左右的目的條帶，結(jié)果如圖4。(2)基于陽性細胞樣品的靈敏度分析將陽性質(zhì)粒按2倍梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別從4倍到64倍。以各稀釋倍數(shù)的陽性細胞樣品為模板，利用2×mycoplasmapcrmastermix進行pcr擴增，其反應(yīng)體系如下：組分體積(μl)2×mycoplasmapcrmastermix10ddh2o8模板(細胞樣品或ddh2o)2總體積20pcr擴增條件為：95℃變性2min后進入循環(huán)；循環(huán)參數(shù)為：95℃30s，58℃30s，72℃30s；30個循環(huán)后72℃延伸7min。pcr產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠上跑電泳，電壓100v下進行40min。于紫外下觀察，本檢測方法對細胞樣品的靈敏度高，稀釋64倍的陽性細胞樣品仍可以擴增出270bp左右的目的條帶，結(jié)果如圖5。上述實驗結(jié)果表明：(1)本支原體檢測方法的靈敏度高，可以檢測出核酸含量低至103拷貝/μl以及稀釋倍數(shù)高達64倍的受污染的細胞樣品；(2)試劑盒操作方便，僅需按體系要求加入樣品即可；(3)耗時短，2h左右即可獲得檢測結(jié)果。實施例4預(yù)混pcr反應(yīng)試劑2×mycoplasmapcrmastermix對細胞培養(yǎng)物的檢測分析利用預(yù)混pcr反應(yīng)試劑2×mycoplasmapcrmastermix分別對確認受支原體污染的細胞培養(yǎng)上清液和細胞懸液、無支原體污染的細胞培養(yǎng)上清液及細胞懸液進行pcr擴增，其體系如下：組分體積(μl)2×mycoplasmapcrmastermix10ddh2o8模板(細胞樣品或ddh2o)2總體積20pcr擴增條件為：95℃變性2min后進入循環(huán)；循環(huán)參數(shù)為：95℃30s，58℃30s，72℃30s；30個循環(huán)后72℃延伸7min。pcr產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠上跑電泳，電壓100v下進行40min。于紫外下觀察，確認受污染的3個細胞培養(yǎng)樣品均可擴增出270bp左右的目的條帶，確認無支原體污染的5個細胞培養(yǎng)樣品均無擴增條帶，如圖6。上述實驗結(jié)果表明：本支原體檢測試劑可適用于檢測細胞培養(yǎng)的上清液或細胞懸液是否有支原體的污染，能擴增出目的條帶的說明受支原體污染，無擴增條帶的說明不受支原體污染。以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。sequencelisting<110>廣東順德工業(yè)設(shè)計研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計研究院）<120>用于檢測支原體的pcr引物、陽性質(zhì)粒及其構(gòu)建方法、試劑盒及檢測方法<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>25<212>dna<213>人工序列<400>1gggagcaaacaggattagtatccct25<210>2<211>27<212>dna<213>人工序列<400>2tgcaccatctgtcactctgttaccctc27<210>3<211>36<212>dna<213>人工序列<400>3gatcagaattcgggagcaaacaggattagtatccct36<210>4<211>38<212>dna<213>人工序列<400>4catacggatcctgcaccatctgtcactctgttaccctc38<210>5<211>272<212>dna<213>天然序列<400>5gggagcaaacaggattagtatccctggtagtccacgccgtaaacgatgatcattagttgg60tggaataatttcactaacgcagctaacgcgttaaatgatccgcctgagtagtatgctcgc120aagagtgaaacttaaaggaattgacgggaacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaa180tttgaagatacgcgtagaaccttacccgctcttgacatcttctgcaaagctatagagata240tagtggagggtaacagagtgacagatggtgca272當(dāng)前第1頁12