本發(fā)明涉及基于銀杏細(xì)胞培養(yǎng)體系的左旋海松二烯對(duì)銀杏萜內(nèi)酯生物合成的影響。
背景技術(shù)：
：銀杏隸屬于裸子植物門(mén)，為銀杏科銀杏屬植物。銀杏含有多種藥用次生代謝產(chǎn)物，銀杏內(nèi)酯是血小板活化因子受體的天然專(zhuān)一拮抗劑，也是治療和預(yù)防心腦血管疾病的優(yōu)良天然藥物。因?yàn)槭袌?chǎng)需求量大，傳統(tǒng)的大量種植因其植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、易受氣候環(huán)境等條件的影響以及難以調(diào)控等種種缺點(diǎn)，制約了該學(xué)科的發(fā)展，同時(shí)傳統(tǒng)的提取分離純化方法不能滿(mǎn)足要求，化學(xué)全合成步驟復(fù)雜且成本高而無(wú)工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值，因此科學(xué)家們把目光投向現(xiàn)代生物技術(shù)。生物技術(shù)諸如植物細(xì)胞培養(yǎng)可以很好的對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行代謝調(diào)控，較少地受到環(huán)境及氣候的影響，結(jié)合大型生物反應(yīng)器技術(shù)，使工業(yè)化發(fā)酵成為可能。植物組織培養(yǎng)應(yīng)運(yùn)而生，植物組織培養(yǎng)相比化學(xué)合成具有環(huán)境友好，投資少經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)，其應(yīng)用前景廣闊。一般來(lái)說(shuō)，萜類(lèi)化合物的生物合成途徑可以分成三個(gè)階段：第一階段是生成兩個(gè)簡(jiǎn)單的五碳骨架單元-異戊烯焦磷酸ipp和二甲基丙烯焦磷酸dmapp；第二階段是ipp和dmapp縮合生成萜類(lèi)的前體化合物-法尼基焦磷酸fpp和香葉基香葉基焦磷酸ggpp；第三階段是在萜類(lèi)化合物合成酶和單加氧酶(細(xì)胞色素p450酶家族)的作用下發(fā)生環(huán)化和氧化反應(yīng)，而單加氧酶決定了最后產(chǎn)物的特殊碳骨架類(lèi)型。大多植物中的萜類(lèi)前體化合物都有兩條不同的來(lái)源途徑。在細(xì)胞質(zhì)中主要以甲羥戊酸途徑mevalonate(mva)pathwaymva為主，該途徑以乙酰輔酶a為原料，經(jīng)過(guò)六步反應(yīng)生成ipp，用于合成倍半萜和三萜；而在質(zhì)體中主要以非甲羥戊酸途徑methylerythritolphosphate(mep)pathway為主，該途徑以丙酮酸和d-甘油醛-3-磷酸為原料，經(jīng)過(guò)七步反應(yīng)生成ipp和dmapp，最后生成類(lèi)異戊二烯化合物、單萜、二萜和四萜。研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯是通過(guò)mep途徑合成的，而白果內(nèi)酯則通過(guò)mva途徑合成。目前，人們已經(jīng)克隆了銀杏中mep途徑的大部分關(guān)鍵酶基因以及mva途徑的部分關(guān)鍵酶基因，發(fā)現(xiàn)dxp合成酶和dxp還原異構(gòu)酶是mep途徑中的限速酶，而3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶(hmg-coareductase)是mva途徑中的限速酶。在銀杏內(nèi)酯生物合成的下游途徑中，ggpp在左旋海松二烯合成酶(lps)的作用下，環(huán)化生成左旋海松二烯(lp)，該步驟是合成銀杏內(nèi)酯前的關(guān)鍵步驟。左旋海松二烯經(jīng)過(guò)脫氫反應(yīng)生成脫氫松香烷后，由質(zhì)體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，再進(jìn)過(guò)一系列復(fù)雜反應(yīng)(包括細(xì)胞色素p450介導(dǎo)的氧化和重排)后，最終生成銀杏內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯a經(jīng)過(guò)連續(xù)的羥化反應(yīng)后生成其他各種銀杏內(nèi)酯，如何由lp生物合成gk至今仍不清楚。相對(duì)而言，我們對(duì)白果內(nèi)酯的生物合成途徑知之甚少，白果內(nèi)酯屬于倍半萜類(lèi)化合物，大部分人認(rèn)為其由fpp合成而來(lái)，但是也有部分學(xué)者認(rèn)為白果內(nèi)酯是銀杏內(nèi)酯的代謝產(chǎn)物，其通過(guò)銀杏內(nèi)酯丟失碳原子從而降解得到產(chǎn)物。前體物質(zhì)是植物生物合成過(guò)程中重要的化合物，它能影響植物代謝過(guò)程中次生代謝物的含量，有時(shí)甚至可以誘導(dǎo)出新的化合物。為此，本發(fā)明基于銀杏細(xì)胞培養(yǎng)體系來(lái)研究左旋海松二烯對(duì)銀杏萜內(nèi)酯生物合成的影響。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于研究基于銀杏細(xì)胞培養(yǎng)體系的左旋海松二烯對(duì)銀杏萜內(nèi)酯生物合成的影響。本發(fā)明是通過(guò)如下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：銀杏干細(xì)胞和脫分化細(xì)胞的培養(yǎng)、左旋海松二烯的飼喂、銀杏萜內(nèi)酯的提取和含量的檢測(cè)、pcr檢測(cè)銀杏懸浮細(xì)胞關(guān)鍵酶的表達(dá)水平。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)有益效果在于：(1)首次研究左旋海松二烯對(duì)銀杏萜內(nèi)酯生物合成的影響；(2)首次進(jìn)行pcr檢測(cè)左旋海松二烯對(duì)銀杏懸浮細(xì)胞關(guān)鍵酶的表達(dá)水平的影響；(3)本發(fā)明為研究銀杏萜內(nèi)酯的生物合成途徑提供了科學(xué)依據(jù)，對(duì)開(kāi)發(fā)利用傳統(tǒng)中藥具有重要意義。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)例1中銀杏ddcs的細(xì)胞干重。圖2-5為實(shí)例1中銀杏ddcs中銀杏萜內(nèi)酯的含量(b：ga，c：gb，d：gc，e：bb)。圖6為實(shí)例1中銀杏cmcs的細(xì)胞干重。圖7-10為實(shí)例1中銀杏cmcs中銀杏萜內(nèi)酯的含量(b：ga，c：gb，d：gc，e：bb)。圖11-14為實(shí)例2中銀杏ddcs中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平(a：24h，b：36h，c：48h，d：60h)。圖15-18為實(shí)例2中銀杏cmcs中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平(a：24h，b：36h，c：48h，d：60h)。具體實(shí)施方式：下面結(jié)合技術(shù)方案和圖表詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施例。以下實(shí)驗(yàn)所用的銀杏細(xì)胞均由暨南大學(xué)(中國(guó)廣州)中藥生物技術(shù)研究所提供。實(shí)施例1左旋海松二烯(lp)對(duì)銀杏干細(xì)胞(cmcs)和脫分化細(xì)胞(ddcs)生長(zhǎng)及銀杏萜內(nèi)酯含量的影響(1)銀杏cmcs和ddcs的培養(yǎng)銀杏懸浮細(xì)胞所用培養(yǎng)基為ms培養(yǎng)基，添加維生素c(50.0mg/l)、蔗糖(30g/l)，ddcs中添加萘乙酸(naa，2.0mg/l)和吲哚丁酸(iba，2.0mg/l)，cmcs中加入2.0mg/lnaa和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-d，2.0mg/l)、培養(yǎng)基ph值為5.75-5.80，分裝至250ml錐形瓶(含100ml培養(yǎng)基)中，高溫蒸汽滅菌121℃，20分鐘，滅菌后冷卻至室溫，細(xì)胞繼代量為50g/l，繼代后置于搖床，轉(zhuǎn)速為110rpm，25℃下避光培養(yǎng)。(2)實(shí)驗(yàn)組的設(shè)置銀杏懸浮細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)(100ml培養(yǎng)基)13天后，向銀杏cmcs和銀杏ddcs投入用dmso溶解的左旋海松二烯，設(shè)置6個(gè)終濃度，分別為20、40、60、80、100、120mg/l，考察時(shí)間12、24、36、48、60h，每個(gè)濃度每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3瓶，同步設(shè)置3瓶dmso空白組以及3瓶完全空白組。(3)銀杏萜內(nèi)酯的含量測(cè)定方法agilent1200型高效液相色譜儀(美國(guó)agilent公司)，alltech2000蒸發(fā)光檢測(cè)器，分析色譜柱：agilenthypersilods柱(4.0×250mm，5μm)，洗脫條件：甲醇、水作為流動(dòng)相，0-50min，甲醇比例從15％上升至40％；50-60min，甲醇比例保持40％；60-70min，甲醇比例為15％。進(jìn)樣量為20μl，檢測(cè)柱溫為25℃，流速0.8ml/min。蒸發(fā)光檢測(cè)器漂移管溫度105℃，載氣流速3.0l/min。(4)銀杏培養(yǎng)體系萜內(nèi)酯含量測(cè)定采收時(shí)用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，把細(xì)胞與培養(yǎng)基分離。細(xì)胞冷凍干燥后，用20倍甲醇超聲提取3次，每次30min，獲得甲醇提取液，將甲醇提取液蒸發(fā)濃縮至干，然后用20倍水和20倍乙酸乙酯的混合溶液溶解，分液萃取，再用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯層，獲得乙酸乙酯提取液，蒸發(fā)濃縮至干，用1ml甲醇溶解定容；培養(yǎng)基用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，獲得乙酸乙酯提取液，將其蒸發(fā)濃縮至干，用1ml甲醇溶解定容。hplc-elsd分析樣品，檢測(cè)銀杏內(nèi)酯a(ga)、銀杏內(nèi)酯b(gb)、銀杏內(nèi)酯c(gc)和白果(bb)的含量。結(jié)果顯示：向銀杏ddcs中投入左旋海松二烯之后，低濃度的左旋海松二烯對(duì)ddcs的生長(zhǎng)基本無(wú)影響或稍許促進(jìn)，當(dāng)投入終濃度為120mg/l時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。投入左旋海松二烯后能顯著影響銀杏萜內(nèi)酯的生物合成，當(dāng)投入終濃度為100mg/l時(shí)，銀杏ddcs培養(yǎng)體系中銀杏萜內(nèi)酯的含量變化最明顯，明顯提高銀杏萜內(nèi)酯的含量。相較于空白對(duì)照組，ga和gb在第48h時(shí)含量最高，分別是對(duì)照組含量的1.61和1.32倍，而后含量稍微下降；空白對(duì)照組中未檢測(cè)到gc和bb，當(dāng)加入左旋海松二烯后有g(shù)c和bb生物合成，在第60h時(shí)含量最高，分別提高了234μg/l和161μg/l。推測(cè)這一現(xiàn)象可能是左旋海松二烯作為mep途徑中的重要前體，加入后能顯著提高銀杏萜內(nèi)酯含量的結(jié)果，另外，上述結(jié)果也表明白果內(nèi)酯可以通過(guò)mep途徑生物合成得到而且可能是銀杏萜內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。向銀杏cmcs中投入左旋海松二烯之后，低濃度的左旋海松二烯對(duì)cmcs的生長(zhǎng)基本無(wú)影響或稍許促進(jìn)，當(dāng)投入終濃度為100mg/l時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始稍微受到抑制，120mg/l時(shí)抑制更明顯；而且加入左旋海松二烯處理相同時(shí)間之后，cmcs細(xì)胞干重是ddcs細(xì)胞干重的兩倍左右。當(dāng)投入終濃度為80mg/l時(shí)，銀杏cmcs培養(yǎng)體系中銀杏萜內(nèi)酯的含量變化最明顯，對(duì)銀杏萜內(nèi)酯含量的提高效果較為顯著。相較于空白對(duì)照組，ga和gb在第36h時(shí)含量最高，分別是對(duì)照組含量的2.03和1.43倍，而后含量稍微下降；gc在第48h時(shí)含量最高為對(duì)照組含量的1.22倍；bb在第60h時(shí)含量最高為對(duì)照組含量的1.19倍。對(duì)比銀杏cmcs和銀杏ddcs，左旋海松二烯對(duì)銀杏cmcs培養(yǎng)體系中銀杏萜內(nèi)酯的生物合成影響更為顯著，銀杏萜內(nèi)酯提高的量接近銀杏ddcs中提高量的兩倍。實(shí)施例2pcr檢測(cè)銀杏懸浮細(xì)胞關(guān)鍵酶的表達(dá)水平(1)銀杏cmcs和ddcs的培養(yǎng)銀杏懸浮細(xì)胞所用培養(yǎng)基為ms培養(yǎng)基，添加維生素c(50.0mg/l)、蔗糖(30g/l)，ddcs中添加萘乙酸(naa，2.0mg/l)和吲哚丁酸(iba，2.0mg/l)，cmcs中加入2.0mg/lnaa和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-d，2.0mg/l)、培養(yǎng)基ph值為5.75-5.80，分裝至250ml錐形瓶(含100ml培養(yǎng)基)中，高溫蒸汽滅菌121℃，20分鐘，滅菌后冷卻至室溫，細(xì)胞繼代量為50g/l，繼代后置于搖床，轉(zhuǎn)速為110rpm，25℃下避光培養(yǎng)。(2)實(shí)驗(yàn)組的設(shè)置銀杏懸浮細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)(100ml培養(yǎng)基)13天后，向銀杏cmcs中投入用dmso溶解的左旋海松二烯，終濃度為80mg/l；向銀杏ddcs中投入用dmso溶解的左旋海松二烯，終濃度為100mg/l，考察時(shí)間24、36、48、60h這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)水平，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3瓶，同步設(shè)置3瓶完全空白組。3、總rna提取(實(shí)驗(yàn)中所有步驟均為冰上操作)根據(jù)試劑盒rnapreppure多糖多酚植物總rna提取試劑盒(離心柱型)的要求，進(jìn)行總rna的提?。?)勻漿處理：銀杏cmcs和銀杏ddcs每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各自稱(chēng)取適量新鮮細(xì)胞液氮中迅速研磨成粉末，加入500μlsl，立即渦旋劇烈震蕩混勻。2)12,000rpm(～13,400×g)離心2min。3)將上清液轉(zhuǎn)移至過(guò)濾柱cs上(過(guò)濾柱cs放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)離心2min，小心吸取收集管中的上清至新的rnase-free的離心管中。4)緩慢加入0.4倍上清體積的無(wú)水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱cr3中，12,000rpm(～13,400×g)離心15sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中。5)向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm(～13,400×g)離心15sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中。6)向吸附柱cr3中央加入80μl的dnasei工作液，室溫放置15min。7)向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm(～13,400×g)離心15sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中。8)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)離心15sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中。9)重復(fù)步驟8。10)12,000rpm(～13,400×g)離心2min，將吸附柱cr3放入一個(gè)新的rnase-free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30-50μlrnase-freeddh2o，室溫放置2min，12,000rpm(～13,400×g)離心1min，得到rna溶液。(4)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)按照試劑盒fastquantcdna第一鏈合成試劑盒(去基因組)的要求，進(jìn)行去除基因組dna的反應(yīng)：1)將模板rna在冰上解凍；5×gdnabuffer、fq-rtprimermix、10×fastrtbuffer、rnase-freeddh2o在室溫(15-25℃)解凍，解凍后迅速置于冰上。使用前將每種溶液渦旋振蕩混勻，簡(jiǎn)短離心以收集殘留在管壁的液體。2)按照表1的基因組dna的去除體系配制混合液，徹底混勻。簡(jiǎn)短離心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置表1gdna去除反應(yīng)體系3)按照表2的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制混合液。表2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系組成成分使用量10×fastrtbuffer2μlrtenzymemix1μlfq-rtprimermix2μlrnase-freeddh2o補(bǔ)足到10μl4)將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的mix，加到gdna去除步驟的反應(yīng)液中，充分混勻。5)42℃，孵育15min。6)95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cdna用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或低溫保存。(5)熒光定量q-pcr實(shí)驗(yàn)參考基因?yàn)間apdh，目標(biāo)基因?yàn)閐xs、mect、hds、hdr、ggpps、lps，所用引物如下所示。1)dxsdxs-f：5′atggcgatgttaatggcatcaac3′dxs-r：5′tcaagacattatttggggagcatc3′2)mectmect-f：5′caagctacagaacttgtatg3′mect-r：5′cacaaagccatcactact3′3)hdshds-f：5′attgatccttgtaggagact3′hds-r：5′tctgtaatccacttcttcac3′4)hdrhdr-f：5′atggctcaagcttgtgcagtatcag3′hdr-r：5′ctacgctactggcaaggtctcttct3′5)ggppsggpps-f：5′ccagatcctccgttcctcctacaagttca3′ggpps-r：5′agtgcaggctttggtaacttgctgtcatt3′6)lpslps-f：5′aaaacaaacgatgcctccac3′lps-r：5′cggcgtcccagtacctataa3′7)內(nèi)參基因gapdhgapdh-f：5′ggtgccaaaaaggtggtcat3′gapdh-r：5′caacaacgaacatgggagcat3′按照試劑盒superreal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(sybrgreen)的要求，進(jìn)行q-pcr的反應(yīng)：反應(yīng)體系：組成成分20μl體系終濃度2×superrealpremixplus10μl1×正向引物(10μm)0.6μl0.3μm反向引物(10μm)0.6μl0.3μmcdna模板--ng-pgrnase-freeddh2o至20μl-然后按照兩步法pcr擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行反應(yīng)，如下：1)預(yù)變性95℃，15min，1cycle；2)pcr反應(yīng)95℃，10sec；60℃，32sec，40cycles；3)融解曲線(xiàn)分析65℃，5s；95℃，0s，0.5℃/s。結(jié)果分析：100mg/l的左旋海松二烯對(duì)ddcs銀杏萜內(nèi)酯生物合成途徑關(guān)鍵酶具有明顯影響，投入24h后，mep上游途徑的hds基因表達(dá)水平稍有上調(diào)，而后表達(dá)水平趨于平緩。在48h時(shí)ddcs中mep途徑的基因總體上調(diào)最明顯，dxs，mect，hds，hdr，ggpp和lps的表達(dá)水平分別是對(duì)照組的1.09，1.35，1.40，1.51，1.35和1.39倍，上述基因的表達(dá)狀況與銀杏ddcs中銀杏萜內(nèi)酯生物合成含量的變化趨勢(shì)基本吻合。80mg/l的左旋海松二烯對(duì)cmcs銀杏萜內(nèi)酯生物合成途徑關(guān)鍵酶具有明顯影響，投入24h后，mep上游途徑的dxs和mect基因表達(dá)水平稍有上調(diào)，而后表達(dá)水平趨于平緩。在36h時(shí)cmcs中mep途徑的基因總體上調(diào)最明顯，dxs，mect，hds，hdr，ggpp和lps的表達(dá)水平分別是對(duì)照組的1.12，1.34，1.47，1.87，1.93和1.66倍，上述基因的表達(dá)狀況與銀杏cmcs中銀杏萜內(nèi)酯生物合成的含量的變化趨于一致。對(duì)比銀杏cmcs和銀杏ddcs，左旋海松二烯對(duì)銀杏cmcs銀杏萜內(nèi)酯生物合成途徑中基因表達(dá)水平影響更大。pcr的結(jié)果左旋海松二烯通過(guò)上調(diào)mep途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)水平進(jìn)而提高銀杏萜內(nèi)酯和白果內(nèi)酯的含量，然而，由于缺少關(guān)于從左旋海松二烯到銀杏萜內(nèi)酯生物合成過(guò)程機(jī)制的了解，推測(cè)左旋海松二烯可能不僅作為一個(gè)重要前體化合物而且作為一種誘導(dǎo)子通過(guò)某種未知機(jī)制調(diào)節(jié)銀杏萜內(nèi)酯和白果內(nèi)酯的生物合成。當(dāng)前第1頁(yè)12