本發(fā)明涉及植物源殺菌劑，具體的說(shuō)是一種別異歐前胡內(nèi)酯衍生物的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蘋(píng)果是我國(guó)的主要經(jīng)濟(jì)作物，尤其膠東蘋(píng)果享譽(yù)全國(guó)，給當(dāng)?shù)貛?lái)巨大經(jīng)濟(jì)效益，但同時(shí)，蘋(píng)果病害對(duì)蘋(píng)果品質(zhì)與產(chǎn)量的影響也日趨嚴(yán)重。蘋(píng)果腐爛病能夠直接侵害果樹(shù)皮層，使蘋(píng)果樹(shù)日漸衰弱，嚴(yán)重的甚至枯死；蘋(píng)果輪紋病又名粗皮病、輪紋爛果病，在我國(guó)蘋(píng)果園區(qū)普遍發(fā)生，常與蘋(píng)果炭疽病等混合發(fā)病。蘋(píng)果輪紋病與蘋(píng)果炭疽病不但危害蘋(píng)果的生長(zhǎng)過(guò)程，也能夠影響蘋(píng)果采后儲(chǔ)藏，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
近年來(lái)，隨著化學(xué)農(nóng)藥大量使用，上述蘋(píng)果病害抗藥性日益嚴(yán)重，隨之也帶來(lái)農(nóng)殘超標(biāo)、環(huán)境污染甚至人畜中毒等問(wèn)題。與化學(xué)農(nóng)藥相比，植物源農(nóng)藥具有選擇性高、毒性較低、易于降解及病蟲(chóng)害不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，成為未來(lái)綠色友好農(nóng)藥發(fā)展的重要方向。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種別異歐前胡內(nèi)酯衍生物的制備及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
一種別異歐前胡內(nèi)酯衍生物，別異歐前胡內(nèi)酯衍生物結(jié)構(gòu)如式（一）所示。
一種別異歐前胡內(nèi)酯衍生物的制備方法，其特征在于：
1）取羌活notopterygiumincisumtingexh.chang的干燥根莖，粉碎，過(guò)篩，并經(jīng)有機(jī)溶劑提取，獲得提取物，待用；
2）將上述提取物進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚–乙酸乙酯及氯仿–甲醇進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，洗脫液經(jīng)薄層層析檢測(cè)；
3）將上述步驟2）中石油醚–乙酸乙酯體積比1:1梯度的洗脫組分，依次進(jìn)行反相硅膠柱層析、sephadexlh-20凝膠柱層析與制備高效液相色譜法分離純化，收集保留時(shí)間tr值為14.1-16.1min的組分，即得式（一）所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物。
所述步驟3）收集保留時(shí)間tr值為15.3min的組分，即得式（一）所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物。
所述步驟1）羌活notopterygiumincisumtingexh.chang的干燥根莖，粉碎，過(guò)20~30目篩，經(jīng)甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、水中的一種或幾種作為有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，獲得提取物。
所述步驟2）中石油醚–乙酸乙酯洗脫梯度為80:1至1:1，氯仿–甲醇洗脫梯度為40:1至1:1。
所述步驟3）中反向硅膠柱層析洗脫液為體積比4:1的甲醇–水，sephadexlh-20凝膠柱層析洗脫液為丙酮，制備高效液相色譜條件為體積比3:2的乙腈–水，流速為3ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。
一種別異歐前胡內(nèi)酯衍生物的應(yīng)用，所述式（一）所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物可用于防治蘋(píng)果病害的活性先導(dǎo)化合物或新農(nóng)藥成分的制備。
所述蘋(píng)果病害為蘋(píng)果腐爛病菌、蘋(píng)果輪紋病菌或蘋(píng)果炭疽病菌。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：式（一）所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌、蘋(píng)果輪紋病菌與蘋(píng)果炭疽病菌等蘋(píng)果主要病害具有較好抑制活性，最小抑制濃度分別為0.256、0.128與0.128mg/ml，可以用于防治蘋(píng)果病害的活性先導(dǎo)化合物或新農(nóng)藥成分的制備；式（一）所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物由羌活notopterygiumincisumtingexh.chang的干燥根莖經(jīng)提取、分離得到，作為植物源天然產(chǎn)物，具有不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、環(huán)境相容性好等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
為闡明對(duì)本發(fā)明特征的理解，下面結(jié)合一些非限定性的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。
實(shí)施例1：別異歐前胡內(nèi)酯衍生物如式（一）所示（結(jié)構(gòu)中的阿拉伯?dāng)?shù)字為碳原子的標(biāo)位）。
實(shí)施例2：別異歐前胡內(nèi)酯衍生物的制備
1）分離純化
取羌活notopterygiumincisumtingexh.chang的干燥根莖，粉碎，過(guò)20目篩，并經(jīng)乙酸乙酯超聲提取3次，合并提取液，減壓蒸餾得到提取浸膏。將其進(jìn)行硅膠vlc（vacuumliquidchromatography）快速柱層析，按照洗脫液極性遞增順序，以體積比80:1至1:1的石油醚—乙酸乙酯（流速為120ml/min），體積比40:1至1:1的氯仿—甲醇（流速為120ml/min）進(jìn)行梯度洗脫。收集洗脫液，并經(jīng)薄層層析檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)以茴香醛-濃硫酸作為顯色劑，根據(jù)rf值以及顯色情況來(lái)合并相同或類似部分。收集石油醚—乙酸乙酯體積比1:1梯度的洗脫組分，將收集的組分進(jìn)行反相硅膠柱層析，以體積比1:9至1:0的甲醇—水（流速為5ml/min）依次進(jìn)行梯度洗脫，收集體積比為4:1的甲醇—水洗脫組分。該組分經(jīng)凝膠柱層析，以丙酮為洗脫溶液（流速為1ml/min），最后經(jīng)制備高效液相色譜分離純化（色譜條件為體積比3:2的乙腈—水，流速3ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm），收集保留時(shí)間tr值為15.3min的組分，即得式（一）所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物。
2）結(jié)構(gòu)鑒定
式（一）所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物，淡黃色晶體，hresimsm/z359.1155[m+na]+，提示分子式為c21h20o4，其1h-和13c-nmr數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。
實(shí)施例3：抑菌活性試驗(yàn)
采用微量稀釋法，測(cè)定式（一）所示化合物對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌、蘋(píng)果輪紋病菌與蘋(píng)果炭疽病菌的抑菌活性（《從天然產(chǎn)物到新農(nóng)藥創(chuàng)制-原理方法》，吳文君，2006，化學(xué)工業(yè)出版社）。
1）菌懸液的制備
將供試真菌接種于pda培養(yǎng)基表面于28℃培養(yǎng)72h后，吸取2ml無(wú)菌0.85%nacl溶液（含0.25%吐溫-20）洗滌培養(yǎng)物，并用玻璃刮刀將菌落輕輕刮下。吸取適量菌懸液于無(wú)菌試管中，調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷幔ㄏ喈?dāng)于1.5×108cfu/ml）備用。
2）樣品的配制
取1mg待測(cè)樣品（式（一）所示化合物），溶解于100μl50%dmso中，充分混勻后，吸取50μl樣品溶液到另一只離心管中，接著加入50μl50%dmso，得到濃度減半的樣品溶液。按照此方法，得到6組濃度依次減半的樣品溶液。
3）mic測(cè)定方法
（1）采用無(wú)菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的樣品溶液分別加到無(wú)菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第6孔各加5μl的樣品溶液，并以不加樣品孔作為空白對(duì)照，加5μl50%dmso溶液孔為溶劑對(duì)照。
（2）將相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊闹甘揪鷳乙?，?jīng)pdb培養(yǎng)基稀釋1000倍后，取95μl依次加入到96孔板中，使得第1至第6孔的樣品濃度依次為512、256、128、64、32、16μg/ml。以上所有樣品均重復(fù)三次。輕輕震蕩混勻后，將96孔板密封置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
（3）在600nm波長(zhǎng)下使用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光值，以在小孔內(nèi)完全抑制指示菌生長(zhǎng)的最低樣品濃度為該化合物的mic。（注意：當(dāng)陰性對(duì)照孔內(nèi)指示菌明顯生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)才有意義；當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)單一的跳孔時(shí)，應(yīng)記錄抑制菌株生長(zhǎng)的最高藥物濃度；如出現(xiàn)多處跳孔，則不應(yīng)報(bào)告結(jié)果，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。）
試驗(yàn)結(jié)果為：式（一）所示化合物對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌、蘋(píng)果輪紋病菌與蘋(píng)果炭疽病菌等蘋(píng)果主要病害具有較好抑制活性，最小抑制濃度分別為0.256、0.128與0.128mg/ml，具有較好抑菌活性。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明所涉及的化合物具有較好抑菌活性，可以用于防治蘋(píng)果病害的活性先導(dǎo)化合物或新農(nóng)藥成分的制備。