本發(fā)明涉及赤潮藻——球形棕囊藻，尤其是涉及其在20l大體積環(huán)境中穩(wěn)定培養(yǎng)的球形棕囊藻的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

赤潮(redtide)又稱有害藻華，是指在某一海域內(nèi),海洋中的浮游微藻、原生動(dòng)物或細(xì)菌等在適宜的環(huán)境條件下大量繁殖或聚集，引起水質(zhì)變壞、海水變色的海洋生態(tài)異?，F(xiàn)象[1]。赤潮作為一種全球性的水污染，它不僅給海洋環(huán)境、海洋漁業(yè)和海水養(yǎng)殖造成嚴(yán)重危害，給世界經(jīng)濟(jì)帶來了無法估量的損失，而且威脅人類的生存[2]。我們只有在充分了解赤潮的成因、赤潮對(duì)人類的危害、赤潮對(duì)世界經(jīng)濟(jì)的影響等諸多方面以后，才能更好防止赤潮的發(fā)生[2]。

1.赤潮成因

赤潮爆發(fā)是一種具有長(zhǎng)遠(yuǎn)歷史的生態(tài)現(xiàn)象，但近些年隨著我國(guó)工業(yè)的發(fā)展，這種現(xiàn)象發(fā)生開始變得更加頻繁。

沿海的工業(yè)、農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖及生活污水的過度排放，大量的廢水污水隨徑流匯集到江河湖海中，促使近海海水水體氮、磷等大量營(yíng)養(yǎng)鹽類激增，造成了近海海水水體的富營(yíng)養(yǎng)化和海域水體的環(huán)境污染；當(dāng)營(yíng)養(yǎng)鹽達(dá)到一定濃度，加上20～30℃的適宜海水溫度及不同的光照強(qiáng)度，就會(huì)使得不同赤潮生物不斷增長(zhǎng)和繁殖；此外，海水鹽度為27‰～30‰，也是引發(fā)赤潮的重要條件；海區(qū)地理位置、地理特征也是爆發(fā)赤潮的影響因素，如淺海區(qū)內(nèi)彎都是赤潮多發(fā)的海域[3]。

并非滿足了以上條件就一定能形成赤潮，適宜在該環(huán)境下生長(zhǎng)的藻類也是必不可少的，能夠引起赤潮的藻類種類繁多。有260種海洋浮游生物能生成赤潮,不同海區(qū)不同環(huán)境條件下,赤潮爆發(fā)時(shí)的優(yōu)勢(shì)藻、規(guī)模數(shù)量各不相同[4]。

2.球形棕囊藻及其培養(yǎng)

glennf.cota[5]等在文獻(xiàn)中描述到球形棕囊藻是一種不同尋常的浮游植物，它能引發(fā)的大規(guī)模赤潮，它復(fù)雜的生活史，和它特別的理化性質(zhì)都注定了其不同尋常。該種浮游植物能在非常廣的溫度和鹽度范圍生長(zhǎng)，從赤道到極地都有其身影。黃思明[6]等描述到球形棕囊藻赤潮是我國(guó)東南沿海典型的高發(fā)赤潮藻種之一，球形棕囊藻在赤潮爆發(fā)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的膠質(zhì)、糖和溶血毒素，同時(shí)消耗大量溶解氧，造成水產(chǎn)品的大量死亡；而且其釋放的二甲基丙磺酸(dmsp)和二甲基硫醚(dms)對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生較大的影響。由此可見，對(duì)球形棕囊藻的防治是很有必要的。

沈萍萍[7]等的研究表明，球形棕囊藻具有一個(gè)比較復(fù)雜的異型生活史,介于兩種不同的細(xì)胞形態(tài)之間:群體和單細(xì)胞。單細(xì)胞又有幾種不同的形式:具有鞭毛的細(xì)胞,不動(dòng)細(xì)胞,小游動(dòng)細(xì)胞等。在實(shí)驗(yàn)室三角瓶中培養(yǎng)時(shí)，球形棕囊藻的生長(zhǎng)周期很長(zhǎng)，一般大于30天。王艷[8]等的研究表明磷是球形棕囊藻生長(zhǎng)的首要影響因子，硝酸鹽也是影響球形棕囊藻生長(zhǎng)速率的重要影響因子，氮磷比例同樣影響球形棕囊藻的生長(zhǎng)；此外，不同株系的球形棕囊藻對(duì)硝酸鹽的需求有很大差別。fe、微量元素以及維生素對(duì)球形棕囊藻的生長(zhǎng)影響不明顯，但在某些條件下fe不足會(huì)限制藻的光和作用，維生素等能影響藻的生物量。故在球形棕囊藻培養(yǎng)中，氮磷等大量元素的添加量直接影響藻的生長(zhǎng)情況。

傳統(tǒng)方法僅適用于無菌、小體積環(huán)境下培養(yǎng)藻種，在20l大體積有菌環(huán)境中培養(yǎng)很困難。逐級(jí)放大培養(yǎng)球形棕囊藻，獲得大體積高密度藻液，有利于我們后期模擬赤潮爆發(fā)過程，揭示其發(fā)生機(jī)制，為研發(fā)球形棕囊藻的調(diào)控技術(shù)提供了重要的技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1]汪艷濤,高強(qiáng),姜少慧.赤潮災(zāi)害監(jiān)測(cè)預(yù)報(bào)與減災(zāi)對(duì)策研究進(jìn)展[j].中國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì),2013(04):161-167.

[2]秦志高.海洋中的赤潮現(xiàn)象及其防治對(duì)策[j].南通航運(yùn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2005(03):46-48.

[3]侯靜,胡成麗.淺談近年我國(guó)赤潮的發(fā)生概況及防治措施[j].現(xiàn)代交際,2014(06):98.

[4]茍釗訓(xùn),任春艷.赤潮的成因及其預(yù)報(bào)初探[j].聊城大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003(04):82-85.

[5]cota,g.f.,smith,w.o.,mitchell,b.g.photosynthesisofphaeocystisinthegreenlandsea[j].limnologyandoceanography,1994,39(4):948-953.

[6]黃思明,尹平河,玲,趙.一株芽孢桿菌對(duì)球形棕囊藻的溶藻效果[j].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版),2013,23(3):337-342.

[7]沈萍萍,呂頌輝.球形棕囊藻的生長(zhǎng)特性及生活史研究[j].水生生物學(xué)報(bào),2000,24(6):635-643.

[8]王艷,齊雨藻,李韶山.球形棕囊藻生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求研究[j].水生生物學(xué)報(bào),2007,31(1):24-29.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供球形棕囊藻的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明包括以下步驟：

1)將培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的有菌球形棕囊藻藻液接入新鮮無菌f/2培養(yǎng)基中，在含f/2的三角瓶中接入藻種，培養(yǎng)；

2)將步驟1)中的600ml藻液全部接入含4l無菌f/2培養(yǎng)基的5l三角瓶中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期；

3)將步驟2)中的4.6l藻液全部接入含10l處理后海水的已消毒養(yǎng)藻缸中，向其中加入營(yíng)養(yǎng)鹽：10ml溶液1，5ml溶液2，1ml溶液3；在溫度20℃，光照2000～3000lux，光照周期12h/12h，通氣量為9l/min條件下培養(yǎng)，早晚各監(jiān)測(cè)一次波長(zhǎng)為440/680nm處的熒光值，熒光強(qiáng)度100對(duì)應(yīng)細(xì)胞個(gè)數(shù)1000個(gè)/μl；

4)生長(zhǎng)一天后，向步驟3)養(yǎng)藻缸中添加處理后海水6l，以及與步驟3)等量的營(yíng)養(yǎng)鹽，早晚各監(jiān)測(cè)一次波長(zhǎng)440/680nm處的熒光值；

5)每天向養(yǎng)藻缸中添加20ml溶液1；早晚各監(jiān)測(cè)一次波長(zhǎng)440/680nm處藻液的熒光值，直到長(zhǎng)至所需細(xì)胞濃度。

在步驟1)中，所述對(duì)數(shù)期可為10天，所述在含f/2的三角瓶可在含400mlf/2的1l三角瓶中接入200ml藻種；所述培養(yǎng)的條件可在溫度20℃，光照強(qiáng)度1400～1500lux，光照周期12h/12h條件下培養(yǎng)10天。

在步驟2)中，所述培養(yǎng)的條件可在溫度20℃，光照4000lux，光照周期12h/12h下培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期10天。

在步驟3)中，所述處理后海水的獲得方法可為：將實(shí)驗(yàn)室ph為7.9～8.1、鹽度為25％～30‰的陳海水用2μm膜過濾，每50l海水添加3ml的8％naclo液體處理過夜，添加1.2gna2s2o3解氯2h，獲得處理后海水。

所述消毒養(yǎng)藻缸的獲得方法可為：

(1)將藻缸清洗干凈后，用0.8％naclo對(duì)藻缸進(jìn)行多次噴霧，等待1天，得養(yǎng)藻缸；

(2)將步驟(1)所述養(yǎng)藻缸用自來水清洗后，再次進(jìn)行噴霧0.8％naclo處理；

(3)在接藻前，用清水沖洗步驟(2)所述養(yǎng)藻缸內(nèi)部，再噴霧75％乙醇消毒，待缸晾干后，用75％乙醇消毒后的塑料膜覆蓋養(yǎng)藻缸。

在步驟4)中，所述營(yíng)養(yǎng)鹽溶液的制備方法可為：

(1)溶液1：稱取nano3150g，nah2po410g，定容至1l蒸餾水中，標(biāo)準(zhǔn)添加量為10ml/20l；

(2)溶液2：稱取na2edta·2h2o8.72g，cl3·6h2o6.3g，uso4·5h2o0.02g，znso4·7h2o0.04g，cocl2·6h2o0.02g，cl2·4h2o0.36g，namoo4·2h2o0.012g，定容至500ml蒸餾水中，標(biāo)準(zhǔn)添加量為5ml/20l；

(3)溶液3：稱取vb10.2g，vb7(生物素)1mg，vb121mg，定容至100ml蒸餾水中，標(biāo)準(zhǔn)添加量1ml/20l。

本發(fā)明通過常規(guī)的1l和5l密閉無菌三角瓶逐級(jí)放大培養(yǎng)獲得穩(wěn)得的球形棕囊藻藻種，將該藻種接入20l體系，在光照強(qiáng)度為2000～3000lux，光照周期12h/12h，溫度為20℃，鹽度30‰，ph為8，通氣量為9l/min，n、p過量的條件下培養(yǎng)。在環(huán)境消毒良好的情況下培養(yǎng)7～10天即可獲得20l體系中具有相應(yīng)細(xì)胞濃度的球形棕囊藻藻液。所述藻液能在較大體系中獲得，對(duì)后期大規(guī)模模擬赤潮爆發(fā)提供可能。為殺藻物質(zhì)處理赤潮藻提供了更大的模擬環(huán)境，對(duì)了解赤潮爆發(fā)的原因提供更多的理論依據(jù)，在藻類大規(guī)模穩(wěn)定培養(yǎng)和赤潮治理方面具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明在20l體系中的培養(yǎng)方法，所述球形棕囊藻密度達(dá)1000個(gè)/μl，顏色呈棕褐色，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

附圖說明

圖1為大量元素加倍對(duì)藻生長(zhǎng)的影響。在圖1中，橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度。

圖2為溶液2(fe，cu等元素)和溶液3(維生素)添加頻次對(duì)藻生長(zhǎng)的影響。在圖2中，橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度。

圖3為光照對(duì)藻生長(zhǎng)的影響。在圖3中，橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度。

圖4為環(huán)境及容器消毒對(duì)藻生長(zhǎng)的影響。在圖4中，橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：n，p對(duì)球形棕囊生長(zhǎng)的影響

1)在光照3300lux，光照周期12h/12h，溫度20℃，消毒徹底的透明玻璃缸中培養(yǎng)球形棕囊藻。

2)表1給出營(yíng)養(yǎng)鹽添加量，其中處理組的溶液1(n，p)添加量加倍，對(duì)照組照常添加，按照表1所述方式，每天分別向?qū)φ战M和和處理組添加營(yíng)養(yǎng)鹽，其中對(duì)照組添加10ml的溶液1，處理組添加20ml的溶液1。

表1

3)每天檢測(cè)藻液在440/680nm處的熒光值，連續(xù)監(jiān)測(cè)1周以上。

4)如圖1可見，溶液1(n，p)的加倍添加可以使藻繼續(xù)生長(zhǎng)。

實(shí)施例2：fe，cu及維生素等對(duì)藻生長(zhǎng)的影響

1)在光照3300lux，光照周期12h/12h，溫度20℃，消毒徹底的透明玻璃缸中培養(yǎng)球形棕囊藻。溶液1按表1所示處理組的量添加，溶液2(fe，cu等)和溶液3(維生素)在對(duì)照組每天供給，實(shí)驗(yàn)組僅在養(yǎng)藻第一天供給。

2)每天檢測(cè)藻液在440/680nm處的熒光值，連續(xù)監(jiān)測(cè)8天。

3)由圖2可以看出，只需補(bǔ)充一次fe，cu及維生素就維持球形棕囊藻細(xì)胞增長(zhǎng)。

實(shí)施例3：光照對(duì)藻生長(zhǎng)的影響

1)在營(yíng)養(yǎng)充足，溫度20℃，消毒徹底，光照周期為12h/12h的透明玻璃缸中培養(yǎng)球形棕囊藻。

2)將步驟1中的藻分別放置于光照強(qiáng)度為3300lux光照強(qiáng)度下作為實(shí)驗(yàn)組，將剩余藻缸置于2200lux光照強(qiáng)度下作為對(duì)照組。

3)每天檢測(cè)不同藻缸在440/680nm處的熒光值，連續(xù)監(jiān)測(cè)10天以上。

4)從圖3可以明顯看出，光照強(qiáng)度較低的對(duì)照組藻同等條件下生長(zhǎng)緩慢。

實(shí)施例4：藻缸及環(huán)境消毒

1)清洗干凈養(yǎng)藻缸后，用0.8％naclo對(duì)養(yǎng)藻缸進(jìn)行噴霧，晾干，用自來水沖洗干凈，再次用0.8％naclo進(jìn)行噴霧處理。

2)將上述養(yǎng)藻缸在紫外燈下照射0.5h處理，接入藻種前用清水沖洗養(yǎng)藻缸內(nèi)部，并噴霧75％乙醇消毒，待缸晾干后使用。

3)對(duì)照組僅用自來水將藻缸沖洗干凈，晾干。

4)本次實(shí)驗(yàn)全部使用75％消毒的全新塑料膜覆蓋藻缸，并且每天用0.8％naclo對(duì)消毒組養(yǎng)藻環(huán)境進(jìn)行處理。

5)正常培養(yǎng)球形棕囊藻，并每天檢測(cè)藻液在440/680nm處的熒光值，連續(xù)監(jiān)測(cè)6天以上，生長(zhǎng)情況如圖4所示?？梢娢磸氐紫镜沫h(huán)境會(huì)導(dǎo)致藻死亡。

實(shí)施例5：熒光值為250時(shí)藻的狀態(tài)

1)在營(yíng)養(yǎng)充足，光照強(qiáng)度為3300lux，光照周期12h/12h，溫度為20℃，通氣量9l/min，消毒徹底的透明玻璃缸中培養(yǎng)球形棕囊藻。

2)培養(yǎng)一周后，藻的熒光值為250時(shí)，顏色呈棕色，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

本發(fā)明屬于定鞭金藻門，棕色，直徑為3～5μm的球形赤潮藻類。通過2μm濾膜過濾，濃度為8％的液體氯酸鈉消毒和硫代硫酸鈉解氯的方法處理海水，將藻種接入其中；增大營(yíng)養(yǎng)鹽添加量特別是n、p添加量，且每天加入；培養(yǎng)過程中定期清理周邊環(huán)境，并將消毒后的透明塑料膜覆蓋于養(yǎng)藻缸上，用濃度為0.8％的次氯酸鈉溶液對(duì)周邊環(huán)境進(jìn)行噴霧消毒，每天兩次。在光照強(qiáng)度為2000～3000lux，光照周期12h/12h，溫度為20℃，鹽度30‰，ph為8，通氣量9l/min的條件下培養(yǎng)。通過1l體系，5l體系，到20l體系的逐級(jí)放大培養(yǎng)，得到所需密度球形棕囊藻藻液。球形棕囊藻逐級(jí)放大培養(yǎng)，獲得大體積，高密度穩(wěn)定球形棕囊藻藻液，有利于我們大規(guī)模模仿赤潮爆發(fā)，為赤潮治理提供更大體積的模擬環(huán)境。所述球形棕囊藻逐級(jí)放大培養(yǎng)方法在赤潮模擬和防治上均有重要意義。