本發(fā)明屬于基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種包括樣本快速獲取，結(jié)果直接判讀的人類乳頭瘤病毒分型快速檢測方法。

背景技術(shù)：

人類乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus，hpv）是一種嗜上皮性病毒，在人和動物中分布廣泛，有高度的特異性，hpv的宿主為人類。hpv是一組病毒的總稱，組成一個(gè)科，其病毒形態(tài)類似，dna限制性內(nèi)切酶圖譜各異，核殼體蛋白質(zhì)的抗原性不同，通過對人乳頭瘤病毒克隆基因的dna雜交試驗(yàn)及酶譜分析，至今已鑒定出100多種類型人乳頭瘤病毒，每一型別都與體內(nèi)特定感染部位和病變有關(guān)。所有hpv病毒的基因組結(jié)構(gòu)相似，迄今已發(fā)現(xiàn)多種hpv類型，隨著研究的深入，將會鑒定出更多hpv新的類型。大約35種型別可感染婦女生殖道，約20種與腫瘤相關(guān)。至少有10個(gè)類型與尖銳濕疣有關(guān)（如6，11，16，18及33型，最常見6、11型），而第11，16，18型，則是國外目前研究宮頸癌、外陰癌甚至陰莖癌的最熱門的病毒因子，其長期感染與女性宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。依據(jù)不同型別hpv與腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性高低分為低危險(xiǎn)型別和高危險(xiǎn)型別hpv，低危險(xiǎn)型別hpv包括hpv6、11、42、43、44等型別，常引起外生殖器濕疣等良性病變包括宮頸上皮內(nèi)低度病變（cini），高危險(xiǎn)型hpv包括hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型別，與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)高度病變（cinii/iii）的發(fā)生相關(guān)，尤其是hpv16和18型。

根據(jù)研究，人乳頭瘤病毒(hpv)是引發(fā)宮頸癌的元兇，其中hpv16型和18型是引發(fā)婦女子宮腫瘤的最主要的類別，感染該病毒會至少引發(fā)全世界70%以上的宮頸癌病例。在婦女的腫瘤病中,宮頸癌的發(fā)生率僅次于乳腺癌,位居第二位。在發(fā)展中國家,宮頸癌的發(fā)生率是發(fā)達(dá)國家的6倍,而且80%的患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展為浸潤癌。

人乳頭瘤病毒感染生殖道是一個(gè)長期的過程，尖銳濕疣經(jīng)過治療后，如果機(jī)體免疫能力足夠強(qiáng)大時(shí)，病毒經(jīng)過1-2年就會自然消失。

由此可見，加強(qiáng)hpv檢測以及長期跟蹤預(yù)后有十分重要的意義，目前市場上已經(jīng)出現(xiàn)了比較成熟的hpv分型檢測產(chǎn)品有taq-man實(shí)時(shí)熒光定量法，pcr+分子雜交法，hc2分子雜交捕獲法等。

taq-man實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)的核酸檢測能夠精準(zhǔn)的進(jìn)行hpv分型檢測。但該方法有如下不足：1，試劑耗材昂貴；2.需要成批次的大規(guī)模檢測，適用于大型的醫(yī)院或體檢機(jī)構(gòu)；3，實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀價(jià)格昂貴，不適合鄉(xiāng)鎮(zhèn)等偏遠(yuǎn)地區(qū)推廣；4，操作判讀過程繁瑣，操作人員需要專門培訓(xùn)試劑盒的使用以及配套軟件的應(yīng)用，操作繁瑣，不適合快速便捷檢測。

pcr+分子雜交法。是利用擴(kuò)增出的大量目的基因產(chǎn)物，和芯片上固化的不同亞型的核酸單鏈進(jìn)行特異性識別，通過判讀核酸上攜帶的放射性標(biāo)記分子判讀樣本亞型。該方法能夠檢測出不同的hpv不同亞型。但由于分子雜交法本身的局限性。操作過程復(fù)雜，需要配合特定的儀器耗材，并且分子雜交技術(shù)極易出現(xiàn)假陽性。操作繁瑣，儀器耗材昂貴，并且操作人員需要專門培訓(xùn)。

hc2核酸雜交捕獲法。它利用分子生物學(xué)技術(shù)在分子（dna）水平直接檢測高危型hpv病毒。這項(xiàng)分子elisa技術(shù)通過將rna探針與單束hpvdna雜交，隨后通過化學(xué)發(fā)光檢測到rna/dna雜交物。該方法與上述分子雜交法類似，無pcr擴(kuò)增反應(yīng)，將楊很核酸純化后，進(jìn)行分子雜交，再通過信號放大判讀樣本的感染類型。該方法靈敏度高，但容易造成假陽性。同時(shí)，分子雜交過程需要1-1.5h，核酸提取過程需要1h左右，總耗時(shí)約3-4h，標(biāo)記分子信號放大系統(tǒng)屬于精密儀器，造價(jià)昂貴且不穩(wěn)定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有hpv檢測技術(shù)的不足，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種人類乳頭瘤病毒（hpv）分型快速檢測方法。

步驟1，根據(jù)不同的hpv分型特征基因，設(shè)計(jì)特異性引物，上下游引物的5’端攜帶至少兩種標(biāo)記分子。

步驟2，將hpv檢測樣本進(jìn)行處理，處理方法使用一管法微量釋放，只需5ul樣本，置于反應(yīng)管中，加入釋放劑進(jìn)行裂解，得到核酸樣本。

步驟3，將上述特異性引物和樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到大量的目的基因片段。

步驟4，將得到的帶有標(biāo)記分子的目的基因片段滴于免疫層析試紙條上，5-10min即可判讀結(jié)果。若樣本為陰性，則無目的條帶產(chǎn)生，試紙條上值顯示一條控制線（6）；若樣本為陽性，則試紙條上產(chǎn)生兩條線，分別是檢測線（7）和控制線（6）。

以hpv18型為例，所述步驟1)中作為優(yōu)選的引物序列為。

上游引物(hpv-f):5’-fam-attgattagttacctctatgctga-3’。

下游引物(hpv-r):5’-hex-gtatgctgacggtagtcattagcc-3’。

步驟2中所述的一管法微量釋放核酸樣本，使用微量核酸釋放劑、促釋放劑、封閉劑；微量核酸釋放劑含有5~500mm的kc1、0.5~20%tritonx-100、1~100mg/ml的蛋白酶k、1~20mm的naoh，ph值5~8的dmso、終濃度0.5~10%的bsa。具體操作方法：取微量核酸釋放劑5μl加入等體積的樣本，用移液器吹打混勻10次，每管加入30μl的封閉劑；進(jìn)行95℃，10min溫浴處理，然后降溫4℃2min（此步驟可以在pcr儀上進(jìn)行）即獲得模板樣本。將反應(yīng)液加入反應(yīng)管，蓋好管蓋。振蕩混勻，瞬時(shí)離心，進(jìn)pcr反應(yīng)。

所述步驟3中作為優(yōu)選的pcr擴(kuò)增方法為普通熱循環(huán)pcr擴(kuò)增法，也可以使用等溫?cái)U(kuò)增pcr法等其他方法。

所述步驟4中的試紙條構(gòu)成：優(yōu)選的方案為金墊包含的示蹤分子為連接了hex抗體的膠體金顆粒，檢測線（t線）處固定的捕獲分子為fam抗體。若樣本為陰性，則無目的條帶出現(xiàn)，試紙條上顯示一條控制線（c線）（6）；若樣本為陽性，則試紙條上顯示兩條線，分別是檢測線（t線）和控制線（c線）。

本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在以下方面。

（1）減少交叉污染。

已有的hpv核酸檢測方法，是使用磁珠法或者柱提法提取樣本核酸樣本。配合使用提取試劑，進(jìn)行提取純化核酸。該過程非常容易受到污染，并且耗費(fèi)時(shí)間。一般的核酸純化試劑盒的提取過程需要1h左右，而本發(fā)明使用的一管法微量釋放劑，可以在15min完成核酸獲取，不需要繁瑣的操作過程，取樣到獲得樣本可以做到“一室化”，從而避免了樣本處理過程中的交叉感染。

（2）便于推廣使用。

已有的hpv檢測方法為實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法，需要使用配套的熒光定量pcr儀，這種儀器屬于精密儀器，造價(jià)昂貴。需要專門培訓(xùn)，結(jié)果的判讀需要一定的經(jīng)驗(yàn)。而本發(fā)明使用的pcr+免疫層析法，則不需要特殊儀器，普通控溫pcr儀即可使用（若使用等溫pcr技術(shù)，則只需要水?。庋奂纯膳凶x結(jié)果，結(jié)果直觀可讀，操作者不需要專業(yè)培訓(xùn)。

（3）提高了檢測效率。

已有的hpv核酸檢方法，需要收集夠足量的hpv樣本，從而進(jìn)行批量試驗(yàn)。通過核酸提取純化，至熒光定量pcr法檢測，過程約4-5h，不適合基層醫(yī)療單位的快速診斷。本發(fā)明公布的一種hpv分型檢測方法，則可以大大縮短檢測時(shí)間，并且對于單份樣本也可以操作，總體耗時(shí)約1-1.5h。

該方法的局限性：只能做定性篩選，無法做定量分析。

附圖說明

圖1免疫層析試紙結(jié)構(gòu)。

圖2實(shí)施例1hpv-18型和hpv-16型檢測結(jié)果，圖上出現(xiàn)兩條線的為陽性，一條線的為陰性。

圖3實(shí)施例3hpv-16/18組合檢測結(jié)果，顯示三條線的為hpv-16/18復(fù)合感染，檢測線2顯色為hpv-18型感染，檢測線1顯色為hpv-16型感染。

具體實(shí)施例

下面根據(jù)說明書做進(jìn)一步說明。以令領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)說明書文字實(shí)施。

實(shí)施例1。

采集陰道拭子樣本21份，11份樣本為高危hpv-18型感染，10份樣本為hpv-16型感染。以上樣本由北京軍區(qū)總醫(yī)院提供。

步驟1，設(shè)計(jì)標(biāo)記分子修飾的引物組合。

（hpv-18-f）:5’-fam-attgattagttacctctatgctga-3’。

（hpv-18-r）:5’-hex-gtatgctgacggtagtcattagcc-3’。

（hpv-16-f）:5’-fam-cgacgtttgcgaaaccgcaag-3’。

（hpv-16-r）:5’-hex-aatgcattgaccgctcctaac-3’。

步驟2，取樣本5μl，置于pcr反應(yīng)管，加入5μl微量核酸釋放劑，吹打混勻10次。加入30μl封閉劑封閉。微量核酸釋放劑含有5~500mm的kc1、0.5~20%tritonx-100、1~100mg/m1的蛋白酶k、1~20mm的naoh,促釋放劑含有ph值5~8的dmso、終濃度0.5~10%的bsa。

將上述反應(yīng)管進(jìn)行95℃,10分鐘溫浴處理，然后降溫4℃2min（此步驟可以在pcr儀上進(jìn)行）即獲得模板樣本。

步驟3，使用步驟1設(shè)計(jì)的引物配制pcr反應(yīng)體系。

。

將反應(yīng)液加入到步驟2得到的核酸樣本中。輕微振蕩混勻，置于離心機(jī)上瞬離，去除反應(yīng)體系中的氣泡。后使用普通pcr儀運(yùn)行以下程序。

。

步驟4，以hpv18型為例，吸取全部擴(kuò)增反應(yīng)液滴于膠體金試紙樣品墊上，樣品會隨著層析作用，朝向吸水墊移動，通過金墊時(shí)，核酸一端攜帶的fam被結(jié)合了金顆粒的anti-fam識別，并與之結(jié)合。隨著層析作用，核酸片段牽引著金顆粒向吸水墊方向?qū)游觥：怂岙a(chǎn)物另一端的hex被檢測線固定的anti-hex識別并結(jié)合，從而金顆粒在檢測線上匯集顯色。完成檢測判讀。

實(shí)施例1的操作時(shí)間為70分鐘，陽性檢出率為100%。

具體實(shí)施例2

在高危hpv感染中，除了hpv16/18型與宮頸癌發(fā)生高度相關(guān)之外，還有hpv31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等分型，為了進(jìn)一步提高檢測效率，可將剩余的11種亞綜合檢測，根據(jù)這11類hpv病毒亞型共有的保守序列，設(shè)計(jì)hpv高危型分型通用引物，在確定具體的亞型之前，檢測樣本是否存在其他hpv高危型感染。

通用引物設(shè)計(jì)。

5’-tamara-atctcgggctaattacgtaatcc-3’。

5’-hex-cctatgggtatcccgtcgaac-3’。

其他樣本和試驗(yàn)過程與實(shí)施例一類似。區(qū)別是配合通用引物使用的膠體金試紙，樣本墊為金顆粒與tamra抗體的復(fù)合物。試驗(yàn)操作時(shí)間為70分鐘，陽性檢出率為100%。

具體實(shí)施例三。

在一張?jiān)嚰垪l上，可以設(shè)計(jì)使用兩種及兩種以上的檢測線，可以將不同分型的特異性引物進(jìn)行組合，從而增加了效率。節(jié)約了檢測成本。

針對hpv16型/18型設(shè)計(jì)引物如下。

hpv16型：f:5’-fam-cgacgtttgcgaaaccgcaag-3’。

hpv16型：r：5’-hex-aatgcattgaccgctcctaac-3’。

hpv18型：f：5’-hex-attgattagttacctctatgctga-3’。

hpv18型：r：5’-cy5-gtatgctgacggtagtcattagcc-3’。

樣本進(jìn)行一管法微量釋放處理。見實(shí)施例一步驟2。

反應(yīng)液配制：在實(shí)施例1基礎(chǔ)上，將hpv-16/hpv-18引物同時(shí)加入反應(yīng)體系。進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，舉例配液如下。

。

膠體金檢測，參照實(shí)施例一步驟（4），將擴(kuò)增產(chǎn)物加于樣品墊上。樣品墊鋪設(shè)連接膠體金顆粒的hex抗體，檢測線1固定anti-fam抗體，檢測線2固定anti-cy5抗體。若樣本為hpv-16陽性，則檢測線2出現(xiàn)顯色；若樣本為hpv-18陽性，則檢測線1出現(xiàn)顯色；若樣本為hpv-16/18混合樣本，則兩條檢測線都出現(xiàn)顯色（見附圖3）。

本實(shí)驗(yàn)過程從試驗(yàn)準(zhǔn)備到讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，時(shí)間為70分鐘，檢出率為100%。

以上本發(fā)明實(shí)施例是對一種人類乳頭瘤病毒分型快速檢測方法進(jìn)行詳細(xì)介紹，該方法可以大大縮短hpv核酸檢測的時(shí)間，降低了檢測的成本，更重要的是，本方法不依賴昂貴的專業(yè)儀器，不需要對操作人員進(jìn)行專門培訓(xùn)，配合一管法核酸微量釋放，最大限度的減少了環(huán)境對反應(yīng)的影響?？捎糜谂R床診斷，核酸檢測等領(lǐng)域，非常適合在基層醫(yī)療單位推廣。

本文應(yīng)用了具體個(gè)例對本發(fā)明的原理和實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例說明只用于幫助理解本發(fā)明的核心思想和方法，幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解實(shí)施。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員能思之的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

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<110>寶瑞源生物技術(shù)（北京）有限公司

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