本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種洞穴動(dòng)球菌。同時(shí)，本發(fā)明還涉及所述洞穴動(dòng)球菌的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：微生物種類豐富，長期以來，人們利用純培養(yǎng)技術(shù)對環(huán)境中的微生物進(jìn)行調(diào)查研究和開發(fā)利用。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微生物資源在科技研究及生物產(chǎn)業(yè)中的重要性日益凸顯。世界上許多國家都在搜集、保存各種微生物資源，其不斷豐富將為我國生物技術(shù)的發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。加香加料是卷煙工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是有效提升卷煙抽吸品質(zhì)，形成卷煙特有風(fēng)格的有效手段之一。目前我國煙草中添加的煙用香料大多是采用傳統(tǒng)方法萃取再加以調(diào)配所得，雖然生產(chǎn)操作簡單，但也存在香氣單調(diào)、改善卷煙抽吸效果不明顯等缺點(diǎn)。利用微生物對香原料進(jìn)行發(fā)酵，可以增加傳統(tǒng)提取香料中多種香氣物質(zhì)的含量，提升香氣豐富性。而現(xiàn)有工業(yè)產(chǎn)香微生物存在種類固化，發(fā)酵香料類型有限等問題，迫切需要尋找并篩選新的能夠發(fā)酵產(chǎn)生特殊香氣的微生物菌株，以拓展煙用香料的豐富性，滿足卷煙生產(chǎn)需求。國內(nèi)外煙草工作者在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)煙用香料方面已經(jīng)做了很多工作，但多限于產(chǎn)香酵母。本發(fā)明提供的洞穴動(dòng)球菌為首次被分離得到，經(jīng)鑒定為微生物新種，目前未有任何關(guān)于所述洞穴動(dòng)球菌及相關(guān)應(yīng)用的公開報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種洞穴動(dòng)球菌。本發(fā)明的目的還在于提供所述洞穴動(dòng)球菌的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的。一種洞穴動(dòng)球菌，分類命名為洞穴動(dòng)球菌(kineococcuscavernaesp).sysuzl-1，該菌株于2016年12月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心cctcc，保藏編號m2016738。所述的洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1的16srrna基因核苷酸序列如序列表所示。所述的洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1在大多數(shù)培養(yǎng)基上生長良好，基內(nèi)菌絲紅褐色到棕色。明膠液化、牛奶凝固、胨化呈陽性，淀粉水解、硝酸還原呈陰性，不產(chǎn)生硫化氫，形成黑色素。能利用葡萄糖、半乳糖、果糖木糖、棉子糖、鼠李糖、蜜二糖、甜醇、甘油、甘露醇、山梨醇、醋酸鈉。細(xì)胞壁含有l(wèi)-二氨基庚二酸和甘氨酸。所述的洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1從云南省石林縣印象煙莊煙田相鄰近的喀斯特洞穴土壤中分離得到，固體培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)絕大部分的微生物具有產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)的能力，經(jīng)液體發(fā)酵后產(chǎn)生的氣息明顯不同。在獲得的純培養(yǎng)分離菌株中，篩選得到可在含有簡單碳氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)生揮發(fā)性、且為特殊香味氣息的菌株sysuzl-1。所述的洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1具有產(chǎn)生特殊香氣的功能，gc-ms鑒定結(jié)果顯示，菌株sysuzl-1能夠產(chǎn)生幾類主要揮發(fā)性化合物，苯甲醛及土味素、欖香烯、欖香醇、a-桉葉醇。因此可以用于發(fā)酵制備煙用香料的工業(yè)生產(chǎn)中，對拓展煙用香料的豐富性，滿足卷煙生產(chǎn)需求具有良好的應(yīng)用前景。利用所述洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1發(fā)酵制備煙用香料的優(yōu)選方法，將洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃搖瓶培養(yǎng)6d后，進(jìn)行回流提取，過濾除渣，將上清液減壓濃縮得到所需煙用香料。該香料具有十分特殊的香氣，能夠強(qiáng)化卷煙風(fēng)格，豐富煙香，使香氣更加圓潤飽滿。本發(fā)明的有益效果是：從煙田相鄰近的喀斯特洞穴土壤中分離得到的純培養(yǎng)菌株中，篩選得到可在含有簡單碳氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)生揮發(fā)性，且為特殊香味氣息的菌株sysuzl-1。經(jīng)過微生物學(xué)特性分析和16srrna基因序列分析表明該菌株是一種新的細(xì)菌。該菌株能夠產(chǎn)生苯甲醛及土味素、欖香烯、欖香醇、a-桉葉醇等幾類主要揮發(fā)性化合物。其中，苯甲醛具有香味氣息，微生物中較常見，但產(chǎn)量不高；土味素為放線菌產(chǎn)生的常見化合物，本身有腥味。欖香烯具有抑制癌細(xì)胞的作用，是目前一類上市抗癌藥中的主要成分，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，特別是微生物自主代謝產(chǎn)生。欖香醇常用作香精原料。桉葉醇本身具有一定香味，且可做定香劑來使用。利用該菌株發(fā)酵，能夠得到特殊香氣的煙用香料，所得香料具有強(qiáng)化卷煙風(fēng)格，豐富煙香，圓潤煙氣的作用，并且具有抗細(xì)菌及真菌的活性，效果穩(wěn)定而持久。此外，該菌株還具有開發(fā)新型、高效、無毒天然藥物的巨大潛力。保藏生物材料的說明本發(fā)明的菌株，已于2016年12月9日，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，該中心地址：中國湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山武漢大學(xué)內(nèi)，該菌株分類命名為：洞穴動(dòng)球菌(kineococcuscavernaesp)sysuzl-1，保藏編號cctccno：m2016738。附圖說明圖1為本發(fā)明的洞穴動(dòng)球菌在r2a培養(yǎng)基上的顯微和電鏡照片。圖2為本發(fā)明的洞穴動(dòng)球菌及部分相關(guān)菌株依據(jù)16srrna基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不是對本發(fā)明技術(shù)方案的限定。實(shí)施例1——洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1的分離于云南省石林縣印象煙莊煙田相鄰近的喀斯特洞穴中取土壤樣品，塑料袋密封帶回，4℃保存待用。準(zhǔn)確稱取10g土樣，加入90ml無菌水，30℃、180rpm搖床振蕩30min。用無菌水稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5濃度，分別取0.2ml涂布于lb平板培養(yǎng)基上，每個(gè)設(shè)3個(gè)重復(fù)。在30℃培養(yǎng)48h后，從每份土樣的平板上挑取不同單菌落，在相應(yīng)固體培養(yǎng)基上純化后按菌液體積20％加入甘油、置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。將分離得到的微生物分別接種于lb液體培養(yǎng)基中，于30℃、160rpm搖床振蕩培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)過夜至菌液濃度為od＝2.0，作為種子液備用。將每一待測菌株的種子液按1％接種在篩選培養(yǎng)基中，于30℃、160rpm搖床振蕩培養(yǎng)3-5天，每天觀察發(fā)酵液外觀和香氣特征變化情況，篩選得到能夠產(chǎn)生特殊香味氣息的微生物，編號sysuzl-1。實(shí)施例2——洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1的鑒定分離純化的sysuzl-1進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定。將sysuzl-1分類命名為洞穴動(dòng)球菌(kineococcuscavernaesp.nov.)。sysuzl-1在r2a培養(yǎng)基上的顯微和電鏡照片見附圖1。sysuzl-1在大多數(shù)培養(yǎng)基上生長良好，基內(nèi)菌絲紅褐色到棕色。明膠液化、牛奶凝固、胨化呈陽性，淀粉水解、硝酸還原呈陰性，不產(chǎn)生硫化氫，形成黑色素。能利用葡萄糖、半乳糖、果糖木糖、棉子糖、鼠李糖、蜜二糖、甜醇、甘油、甘露醇、山梨醇、醋酸鈉。細(xì)胞壁含有l(wèi)-二氨基庚二酸和甘氨酸。(表1-3)表1sysuzl-1的培養(yǎng)特征表2sysuzl-1的生理生化特征表3sysuzl-1的碳氮源利用情況碳源利用結(jié)果碳源或氮源利用結(jié)果葡萄糖+蜜二糖+半乳糖+甜醇+果糖+甘油+蔗糖肌醇-阿拉伯糖-甘露醇+木糖+山梨醇+棉子糖+醋酸鈉+鼠李糖+sysuzl-1的16srrna序列見序列表所示。該序列與genbank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行blast比較分析，并從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)種屬的16srrna基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見于圖2。經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的洞穴動(dòng)球菌與菌株(kineococcusradiotoleranssrs30216t)親緣關(guān)系最近，洞穴動(dòng)球菌的16srrna基因序列與kineococcusradiotoleranssrs30216t有99.03的同源性，且dna-dna雜交值低于<70％，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上形成獨(dú)立的分枝。因此，綜合形態(tài)、生理生化、細(xì)胞化學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化分析等特征，洞穴動(dòng)球菌與動(dòng)球菌屬參考菌株kineococcusradiotoleranssrs30216t有明顯差異，表明本發(fā)明的洞穴動(dòng)球菌是一個(gè)新物種，命名為kineococcuscavernaesp.nov.sysuzl-1在genbank數(shù)據(jù)庫的16srrna基因序列登錄號ky593935。中國武漢大學(xué)專利保藏中心菌種保藏號為m2016738。sysuzl-1及部分相關(guān)菌株依據(jù)16srrna基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見附圖2。實(shí)施例3——洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1在發(fā)酵制備煙用香料中的應(yīng)用上述篩選出的洞穴動(dòng)球菌sysuzl-1在發(fā)酵生產(chǎn)煙用香料中的應(yīng)用，具體步驟如下：(1)斜面培養(yǎng)：培養(yǎng)基：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸鈉0.3g；磷酸氫二鉀0.3g；硫酸鎂0.05g；瓊脂15g；蒸餾水1000ml，ph7.2；培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為7d。(2)種子培養(yǎng)：從斜面挑取部分菌絲體接入種子液中，搖瓶培養(yǎng)36小時(shí)。種子培養(yǎng)基：糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸鎂0.5g；磷酸銨0.2g；蒸餾水1000ml，ph7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。(3)發(fā)酵培養(yǎng)：按10％的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)6d。培養(yǎng)基：大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化鈉2.5g；碳酸鈣2g；蒸餾水1000ml，ph7.2，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為6d。將發(fā)酵液進(jìn)行回流提取，過濾除渣，將上清液減壓濃縮得到所需煙用香料。該香料為不澄清棕色液體，將其按0.2‰的量加入到卷煙煙絲中，對照組加入等量蒸餾水。將處理組和對照組的煙絲放入恒溫恒濕箱內(nèi)，在濕度60％±2，溫度22℃±2條件下平衡24h后，制成卷煙。由評吸專家組成的評吸小組進(jìn)行感官評吸。該香料具有十分特殊的香氣，能夠強(qiáng)化卷煙風(fēng)格，豐富煙香，使香氣更加圓潤飽滿，并且具有抗細(xì)菌及真菌的活性，效果穩(wěn)定而持久(表4，表5)。表4sysuzl-1發(fā)酵香料的理化指標(biāo)序號檢測項(xiàng)目sysuzl-1發(fā)酵香料1酸值12.232相對密度d20201.16313折光指數(shù)nd201.42564乙醇中的溶混度(25℃)1體積樣品在1-20體積50％-70％的乙醇溶液中溶解稍好5揮發(fā)成份總量(％)43.46澄清度不澄清7xds未檢出8hzs未檢出表5sysuzl-1發(fā)酵香料的感官評吸表洞穴動(dòng)球菌sysuzl-116srrna1tggctcaggacgaccgctggcggcgtgcttacacatgcaagtcgaacggtgaagcccttc61ggggtggatcagtggcgaacgggtgagtaacacgtgagcaacctgcccctggctctggga121caaccactggaaacggtggctaataccggatacgacctaccaccgcatggtgtgtgggtg181gaaagtttttcggctggggatgggctcgcggcctatcagcttgttggtggggtgatggcc241taccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagac301acggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctg361atgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagctccga421agaagcgcaagtgacggtaggagcagaagaagcaccggctaactacgtgccagcagccgc481ggtaatacgtagggtgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcgg541tgtgtcgcgtctgctgtgaaaactcagggctcaactctgagcttgcagtgggtacgggca601cacttgagtgctgtaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatc661aggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggcagttactgacgctgaggagcgaaa721gcatggggagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgttgggcgcta781ggtgtggggtccattccacggattccgtgccgcagctaacgcattaagcgccccgcctgg841ggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcgga901gcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatgcgcggtgg961aatcccagagatggggtgtcatttagttggtcgcgtacaggtggtgcatggttgtcgtca1021gctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgttccatgttg1081ccagcacttcgggtggggactcatgggagactgccggggtcaactcggaggaaggtgggg1141atgacgtcaaatcatcatgccccttatgtcttgggcttcacgcatgctacaatggccagt1201acagagggctgcgataccgtgaggtggagcgaatcccaaaaagctggtctcagttcggat1261cggggtctgcaactcgaccccgtgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgc1321tgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaaagtcggtaa1381cacccgaagccggtggcccaaccccttgtgggggggagctgtcgaaggtgggactggcga1431ttgggacgaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctggat當(dāng)前第1頁12