本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及為一種提高胰島素及其類似物前體表達(dá)的畢赤酵母發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝疾病。近年來(lái)，全世界糖尿病的患病率都在迅猛增長(zhǎng)。2015年，全球成年糖尿病患者數(shù)量達(dá)4.15億，其中，中國(guó)的糖尿病患者人數(shù)超過(guò)了1億。糖尿病成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的另一個(gè)嚴(yán)重危害人民健康的重要慢性非傳染性疾病。糖尿病的急、慢性并發(fā)癥，尤其是慢性病并發(fā)癥累及多個(gè)器官，致殘、致死率高，嚴(yán)重影響患者的身心健康，并給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。
胰島素治療一直被當(dāng)作是治療糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。上世紀(jì)70年代，人們通過(guò)基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)出了重組人胰島素。到90年代，隨著胰島素技術(shù)的不斷發(fā)展，人們又相繼開(kāi)發(fā)出了具有不同作用時(shí)間特點(diǎn)的新一代胰島素類似物，例如賴脯胰島素、門冬胰島素、賴谷胰島素、地特胰島素、德谷胰島素、甘精胰島素等。
在外源蛋白的表達(dá)過(guò)程中，畢赤酵母的胞內(nèi)和胞外均有一定量的蛋白酶的表達(dá)，因此大多數(shù)外源蛋白均面臨著被降解的問(wèn)題。尤其是發(fā)酵培養(yǎng)后期，由于營(yíng)養(yǎng)成分的缺失及有毒副產(chǎn)物的累積，大量細(xì)胞活性降低或裂解，從而釋放出更多的蛋白酶。蛋白酶的存在不僅影響到目標(biāo)蛋白的質(zhì)量，同時(shí)也降低目標(biāo)蛋白的產(chǎn)率。因此，為保證目標(biāo)產(chǎn)物的質(zhì)量及產(chǎn)量，行業(yè)內(nèi)通常會(huì)提前終止培養(yǎng)。
畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中通常使用氨水來(lái)控制ph，該方法的優(yōu)勢(shì)在于ph控制的較為穩(wěn)定。然而，由于氨水具有強(qiáng)烈的腐蝕性和刺激性且易爆，在使用和儲(chǔ)存過(guò)程中存在較大的風(fēng)險(xiǎn)。另外，由于氨水不能滅菌，只能通過(guò)過(guò)濾器進(jìn)行除菌，增加了過(guò)濾器及其驗(yàn)證的成本。
畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程上的菌體濃度測(cè)定通常采用濕重法(wcw)或吸光度法(od600)，這兩種測(cè)量方法均有較大誤差，且培養(yǎng)基中的顆粒和死細(xì)胞均能被檢測(cè)到，因此所測(cè)得的值不能反映真正活細(xì)胞的量。同時(shí)，這兩種方法操作較為麻煩且涉及到取樣操作，增加了染菌風(fēng)險(xiǎn)。另外，使用該方法通常幾個(gè)小時(shí)測(cè)量一次，不能反映菌體的實(shí)時(shí)狀態(tài)，很多關(guān)鍵階段和異常情況可能會(huì)被漏掉。
畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中的碳源(甘油、甲醇等)的補(bǔ)加方式通常采用恒速補(bǔ)加、遞增減或者恒定比生長(zhǎng)速率，這幾種方法均不能根據(jù)畢赤酵母的實(shí)時(shí)生長(zhǎng)特性來(lái)進(jìn)行碳源的補(bǔ)加。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種提高胰島素及其類似物前體表達(dá)的畢赤酵母發(fā)酵方法。
本發(fā)明技術(shù)方案為：
一種提高胰島素及其類似物前體表達(dá)的畢赤酵母發(fā)酵方法，所述發(fā)酵方法包括如下步驟：
1)起始生長(zhǎng)階段：將畢赤酵母菌株接種于發(fā)酵起始培養(yǎng)基中，接種濃度為2.0-6.0×105cfu/ml，溫度控制在28-32℃，空氣通入比為1.0-1.5vvm，隨著菌體濃度逐漸增加，起始培養(yǎng)基中的碳源逐漸被消耗，溶氧值也逐漸下降，通過(guò)攪拌控制溶氧值≥50％；至發(fā)酵起始培養(yǎng)基碳源被消耗盡后，溶氧值開(kāi)始反彈，反彈至80％時(shí)該階段結(jié)束；
2)甘油補(bǔ)加階段：所述步驟1)溶氧值反彈至80％時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加甘油溶液，設(shè)定甘油起始補(bǔ)加速率f0＝8-12g/l(畢赤酵母菌液)/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甘油補(bǔ)加速率，使菌體活細(xì)胞呈指數(shù)生長(zhǎng)，從而獲得大量的有較高活性的菌體，控制溫度為28-32℃，空氣通入比為1.0-1.5vvm，溶氧值≥30％，ph4.0-6.0；當(dāng)實(shí)時(shí)活細(xì)胞濃度(即活細(xì)胞電容率)x＝17-19pf/cm時(shí)，停止補(bǔ)加甘油；
3)甲醇誘導(dǎo)階段：停止補(bǔ)加甘油30-50min后，開(kāi)始補(bǔ)加甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，設(shè)定起始甲醇補(bǔ)加速率f0＝3-7g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甲醇補(bǔ)加速率，使得畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白(胰島素及其類似物)的增加量基本能夠維持在每小時(shí)增加0.04g/l的速度，控制溫度為25-28℃，空氣通入比為1.5-2.5vvm，溶氧值≤10％，ph4.0-6.0；
4)發(fā)酵培養(yǎng)到80-100h時(shí)，以與甲醇相同補(bǔ)加速率連續(xù)補(bǔ)加有機(jī)氮源，發(fā)酵培養(yǎng)130-180h結(jié)束。
優(yōu)選地，所述菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型為ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率，μt表示t時(shí)的比生長(zhǎng)速率，ft+△t表示t+△t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率。
優(yōu)選地，所述發(fā)酵起始培養(yǎng)基組成為：
甘油20-40g/l，尿素5-8g/l，caso4·2h2o0.4-1.0g/l，mgso45-8g/l，koh20-30g/l，h3po420-30ml/l，ptm1溶液2-6ml/l，消泡劑1-3ml/l。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述ptm1溶液為cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
優(yōu)選地，所述步驟2)、步驟3)過(guò)程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
優(yōu)選地，所述步驟2)甘油溶液的組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟3)甲醇溶液組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟4)有機(jī)氮源為50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
優(yōu)選地，所述步驟4)補(bǔ)加有機(jī)氮源的方法還可以采用放掉20％-60％的發(fā)酵液，快速補(bǔ)加同等體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基的方法。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為：caso40.1-0.5g/l，mgso45-10g/l，koh5-10g/l，h3po410-20g/l，有機(jī)氮源5-10g/l。
本發(fā)明有益效果：
1、發(fā)酵起始培養(yǎng)基：畢赤酵母發(fā)酵通常采用bmgy/bsm培養(yǎng)基。bmgy培養(yǎng)基含有較高比例的酵母提取物和蛋白胨，其單位體積的成本過(guò)高，并且動(dòng)物來(lái)源的蛋白胨存在著外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。另外，在d/c級(jí)潔凈生產(chǎn)環(huán)境中配制培養(yǎng)基時(shí)，大量的有機(jī)物質(zhì)粉末會(huì)對(duì)潔凈環(huán)境造成很大的影響。bsm培養(yǎng)基不存在上述影響，但含有氨水。本發(fā)明優(yōu)化的起始培養(yǎng)基不含有機(jī)氮源，且用尿素代替了氨水，不存在上述問(wèn)題。
2、發(fā)酵過(guò)程中的ph控制：本發(fā)明發(fā)酵過(guò)程中的ph控制用尿素代替氨水，解決了刺激性及防爆的問(wèn)題。同時(shí)，尿素可以在線蒸汽滅菌，替代了氨水的過(guò)濾除菌方法，使得成本大大降低。另外，尿素代替氨水，氮源的利用率增加，提高了胰島素及其類似物前體的表達(dá)量。
3、在發(fā)酵的中后期，本發(fā)明通過(guò)連續(xù)或半連續(xù)補(bǔ)加少量微生物或植物來(lái)源的有機(jī)氮源來(lái)延長(zhǎng)發(fā)酵周期，在保證目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量的同時(shí)，提高了其產(chǎn)量。原因在于：一方面提供為菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)元素；另一方面，由于有機(jī)氮源中含有大量的多肽或蛋白質(zhì)，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合發(fā)酵液中的蛋白酶，從而減少了目標(biāo)蛋白降解。另外，所涉及到的有機(jī)氮源是微生物來(lái)源或植物來(lái)源的，對(duì)于胰島素等生物制品，無(wú)病毒攜帶風(fēng)險(xiǎn)。
4、發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)活細(xì)胞在線檢測(cè)數(shù)據(jù)擬合菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，并根據(jù)此模型自動(dòng)設(shè)定碳源(前期甘油，后期甲醇)補(bǔ)加速率。
1)該方法采用在線活細(xì)胞檢測(cè)法替代了濕重法和吸光度法來(lái)測(cè)量菌體濃度。首先，該方法檢測(cè)到的只有活細(xì)胞，培養(yǎng)基中的顆粒及死細(xì)胞檢測(cè)不到，因此通過(guò)該方法可以了解到菌體的真實(shí)狀態(tài)；其次，該方法可以在線檢測(cè)菌體活細(xì)胞濃度，避免了取樣及樣品處理過(guò)程；最后，該方法可實(shí)時(shí)了解菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而可實(shí)時(shí)調(diào)控發(fā)酵過(guò)程。
2)該方法通過(guò)采集到的活細(xì)胞濃度實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)(x)，計(jì)算出實(shí)時(shí)比生長(zhǎng)速率(μt)，然后根據(jù)模型ft+△t＝(1+μt)ft得出實(shí)時(shí)碳源補(bǔ)加速率(ft+△t)。這種補(bǔ)料方法可根據(jù)菌體的生長(zhǎng)特征實(shí)時(shí)調(diào)整碳源補(bǔ)加速率，從而根據(jù)需求進(jìn)行發(fā)酵調(diào)控：誘導(dǎo)前，可獲得大量的活性高的菌體；誘導(dǎo)后，可獲得大量的、質(zhì)量穩(wěn)定的目標(biāo)蛋白。另外，該方法可實(shí)現(xiàn)從小試直接到生產(chǎn)的順利放大。
模型來(lái)源：根據(jù)微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)μx＝dx/dt，可得μ＝dx/dt/x。對(duì)于本發(fā)明，x表示t時(shí)的電容率(單位是pf/cm，可間接表示活細(xì)胞量)。根據(jù)底物消耗方程，△s＝m1x+m2μx+m3△p，其中，m1、m2和m3是比例系數(shù)。由于本發(fā)明所涉及的畢赤酵母發(fā)酵方式為高密度發(fā)酵，相對(duì)菌體濃度x，菌體增長(zhǎng)量μx和目標(biāo)蛋白增長(zhǎng)量△p的值均較小可以忽略不計(jì)，因此，△s＝m1x。折算到單位時(shí)間內(nèi)，則該方程為ft＝m1xt，其中，ft是t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率。那么ft+△t＝m1xt+△t，ft+△t/ft＝m1xt+△t/m1xt＝xt+△t/xt＝1+μt，即ft+△t＝(1+μt)ft，其中，μt是t時(shí)的比生長(zhǎng)速率。設(shè)定起始補(bǔ)加速率f0，通過(guò)活細(xì)胞濃度x計(jì)算出μt，那么就可以計(jì)算出△t后的補(bǔ)加速率ft+△t。
綜述，本發(fā)明有益效果為：
(1)在保證目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量的同時(shí)，產(chǎn)量提高30％以上。對(duì)于同一表達(dá)體系而言，本發(fā)明所達(dá)到的產(chǎn)量在國(guó)內(nèi)外屬于較高水平。
(2)本發(fā)明涉及的產(chǎn)品包括重組人胰島素、甘精胰島素和門冬胰島素。三種不同的產(chǎn)品可以共用一套工藝，從而提高了工廠生產(chǎn)操作簡(jiǎn)便性。
(3)發(fā)酵后期補(bǔ)充有機(jī)氮源克服了生產(chǎn)規(guī)模由于設(shè)備局限原因造成的對(duì)培養(yǎng)不利的因素(如攪拌速率低、控溫難等)。同時(shí)，由于有機(jī)氮源中含有大量的多肽或蛋白質(zhì)，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合發(fā)酵液中的蛋白酶，從而減少了目標(biāo)蛋白降解。另外，補(bǔ)充有機(jī)氮源顯著改善發(fā)酵后期do水平并延長(zhǎng)了發(fā)酵周期，提高了前體的表達(dá)量。
(4)本發(fā)明所涉及到的有機(jī)氮源是微生物來(lái)源或植物來(lái)源的，對(duì)于胰島素等生物制品，無(wú)病毒攜帶風(fēng)險(xiǎn)。
(5)相對(duì)于產(chǎn)品附加值，本發(fā)明所涉及到的有機(jī)氮源的成本很低。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。
實(shí)施例1
一種提高重組人胰島素前體表達(dá)的畢赤酵母發(fā)酵方法，所述發(fā)酵方法包括如下步驟：
1)起始生長(zhǎng)階段：接種濃度為2.0×105cfu/ml，溫度控制在32℃，空氣通入比為1.5vvm，通過(guò)攪拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油補(bǔ)加階段：溶氧值反彈至80％時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加甘油溶液，設(shè)定甘油起始補(bǔ)加速率f0＝12g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甘油補(bǔ)加速率，使菌體活細(xì)胞呈指數(shù)(x＝1.25*1.1t，x表示活細(xì)胞濃度，即活細(xì)胞電容率，t表示時(shí)間)生長(zhǎng)，從而獲得大量的有較高活性的菌體，控制溫度為32℃，空氣通入比為1.0vvm，溶氧值≥30％，ph5.0；當(dāng)實(shí)時(shí)活細(xì)胞濃度(即活細(xì)胞電容率)x＝17pf/cm時(shí)，停止補(bǔ)加甘油；
3)甲醇誘導(dǎo)階段：停止補(bǔ)加甘油50min后，開(kāi)始補(bǔ)加甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，設(shè)定起始甲醇補(bǔ)加速率f0＝7g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甲醇補(bǔ)加速率，使得目標(biāo)蛋白的增加量基本能夠維持在每小時(shí)增加0.04g/l的速度，控制溫度為28℃，空氣通入比為2.5vvm，溶氧值≤10％，ph6.0；
4)發(fā)酵培養(yǎng)到80h時(shí)，以與甲醇相同補(bǔ)加速率連續(xù)補(bǔ)加有機(jī)氮源，發(fā)酵培養(yǎng)180h結(jié)束。
優(yōu)選地，所述菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型為ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率，μt+△t表示t+△t時(shí)的比生長(zhǎng)速率，ft+△t表示t+△t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率。
優(yōu)選地，所述發(fā)酵起始培養(yǎng)基組成為：
甘油20-40g/l，尿素5-8g/l，caso4·2h2o0.4-1.0g/l，mgso45-8g/l，koh20-30g/l，h3po420-30ml/l，ptm1溶液2-6ml/l，消泡劑1-3ml/l。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述ptm1溶液為cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
優(yōu)選地，所述步驟2)、步驟3)過(guò)程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
優(yōu)選地，所述步驟2)甘油溶液的組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟3)甲醇溶液組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟4)有機(jī)氮源為50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
優(yōu)選地，所述步驟4)補(bǔ)加有機(jī)氮源的方法還可以采用放掉20％-60％的發(fā)酵液，快速補(bǔ)加同等體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基的方法。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為：caso40.5g/l，mgso410g/l，koh10g/l，h3po420g/l，有機(jī)氮源10g/l。
實(shí)施例2
一種提高重組人胰島素前體表達(dá)的畢赤酵母發(fā)酵方法，所述發(fā)酵方法包括如下步驟：
1)起始生長(zhǎng)階段：接種濃度為6.0×105cfu/ml，溫度控制在28℃，空氣通入比為1.0vvm，通過(guò)攪拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油補(bǔ)加階段：溶氧值反彈至80％時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加甘油溶液，設(shè)定甘油起始補(bǔ)加速率f0＝8g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甘油補(bǔ)加速率，使菌體活細(xì)胞呈指數(shù)(x＝1.5*1.2t，x表示活細(xì)胞濃度，即活細(xì)胞電容率，t表示時(shí)間)生長(zhǎng)，從而獲得大量的有較高活性的菌體，控制溫度為28℃，空氣通入比為1.0vvm，溶氧值≥30％，ph4.0；當(dāng)實(shí)時(shí)活細(xì)胞濃度(即活細(xì)胞電容率)x＝17pf/cm時(shí)，停止補(bǔ)加甘油；
3)甲醇誘導(dǎo)階段：停止補(bǔ)加甘油30min后，開(kāi)始補(bǔ)加甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，設(shè)定起始甲醇補(bǔ)加速率f0＝3g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甲醇補(bǔ)加速率，使得目標(biāo)蛋白的增加量基本能夠維持在每小時(shí)增加0.04g/l的速度，控制溫度為25℃，空氣通入比為1.5vvm，溶氧值≤10％，ph4.0；
4)發(fā)酵培養(yǎng)到80h時(shí)，以與甲醇相同補(bǔ)加速率連續(xù)補(bǔ)加有機(jī)氮源，發(fā)酵培養(yǎng)130h結(jié)束。
優(yōu)選地，所述菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型為ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率，μt+△t表示t+△t時(shí)的比生長(zhǎng)速率，ft+△t表示t+△t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率。
優(yōu)選地，所述發(fā)酵起始培養(yǎng)基組成為：
甘油20g/l，尿素5g/l，caso4·2h2o0.4g/l，mgso45g/l，koh20g/l，h3po420ml/l，ptm1溶液2ml/l，消泡劑1ml/l。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述ptm1溶液為cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
優(yōu)選地，所述步驟2)、步驟3)過(guò)程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
優(yōu)選地，所述步驟2)甘油溶液的組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟3)甲醇溶液組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟4)有機(jī)氮源為50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
優(yōu)選地，所述步驟4)補(bǔ)加有機(jī)氮源的方法還可以采用放掉20％的發(fā)酵液，快速補(bǔ)加同等體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基的方法。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為：caso40.1g/l，mgso450g/l，koh5g/l，h3po410g/l，有機(jī)氮源5g/l。
實(shí)施例3
一種提高重組人胰島素前體表達(dá)的畢赤酵母發(fā)酵方法，所述發(fā)酵方法包括如下步驟：
1)起始生長(zhǎng)階段：接種濃度為2.0×105cfu/ml，溫度控制在32℃，空氣通入比為1.5vvm，通過(guò)攪拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油補(bǔ)加階段：溶氧值反彈至80％時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加甘油溶液，設(shè)定甘油起始補(bǔ)加速率f0＝12g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甘油補(bǔ)加速率，使菌體活細(xì)胞呈指數(shù)(x＝1.15*1.3t，x表示活細(xì)胞濃度，即活細(xì)胞電容率，t表示時(shí)間)生長(zhǎng)，從而獲得大量的有較高活性的菌體，控制溫度為32℃，空氣通入比為1.5vvm，溶氧值≥30％，ph6.0；當(dāng)實(shí)時(shí)活細(xì)胞濃度(即活細(xì)胞電容率)x＝19pf/cm時(shí)，停止補(bǔ)加甘油；
3)甲醇誘導(dǎo)階段：停止補(bǔ)加甘油50min后，開(kāi)始補(bǔ)加甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，設(shè)定起始甲醇補(bǔ)加速率f0＝7g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甲醇補(bǔ)加速率，使得目標(biāo)蛋白的增加量基本能夠維持在每小時(shí)增加0.04g/l的速度，控制溫度為28℃，空氣通入比為2.5vvm，溶氧值≤10％，ph6.0；
4)發(fā)酵培養(yǎng)到90h時(shí)，以與甲醇相同補(bǔ)加速率連續(xù)補(bǔ)加有機(jī)氮源，發(fā)酵培養(yǎng)180h結(jié)束。
優(yōu)選地，所述菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型為ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率，μt+△t表示t+△t時(shí)的比生長(zhǎng)速率，ft+△t表示t+△t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率。
優(yōu)選地，所述發(fā)酵起始培養(yǎng)基組成為：
甘油40g/l，尿素8g/l，caso4·2h2o1.0g/l，mgso48g/l，koh30g/l，h3po430ml/l，ptm1溶液6ml/l，消泡劑3ml/l。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述ptm1溶液為cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
優(yōu)選地，所述步驟2)、步驟3)過(guò)程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
優(yōu)選地，所述步驟2)甘油溶液的組成為是將8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟3)甲醇溶液組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟4)有機(jī)氮源為50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
優(yōu)選地，所述步驟4)補(bǔ)加有機(jī)氮源的方法還可以采用放掉20％-60％的發(fā)酵液，快速補(bǔ)加同等體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基的方法。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為：caso40.5g/l，mgso410g/l，koh10g/l，h3po420g/l，有機(jī)氮源10g/l。
實(shí)施例4
一種提高重組人胰島素前體表達(dá)的畢赤酵母發(fā)酵方法，所述發(fā)酵方法包括如下步驟：
1)起始生長(zhǎng)階段：接種濃度為4.0×105cfu/ml，溫度控制在29℃，空氣通入比為1.3vvm，通過(guò)攪拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油補(bǔ)加階段：溶氧值反彈至80％時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加甘油溶液，設(shè)定甘油起始補(bǔ)加速率f0＝9g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甘油補(bǔ)加速率，使菌體活細(xì)胞呈指數(shù)生長(zhǎng)，從而獲得大量的有較高活性的菌體，控制溫度為30℃，空氣通入比為1.3vvm，溶氧值≥30％，ph5.0；當(dāng)實(shí)時(shí)活細(xì)胞濃度(即活細(xì)胞電容率)x＝18pf/cm時(shí)，停止補(bǔ)加甘油；
3)甲醇誘導(dǎo)階段：停止補(bǔ)加甘油45min后，開(kāi)始補(bǔ)加甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，設(shè)定起始甲醇補(bǔ)加速率f0＝6g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甲醇補(bǔ)加速率，使得目標(biāo)蛋白的增加量基本能夠維持在每小時(shí)增加0.04g/l的速度，控制溫度為27℃，空氣通入比為2.2vvm，溶氧值≤10％，ph5.0；
4)發(fā)酵培養(yǎng)到100h時(shí)，以與甲醇相同補(bǔ)加速率連續(xù)補(bǔ)加有機(jī)氮源，發(fā)酵培養(yǎng)160h結(jié)束。
優(yōu)選地，所述菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型為ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率，μt+△t表示t+△t時(shí)的比生長(zhǎng)速率，ft+△t表示t+△t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率。
優(yōu)選地，所述發(fā)酵起始培養(yǎng)基組成為：
甘油35g/l，尿素7g/l，caso4·2h2o0.8g/l，mgso47g/l，koh25g/l，h3po425ml/l，ptm1溶液5ml/l，消泡劑2ml/l。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述ptm1溶液為cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
優(yōu)選地，所述步驟2)、步驟3)過(guò)程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
優(yōu)選地，所述步驟2)甘油溶液的組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟3)甲醇溶液組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟4)有機(jī)氮源為50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
優(yōu)選地，所述步驟4)補(bǔ)加有機(jī)氮源的方法還可以采用放掉40％的發(fā)酵液，快速補(bǔ)加同等體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基的方法。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為：caso40.4g/l，mgso48g/l，koh8g/l，h3po415g/l，有機(jī)氮源8g/l。
對(duì)比例
對(duì)象：采用gs115型畢赤酵母(購(gòu)自invitrogen公司，美國(guó))發(fā)酵表達(dá)重組人胰島素前體。
發(fā)酵培養(yǎng)：1)起始生長(zhǎng)階段：將擴(kuò)培后的菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，菌種的接種體積為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2.5％，通過(guò)轉(zhuǎn)速控制溶氧值量≥50％，在30℃下培養(yǎng)至溶氧值反彈至80％；2)甘油補(bǔ)加階段：以20g/l/h的速率補(bǔ)加甘油溶液、通過(guò)轉(zhuǎn)速控制溶氧值≥30％，補(bǔ)加氨水控制ph值在5.0，培養(yǎng)至菌體濃度為od600在300時(shí)停加甘油；3)甲醇誘導(dǎo)階段：等溶氧值量反彈至80％后以7.0g/l/h的速率補(bǔ)加甲醇溶液，培養(yǎng)溫度降至28℃，通過(guò)轉(zhuǎn)速控制溶氧值為10％，培養(yǎng)130h時(shí)結(jié)束。
表1培養(yǎng)過(guò)程中前體表達(dá)量測(cè)試結(jié)果
實(shí)施例5
重組人胰島素基因序列：ins001，seqidno:1所示核苷酸序列
一種提高重組人胰島素表達(dá)的方法，所述方法包括以下：
1)起始生長(zhǎng)階段：接種濃度為2.0-6.0×105cfu/ml，溫度控制在28-32℃，空氣通入比為1.0-1.5vvm，通過(guò)攪拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油補(bǔ)加階段：溶氧值反彈至80％時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加甘油溶液，設(shè)定甘油起始補(bǔ)加速率f0＝8-12g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甘油補(bǔ)加速率，使菌體活細(xì)胞呈指數(shù)生長(zhǎng)，從而獲得大量的有較高活性的菌體，控制溫度為28-32℃，空氣通入比為1.0-1.5vvm，溶氧值≥30％，ph4.0-6.0；當(dāng)實(shí)時(shí)活細(xì)胞濃度(即活細(xì)胞電容率)x＝17-19pf/cm時(shí)，停止補(bǔ)加甘油；
3)甲醇誘導(dǎo)階段：停止補(bǔ)加甘油30-50min后，開(kāi)始補(bǔ)加甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，設(shè)定起始甲醇補(bǔ)加速率f0＝3-7g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甲醇補(bǔ)加速率，使得目標(biāo)蛋白的增加量基本能夠維持在每小時(shí)增加0.04g/l的速度，控制溫度為25-28℃，空氣通入比為1.5-2.5vvm，溶氧值≤10％，ph4.0-6.0；
4)發(fā)酵培養(yǎng)到80-100h時(shí)，以與甲醇相同補(bǔ)加速率連續(xù)補(bǔ)加有機(jī)氮源，發(fā)酵培養(yǎng)130-180h結(jié)束。
優(yōu)選地，所述菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型為ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率，μt+△t表示t+△t時(shí)的比生長(zhǎng)速率，ft+△t表示t+△t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率。
優(yōu)選地，所述發(fā)酵起始培養(yǎng)基組成為：
甘油20-40g/l，尿素5-8g/l，caso4·2h2o0.4-1.0g/l，mgso45-8g/l，koh20-30g/l，h3po420-30ml/l，ptm1溶液2-6ml/l，消泡劑1-3ml/l。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述ptm1溶液為cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
優(yōu)選地，所述步驟2)、步驟3)過(guò)程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
優(yōu)選地，所述步驟2)甘油溶液的組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟3)甲醇溶液組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟4)有機(jī)氮源為50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
優(yōu)選地，所述步驟4)補(bǔ)加有機(jī)氮源的方法還可以采用放掉20％-60％的發(fā)酵液，快速補(bǔ)加同等體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基的方法。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為：caso40.1-0.5g/l，mgso45-10g/l，koh5-10g/l，h3po410-20g/l，有機(jī)氮源5-10g/l。
實(shí)施例6
甘精胰島素基因序列：gla001，seqidno:2所示核苷酸序列
一種提高甘精胰島素表達(dá)的方法，所述方法包括以下：
1)起始生長(zhǎng)階段：接種濃度為2.0-6.0×105cfu/ml，溫度控制在28-32℃，空氣通入比為1.0-1.5vvm，通過(guò)攪拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油補(bǔ)加階段：溶氧值反彈至80％時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加甘油溶液，設(shè)定甘油起始補(bǔ)加速率f0＝8-12g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甘油補(bǔ)加速率，使菌體活細(xì)胞呈指數(shù)生長(zhǎng)，從而獲得大量的有較高活性的菌體，控制溫度為28-32℃，空氣通入比為1.0-1.5vvm，溶氧值≥30％，ph4.0-6.0；當(dāng)實(shí)時(shí)活細(xì)胞濃度(即活細(xì)胞電容率)x＝17-19pf/cm時(shí)，停止補(bǔ)加甘油；
3)甲醇誘導(dǎo)階段：停止補(bǔ)加甘油30-50min后，開(kāi)始補(bǔ)加甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，設(shè)定起始甲醇補(bǔ)加速率f0＝3-7g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甲醇補(bǔ)加速率，使得目標(biāo)蛋白的增加量基本能夠維持在每小時(shí)增加0.04g/l的速度，控制溫度為25-28℃，空氣通入比為1.5-2.5vvm，溶氧值≤10％，ph4.0-6.0；
4)發(fā)酵培養(yǎng)到80-100h時(shí)，以與甲醇相同補(bǔ)加速率連續(xù)補(bǔ)加有機(jī)氮源，發(fā)酵培養(yǎng)130-180h結(jié)束。
優(yōu)選地，所述菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型為ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率，μt+△t表示t+△t時(shí)的比生長(zhǎng)速率，ft+△t表示t+△t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率。
優(yōu)選地，所述發(fā)酵起始培養(yǎng)基組成為：
甘油20-40g/l，尿素5-8g/l，caso4·2h2o0.4-1.0g/l，mgso45-8g/l，koh20-30g/l，h3po420-30ml/l，ptm1溶液2-6ml/l，消泡劑1-3ml/l。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述ptm1溶液為cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
優(yōu)選地，所述步驟2)、步驟3)過(guò)程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
優(yōu)選地，所述步驟2)甘油溶液的組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟3)甲醇溶液組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟4)有機(jī)氮源為50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
優(yōu)選地，所述步驟4)補(bǔ)加有機(jī)氮源的方法還可以采用放掉20％-60％的發(fā)酵液，快速補(bǔ)加同等體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基的方法。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為：caso40.1-0.5g/l，mgso45-10g/l，koh5-10g/l，h3po410-20g/l，有機(jī)氮源5-10g/l。
實(shí)施例7
門冬胰島素基因序列asp001：seqidno:3所示核苷酸序列
一種提高門冬胰島素表達(dá)的方法，所述方法包括以下：
1)起始生長(zhǎng)階段：接種濃度為2.0-6.0×105cfu/ml，溫度控制在28-32℃，空氣通入比為1.0-1.5vvm，通過(guò)攪拌控制溶氧值≥50％；
2)甘油補(bǔ)加階段：溶氧值反彈至80％時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加甘油溶液，設(shè)定甘油起始補(bǔ)加速率f0＝8-12g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甘油補(bǔ)加速率，使菌體活細(xì)胞呈指數(shù)生長(zhǎng)，從而獲得大量的有較高活性的菌體，控制溫度為28-32℃，空氣通入比為1.0-1.5vvm，溶氧值≥30％，ph4.0-6.0；當(dāng)實(shí)時(shí)活細(xì)胞濃度(即活細(xì)胞電容率)x＝17-19pf/cm時(shí)，停止補(bǔ)加甘油；
3)甲醇誘導(dǎo)階段：停止補(bǔ)加甘油30-50min后，開(kāi)始補(bǔ)加甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，起始甲醇補(bǔ)加速率f0＝3-7g/l/h，然后基于微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)時(shí)調(diào)整甲醇補(bǔ)加速率，使得目標(biāo)蛋白的增加量基本能夠維持在每小時(shí)增加0.04g/l的速度，控制溫度為25-28℃，空氣通入比為1.5-2.5vvm，溶氧值≤10％，ph4.0-6.0；
4)發(fā)酵培養(yǎng)到80-100h時(shí)，以與甲醇相同補(bǔ)加速率連續(xù)補(bǔ)加有機(jī)氮源，發(fā)酵培養(yǎng)130-180h結(jié)束。
優(yōu)選地，所述菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型為ft+△t＝(1+μt)ft，
其中：ft表示t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率，μt+△t表示t+△t時(shí)的比生長(zhǎng)速率，ft+△t表示t+△t時(shí)的碳源補(bǔ)加速率。
優(yōu)選地，所述發(fā)酵起始培養(yǎng)基組成為：
甘油20-40g/l，尿素5-8g/l，caso4·2h2o0.4-1.0g/l，mgso45-8g/l，koh20-30g/l，h3po420-30ml/l，ptm1溶液2-6ml/l，消泡劑1-3ml/l。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述ptm1溶液為cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo4·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，znso4·7h2o20g/l，feso4·7h2o65g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，h2so45ml/l，biotin0.2g/l。
優(yōu)選地，所述步驟2)、步驟3)過(guò)程中采用50％(w/v)尿素溶液控制ph。
優(yōu)選地，所述步驟2)甘油溶液的組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甘油溶液(50％，w/v)中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟3)甲醇溶液組成是將8-14mlptm1溶液添加到1l甲醇中配制而成。
優(yōu)選地，所述步驟4)有機(jī)氮源為50％(w/v)的酵母提取物或大豆蛋白胨。
優(yōu)選地，所述步驟4)補(bǔ)加有機(jī)氮源的方法還可以采用放掉20％-60％的發(fā)酵液，快速補(bǔ)加同等體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基的方法。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為：caso40.1-0.5g/l，mgso45-10g/l，koh5-10g/l，h3po410-20g/l，有機(jī)氮源5-10g/l。
上述的實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，而不應(yīng)視為對(duì)于本發(fā)明的限制，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征在不沖突的情況下，可以相互任意組合。本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求記載的技術(shù)方案，包括權(quán)利要求記載的技術(shù)方案中技術(shù)特征的等同替換方案為保護(hù)范圍。即在此范圍內(nèi)的等同替換改進(jìn)，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
sequencelisting
<110>宜昌東陽(yáng)光長(zhǎng)江藥業(yè)股份有限公司
<120>一種提高胰島素及其類似物前體表達(dá)的畢赤酵母發(fā)酵方法
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<213>畢赤酵母(pichiapastrois)
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<213>畢赤酵母(pichiapastrois)
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<110>宜昌東陽(yáng)光長(zhǎng)江藥業(yè)股份有限公司
<120>一種提高胰島素及其類似物前體表達(dá)的畢赤酵母發(fā)酵方法
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