本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
的檢測方法，具體涉及一種塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr檢測特異性引物、探針及檢測方法。
背景技術(shù)：
：塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirus，svv)為單股正鏈rna病毒，屬于小核糖核酸病毒科(picornaviridae)senecavirus病毒屬。svv最初是2002年在per.c6細(xì)胞培養(yǎng)物中被發(fā)現(xiàn)，2007年認(rèn)定svv為導(dǎo)致美國一批屠宰場中的豬群出現(xiàn)水皰癥狀的致病原，直到2015年才出現(xiàn)新的報(bào)道，巴西和美國均爆發(fā)了多起svv疫情，多個(gè)階段的豬只均能感染，鼻鏡、唇部和蹄部等部位出現(xiàn)水皰，并導(dǎo)致小天齡仔豬死亡，造成較大的損失。隨后有報(bào)道顯示國內(nèi)也出現(xiàn)了塞尼卡谷病毒，由于之前國內(nèi)從來沒有出現(xiàn)過，因而沒有現(xiàn)成的檢測方法，直至目前國內(nèi)仍少見塞尼卡谷病毒的檢測方法，主要原因是該病為新病，相關(guān)研究較少，已有的rt-pcr檢測方法只能進(jìn)行定性檢測不能做精確定量分析，且擴(kuò)增后需要經(jīng)過電泳判斷結(jié)果，每次檢測的樣品數(shù)量較少、對(duì)低含量的樣品分辨率不足等缺點(diǎn)。由此可見，現(xiàn)有技術(shù)還有待改進(jìn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于此，有必要針對(duì)上述問題提供一種塞尼卡谷病毒的taqman-mgb熒光定量pcr檢測引物、探針及檢測方法，具有實(shí)時(shí)、快速、靈敏度高、特異性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，有利于較大規(guī)模的定量檢測分析。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種塞尼卡谷病毒的taqman-mgb熒光定量pcr檢測引物，其核苷酸序列為：上游引物：5’-ttatagaatttggaagccatgct-3’(seqidno:1)下游引物：5’-atcagaatgcagcttctcgagtag-3’(seqidno:2)。一種塞尼卡谷病毒的taqman-mgb熒光定量pcr檢測探針，其核苷酸序列為：5’-cctacttcaaaccaggaac-3’(seqidno:3)。進(jìn)一步的，所述探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(fam)；所述探針的3’端標(biāo)記小溝結(jié)合物(mgb)和熒光淬滅基團(tuán)(nfq)。一種塞尼卡谷病毒的taqman-mgb熒光定量pcr檢測方法：(1)制定塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)提取樣品中的病毒rna，-20℃～-80℃冷凍保存?zhèn)溆茫?3)將(2)中的樣品病毒rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得逆轉(zhuǎn)錄cdna產(chǎn)物-20℃～-80℃冷凍保存?zhèn)溆茫?4)將(3)所得的樣本cdna產(chǎn)物作為模板進(jìn)行taqman-mgb熒光定量pcr反應(yīng)；(5)結(jié)合步驟(1)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，判讀檢測結(jié)果。進(jìn)一步的，所述taqman-mgb熒光定量pcr檢測方法步驟(1)中，塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線制定步驟是：(1)在上述引物(seqidno:1和seqidno:2)兩側(cè)的基因組序列上，設(shè)計(jì)一對(duì)新的克隆引物psv1u和psv1d，其擴(kuò)增片段長度為371bp，涵蓋了熒光定量引物擴(kuò)增片段(69bp)的全部，該對(duì)克隆引物的引物序列如下：psv1u：5’-atcgccaacggtgacga-3’(seqidno:4)；psv1d：5’-tgctggtactcgtgactc-3’(seqidno:5)，(2)以塞尼卡谷病毒陽性樣品rna(即命名為ch-01-2015株(kt321458)的病毒病料)為模板，利用(1)中所得引物，進(jìn)行一步法rt-pcr擴(kuò)增，獲得用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的目的dna片段；其中50μl反應(yīng)體系為：primescript1stepenzymemix：2μl，2×onestepbuffer：25μl，seqidno:4(10μm)：2μl，seqidno:5(10μm)：2μl，模板rna：1μl，無核酸酶蒸餾水：補(bǔ)足至50μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃，30min；94℃，2min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)30個(gè)循環(huán)；72℃，10min；4℃降溫；(3)將(2)中所得dna片段與pmd19-t載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109感受態(tài)，挑取陽性克隆，進(jìn)行測序鑒定后將重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)并抽提重組質(zhì)粒；將提取的重組質(zhì)粒按1010～101拷貝數(shù)/μl的濃度梯度稀釋成標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品，分裝成小管后-20℃～-80℃冷凍保存?zhèn)溆茫?4)將(3)所得的樣本標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，各濃度梯度樣品分別進(jìn)行taqman-mgb熒光定量pcr反應(yīng)；(5)根據(jù)步驟(4)的反應(yīng)結(jié)果繪制塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)一步的，所述taqman-mgb熒光定量pcr檢測方法步驟(3)中，10μl逆轉(zhuǎn)錄體系為：5×primerrtmastermix:2μl，樣品rna:1～4μl，rnasefreedh2o:補(bǔ)足至10μl；逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?7℃，15min；85℃，5s；4℃或16℃降溫。進(jìn)一步的，所述taqman-mgb熒光定量pcr檢測方法步驟(4)或塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線制定方法步驟(4)中的taqman-mgb熒光定量pcr反應(yīng)，20μl反應(yīng)體系為：組分用量(μl)2×premixextaq(probeqpcr)10上游引物seqidno:1(10μm)1.2下游引物seqidno:2(10μm)1.6mgb探針seqidno:3(10μm)0.650×roxreferencedyeii0.4標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品或樣品cdna模板1.0無核酸酶蒸餾水補(bǔ)足至20μl上表所述模板為樣本rna逆轉(zhuǎn)錄所得的cdna產(chǎn)物或各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，30s；(95℃，5s；60℃，34s)40個(gè)循環(huán)。本發(fā)明有益效果：taqman-mgb探針法熒光定量pcr技術(shù)相比于目前的普通rt-pcr技術(shù)，具有簡單快速、易操作、結(jié)果直觀、靈敏度高、穩(wěn)定性好、實(shí)時(shí)定量等優(yōu)點(diǎn)，與sybr等染料法熒光定量pcr技術(shù)相比，具有更好的特異性，并能縮短反應(yīng)時(shí)間，而與taqman-tamra探針法熒光定量pcr技術(shù)相比，由于本發(fā)明引物序列在現(xiàn)有已報(bào)道的塞尼卡谷病毒中保守性好，與其它物種基因相似性低，特異性好,擴(kuò)增片段長度短，擴(kuò)增速度快；且使用了mgb，能提高tm值，從而縮短探針長度，有利于探針設(shè)計(jì)，且提高了配對(duì)與非配對(duì)模板間的tm值差異，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定和精確。附圖說明圖1塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線：從左至右分別對(duì)應(yīng)濃度103～108copies/μl的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品。圖2塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖中s曲線為svv陽性樣品的擴(kuò)增曲線。圖3塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr方法敏感性實(shí)驗(yàn)：從左至右的8條曲線分別對(duì)應(yīng)濃度108～101copies/μl的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品。具體實(shí)施方式為了更好地說明本發(fā)明所解決的問題、所采用的技術(shù)方案和所達(dá)到的效果，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例和相關(guān)資料進(jìn)一步闡述。需要說明的是，本
發(fā)明內(nèi)容包含但不限于以下實(shí)施例及其組合實(shí)施方式。實(shí)施例一1.引物和taqman-mgb探針設(shè)計(jì)從genbank中檢索獲得塞尼卡谷病毒全基因組序列(genbank登錄號(hào)為nc_011349，kc667560和kt321458)，通過dnastar軟件進(jìn)行序列比對(duì)，找出塞尼卡谷病毒基因組特異性的保守序列，然后blast進(jìn)一步確定其保守性。通過oligo6.0引物設(shè)計(jì)軟件對(duì)該保守序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，得到一對(duì)特異性引物和一條mgb探針，引物和探針位于單一orf的3’端附近(7021～7089位)，目的擴(kuò)增片段為69bp。上游引物：5’-ttatagaatttggaagccatgct-3’(seqidno:1)下游引物：5’-atcagaatgcagcttctcgagtag-3’(seqidno:2)探針：fam-5’-cctacttcaaaccaggaac-3’-mgb-nfq(seqidno:3)2.定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建和制備在上述引物(seqidno:1和seqidno:2)兩側(cè)的基因組序列上，設(shè)計(jì)一對(duì)新的克隆引物psv1u和psv1d，其擴(kuò)增片段長度為371bp，涵蓋了熒光定量引物擴(kuò)增片段(69bp)的全部，該對(duì)克隆引物的引物序列如下：psv1u：5’-atcgccaacggtgacga-3’(seqidno:4)psv1d：5’-tgctggtactcgtgactc-3’(seqidno:5)；以本實(shí)驗(yàn)室檢測陽性并經(jīng)測序鑒定過的塞尼卡谷病毒陽性樣品(即命名為ch-01-2015株(kt321458)的病毒病料)rna為模板，利用上述引物(seqidno:4和seqidno:5)，按照takara公司primescripttmonesteprt-pcrkitver.2試劑盒說明書進(jìn)行一步法rt-pcr擴(kuò)增，其中50μl反應(yīng)體系為：primescript1stepenzymemix：2μl，2×onestepbuffer：25μl，seqidno:4(10μm)：2μl，seqidno:5(10μm)：2μl，模板rna：1μl，無核酸酶蒸餾水：補(bǔ)足至50μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃，30min；94℃，2min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)30個(gè)循環(huán)；72℃，10min；4℃降溫。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)一步進(jìn)行膠回收，獲得用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的目的dna片段。將此dna片段與pmd19-t載體(購自takara公司)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109感受態(tài)(購自takara公司)，挑取陽性克隆，并進(jìn)行測序鑒定，鑒定后將重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)并抽提重組質(zhì)粒。鑒定好的重組質(zhì)粒用核酸濃度測定儀測定質(zhì)粒濃度，并換算為質(zhì)粒拷貝數(shù)。質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μl)＝[質(zhì)粒濃度(ng/μl)×6.02×1023]/[質(zhì)粒分子量(g/mol)×109]。將重組質(zhì)粒稀釋成1010～101copies/μl的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度梯度，分裝成小管后-70℃凍存?zhèn)溆谩?.樣品中病毒rna的提取使用axygen的dna/rna小量提取試劑盒，按照使用說明書提取樣品病毒rna，-70℃保存。4.樣品中病毒rna的逆轉(zhuǎn)錄按照takara公司primescripttmrtmastermix試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cdna，10μl逆轉(zhuǎn)錄體系如下：5×primerrtmastermix:2μl，rnasefreedh2o:4μl，樣品rna:4μl。將各試劑混合均勻，置pcr儀中按以下程序進(jìn)行：37℃15min，85℃5sec，4℃降溫結(jié)束，反應(yīng)結(jié)束后的cdna產(chǎn)物-20℃保存用于熒光定量pcr檢測。5.taqman-mgb熒光定量pcr反應(yīng)條件的優(yōu)化參照takarapremixextaqtm(probeqpcr)試劑盒使用說明書，通過對(duì)反應(yīng)體系中不同的引物濃度、mgb探針濃度、退火溫度等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行比較，選擇反應(yīng)靈敏度高、本底熒光信號(hào)低、具有典型s型擴(kuò)增熒光信號(hào)曲線、擴(kuò)增效率接近1的反應(yīng)條件。經(jīng)優(yōu)化后的20μl反應(yīng)體系如下表：組分用量(μl)2×premixextaq(probeqpcr)10上游引物(10μm)1.2下游引物(10μm)1.6mgb探針(10μm)0.650×roxreferencedyeii0.4標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品或樣品cdna模板1.0rnasefreedh2o5.2優(yōu)化后的反應(yīng)條件為：95℃30s；(95℃5s，60℃34s)40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)觀察記錄標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品或樣品cdna模板的試驗(yàn)結(jié)果。將各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品分別經(jīng)上述taqman-mgb熒光定量pcr反應(yīng)，根據(jù)其結(jié)果繪制塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2＝1.000，擴(kuò)增效率為100.5％。6.檢測結(jié)果的判定經(jīng)檢測，若待檢樣品中含有塞尼卡谷病毒基因則顯示陽性擴(kuò)增曲線，若待檢樣品中不含有塞尼卡谷病毒基因則無擴(kuò)增信號(hào)。陽性樣品中的塞尼卡谷病毒基因濃度可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，即在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到某個(gè)樣品所對(duì)應(yīng)的ct值，就能對(duì)應(yīng)得到該樣品的具體濃度。實(shí)施例二塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr方法特異性實(shí)驗(yàn)分別以svv陽性樣品、prv陽性樣品、pcv2陽性樣品、prrsv陽性樣品、fmdv陽性樣品、pedv陽性樣品、rv陽性樣品、csfv陽性樣品、pdcov陽性樣品為模板，以蒸餾水為陰性對(duì)照按實(shí)施例一中taqman-mgb熒光定量pcr反應(yīng)的操作方法分別進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)時(shí)觀察并記錄各樣品反應(yīng)結(jié)果，如圖2所示，只有svv陽性樣品出現(xiàn)良好的s型曲線，其余樣品均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，說明該方法特異性良好。實(shí)施例三塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr方法敏感性實(shí)驗(yàn)以實(shí)施例一中制備的濃度梯度為101～108copies/μl的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品作為模板，分別按照實(shí)施例一中taqman-mgb熒光定量pcr反應(yīng)的操作方法分別進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)時(shí)觀察并記錄各樣品反應(yīng)結(jié)果，如圖3所示，所有濃度的樣品均表現(xiàn)出良好的擴(kuò)增曲線，說明該方法靈敏度好。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。<110>廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司<120>塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr檢測引物、探針及檢測方法<160>5<170>oligo6.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1ttatagaatttggaagccatgct23<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<400>2atcagaatgcagcttctcgagtag24<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3cctacttcaaaccaggaac19<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列<400>4atcgccaacggtgacga17<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5tgctggtactcgtgactc18當(dāng)前第1頁12