本發(fā)明涉及2-氨基-4-(3-氟甲基苯)-3-氰基-5-氧代-4h,5h-吡喃酮化合物及其抗細菌生物膜應用。

背景技術：

以金黃色葡萄球菌等形成的生物膜是具有機體構造的細菌菌落粘附在物體表面，包裹在自分泌的含水聚合性基質中，形成膜狀的結構。由生物膜相關的病原體引起的感染難以根除，容易引發(fā)嚴重的并發(fā)癥。美國疾病控制與預防中心研究表明，約80％的細菌感染與細菌生物膜相關，在美國每年約新增加1700萬生物膜相關的感染患者。在醫(yī)療環(huán)境中，常見的細菌生物膜主要有心臟瓣膜等體內醫(yī)療移植物和埋植劑、氣管導管和透析機等診療設備、慢性病傷口、外科病房和醫(yī)院物表、換氣系統(tǒng)和供水系統(tǒng)等。在細菌生物被膜的保護下，病原菌難以徹底清除，導致臨床感染遷延不愈。

吡喃酮是吡喃的酮類衍生物，是一類六元的含氧雜環(huán)化合物，具有廣泛的藥理活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗真菌活性等。在醫(yī)藥領域，吡喃酮類化合物治療效果明確、毒副作用低、是一類潛在的重要先導化合物，目前對此類化合物的化學結構修飾和改造已經成為全球新藥研發(fā)的重要研究熱點之一，正不斷被開發(fā)和應用，具有巨大的臨床應用前景。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供2-氨基-4-(3-氟甲基苯)-3-氰基-5-氧代-4h,5h-吡喃酮，該化合物的結構式如式ⅰ所示：

本發(fā)明的另一目的在于提供上述化合物用于制備抗金黃色葡萄球菌生物膜制劑的應用。

本發(fā)明的化合物對金黃色葡萄球菌生物膜形成具有較強的抑制作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的化合物1的核磁共振圖譜；

圖2為本發(fā)明的化合物2的核磁共振圖譜；

圖3為本發(fā)明的化合物3的核磁共振圖譜；

圖4為本發(fā)明的化合物4的核磁共振圖譜；

圖5為本發(fā)明的化合物5的核磁共振圖譜；

圖6為本發(fā)明的化合物6的核磁共振圖譜；

圖7為本發(fā)明的化合物7的核磁共振圖譜；

圖8為本發(fā)明的化合物8的核磁共振圖譜；

圖9為化合物4體外抗金黃色葡萄球菌生物膜活性結晶紫染色結果；

圖10為化合物4體外抗金黃色葡萄球菌生物膜活性熒光染色；

圖11為化合物4體內抗金黃色葡萄球菌生物膜活性作用。

具體實施方式

發(fā)明人合成了的系列新型吡喃類化合物，并針對臨床容易形成生物膜的金黃色葡萄球菌，評價化合物抑制細菌生物膜形成的活性。

本發(fā)明化合物的合成路線及方法為：

a：將適量的4-羥基香豆素，丙二腈和不同取代基的芳香醛按照1:1:1摩爾混合后加熱至溶解；

b：加入催化量的4-二甲氨基吡啶,加熱回流3-4小時；

c：冷卻后固體析出，抽濾，固體再用無水乙醇重結晶，最終得純品。

實施例：

該實施例合成通式如式ⅱ所示的化合物：

其中：r＝3-f,2-cn,3-pho,3-cf3,2-no2,4-no2,2-och3,4-sch3。

合成方法為：

a：在250ml三口燒瓶中將適量的4-羥基香豆素，丙二腈和不同取代基的芳香醛按照1:1:1摩爾混合后加熱至溶解；

b：加入催化量的4-二甲氨基吡啶,加熱回流3-4小時；

c：冷卻后固體析出，抽濾，固體再用無水乙醇重結晶，最終得純品。

結構鑒定：

利用質譜(ms)、核磁共振波譜(nmr)、紅外吸收光譜(ir)和紫外吸收光譜(uv)等有機波譜，對上述合成的系列新型吡喃類化合物進行分子量、結構和純度等鑒定。

鑒定結果為：

化合物1：

2-amino-4-(3-fluorophenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.893-7.916(q,1h),7.707-7.751(m,1h),7.465-7.524(m,4h),7.340-7.395(m,1h),7.081-7.146(m,3h),4.522(s,1h).

化合物2：

2-amino-4-(2-cyanophenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.908-7.931(q,1h),7.814-7.836(q,1h),7.728-7.771(m,1h),7.642-7.683(m,1h),7.451-7.584(m,6h),4.822(s,1h).

化合物3：

2-amino-4-(3-phenoxyphenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.879-7.899(d,1h),7.707-7.747(t,1h),7.451-7.519(m,4h),7.300-7.392(m,3h),7.112-7.149(t,1h),6.978-7.041(m,4h),6.821-6.841(d,1h),4.477(s,1h).

化合物4：

2-amino-4-(3-trifluoromethylphenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.902-7.926(q,1h),7.713-7.756(m,1h),7.467-7.659(m,8h),4.654(s,1h).

化合物5：

2-amino-4-(2-nitrophenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.898-7.917(d,2h),7.707-7.750(m,1h),7.641-7.679(q,1h),7.588(s,2h),7.456-7.562(m,4h),5.248(s,1h)

化合物6：

2-amino-4-(4-nitrophenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):8.175-8.196(d,2h),7.910-7.933(q,1h),7.723-7.766(m,1h),7.475-7.611(m,6h),4.682(s,1h).

化合物7：

2-amino-4-(3-methoxyphenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.890-7.913(q,1h),7.697-7.736(q,1h),7.424-7.516(m,4h),7.219-7.259(t,1h),6.800-6.841(q,3h),4.432(s,1h),3.726(s,3h).

化合物8：

2-amino-4-(4-methylsulfanylphenyl)-3-cyano-5-oxo-4h,5h-pyrano[3,2c]chromene:

¹hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.889-7.913(q,1h),7.701-7.744(m,1h),7.427-7.521(m,4h),7.204(s,4h),4.425(s,1h),2.451(s,3h).

實施例合成化合物體外抗金黃色葡萄球菌生物膜活性的測定：

試驗中所用金黃色葡萄球菌菌株來自美國模式培養(yǎng)物研究所(americantypeculturecollection,atcc)。

(1)結晶紫染色實驗過程如下：

a：分別從劃線培養(yǎng)的m-h瓊脂培養(yǎng)基上挑取不同實驗菌株的單克隆菌落，接種于4ml的tsb培養(yǎng)基中，以220r/min，37℃的條件培養(yǎng)至對數生長期。

b：在96孔板每孔中加入100μl的m-h肉湯培養(yǎng)基，吸取100μl的菌液加入第1孔中吹打混勻后吸取100μl加入第2孔中，依次類推，最后1孔混勻后吸取100μl棄去。

c：在酶標儀上選定630nm檢測，記錄od630值為0.1時菌液所稀釋的倍數(此時菌液濃度約為10⁸cfu/ml)，將菌液用含2％葡萄糖的tsb培養(yǎng)基稀釋至相對應的倍數后再按1：100的比例向菌液稀釋至10⁶cfu/ml。

d：向96孔板每孔分別加入tsb溶解的濃度為4μg/ml上述各化合物100μl后，加入已制備的濃度為10⁶cfu/ml的菌液100μl，取一排孔加入200μl含2％葡萄糖的tsb培養(yǎng)基作為空白對照，將96孔板放入37℃孵箱恒溫孵育24h。

e：吸去上清，用0.01m的pbs洗三遍，每孔加入150μl甲醇固定30min，輕柔棄去甲醇，加入150μl1％的結晶紫溶液染色15min。

f：輕柔吸去結晶紫溶液，用0.01m的pbs輕洗3遍，放入烘箱烘干，每孔加入33％冰醋酸溶液150μl，使用酶標儀在630nm處測吸光度。

將沒有經過化合物處理的細菌作為空白對照組(control)，和對照組相比，化合物4在濃度為4μg/ml時，對生物膜的形成具有顯著的抑制作用(**p<0.01)，如圖9所示。

(2)熒光染色實驗過程如下：

a：取指數生長期耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)usa300，用含有0.5％葡萄糖的tsb培養(yǎng)基稀釋后接種到24孔板，每孔1ml。

b：向24孔板每孔中加入2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml的化合物4，對照孔不加化合物，培養(yǎng)24h。

c：向每孔中加入10mg/ml異硫氰酸熒光素(fitc)染料孵育細菌2h,離心后棄上清液，用pbs緩沖液漂洗細菌3次。

d：熒光顯微鏡488mm波長處觀察細菌生物膜的形態(tài)。

和空白對照組相比，化合物4呈濃度依賴性抑制生物膜的形成，如圖10所示。a:空白對照組，b:2μg/ml化合物4處理組，c:4μg/ml化合物4處理組，d：8μg/ml化合物4處理組。

實施例合成化合物體內抗金黃色葡萄球菌生物膜活性的測定：

(1)掃描電鏡觀察化合物對細菌體內生物膜影響的過程如下：

a：挑取細菌單克隆于肉湯培養(yǎng)基中37℃，220rpm搖菌過夜。

b：次日使用含有0.5％葡萄糖的tsb培養(yǎng)基稀釋到10⁶cfu備用。

c：sd大鼠使用戊巴比妥鈉麻醉后固定進行腹部脫毛。剪開腹直肌暴露膀胱后，將無菌塑料插管置于膀胱中并向膀胱中注射1×10⁶cfu/ml菌液200μl。

d：金黃色葡萄球菌感染后3h分別對陰性對照組和實驗組腹腔注射tsb培養(yǎng)基與化合物4(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)進行治療。

e：感染后第三天將大鼠麻醉處死，對其腹部消毒后剪開膀胱取出植入插管。使用無菌pbs清洗2遍，洗去浮游菌和雜質。將插管置于500μl3％戊二醛中20-24h以上，完成后續(xù)樣本處理后使用jem-2000ex掃描電鏡進行生物膜的觀察。

和空白對照組相比，化合物4呈劑量依賴性抑制膀胱植入性塑料插管上金黃色葡萄球菌生物膜的形成，如圖11所示，a:空白對照組，b:1mg/kg化合物4處理組，c:2mg/kg化合物4處理組，d：4mg/kg化合物4處理組。