本發(fā)明屬于生物處理技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株高效降解對苯二甲酸二乙酯的菌株及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

首先隨著聚酯塑料(pet)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，每年都會(huì)產(chǎn)生大量的pet廢棄物。我國每年約有400kt的聚酯廢料產(chǎn)生，雖然這些聚酯廢料本身毒性不大，不會(huì)直接對環(huán)境造成危害，但由于其廢棄物數(shù)目巨大，而且很難在自然條件下降解，造成了極大地白色污染。由于pet具有疏水性和高結(jié)晶度，要直接從pet著手篩選到能高效降解的微生物或酶非常困難。

所以本實(shí)驗(yàn)以對苯二甲酸二乙酯(det)作為結(jié)構(gòu)模擬物來馴化和培養(yǎng)pet的降解菌。首先，對苯二甲酸二乙酯作為化工原料自身是一種環(huán)境荷爾蒙，對環(huán)境會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重污染。其次，對苯二甲酸二乙酯在微生物和水解酶的作用下將釋放出對苯二甲酸(tpa)，是一種非常重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于合成樹脂、滌綸纖維、塑料薄膜和染料等行業(yè)，但對水中微生物的再生有抑制作用，對動(dòng)物有致突性和致癌作用，被公認(rèn)為是一種有毒害性的污染物。目前對苯二甲酸的生物降解研究較多，但對苯二甲酸二乙酯的處理工藝還很不完善。張建飛等人從對有降解作用的混合菌懸液中分離出5株純種菌，并從中篩選出對dtp降解作用最好的菌株f4，降解5000ppm的對苯二甲酸二乙酯，14天后的降解率可超過92％。研究苯二甲酸二乙酯的生物降解規(guī)律，不僅可以解決化工原料本身對環(huán)境的污染問題，還可以為pet的生物降解研究奠定良好的基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對pet生物降解對苯二甲酸二乙酯和工業(yè)廢水中對苯二甲酸的生物治理，提供一種高效降解對苯二甲酸二乙酯的微生物。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一株降解對苯二甲酸二乙酯的菌株，其分類命名為代爾夫特菌(delftiasp.)，菌株號(hào)為wl-3，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱cctcc)，保藏編號(hào)為cctccno：m2017136，保藏日期為2017年3月21日，保藏地址為：中國.武漢.武漢大學(xué)。該菌株是發(fā)明人于2016年11月篩選出來的。

本發(fā)明所述的delftiawl-3篩選方法：在以對苯二甲酸二乙酯為唯一碳源的無機(jī)鹽養(yǎng)基(ph7.0)中，對含苯系物及其衍生物的工業(yè)廢水中的對苯二甲酸二乙酯(det)降解菌株進(jìn)行分離篩選。

具體地，以含苯系物及其衍生物的工業(yè)廢水作為篩選目標(biāo)，利用含1000mg/l對苯二甲酸二乙酯的無機(jī)鹽培養(yǎng)基作為介質(zhì)，連續(xù)富集馴化具有對苯二甲酸二乙酯利用能力的菌株，將無機(jī)鹽培養(yǎng)基稀釋涂布于含有1000mg/l對苯二甲酸二乙酯的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2-3d，挑取形態(tài)不同的對苯二甲酸二乙酯降解菌株進(jìn)行劃線分離獲得純培養(yǎng)，命名為菌株wl-3，再次驗(yàn)證純種微生物菌株wl-3對對苯二甲酸二乙酯降解能力，利用高效液相色譜檢測對苯二甲酸二乙酯殘余含量；

具體地，所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基是由硝酸銨1.0g，氯化鈉1.0g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，加水至1.0l配制，調(diào)節(jié)ph值至7.0，固體培養(yǎng)基加入瓊脂20.0g、121℃滅菌15min，使用前添加終濃度1000mg/l的對苯二甲酸二乙酯作為碳源。

wl-3菌株于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，菌落乳白色，呈隆起、圓形、不透明狀。wl-3菌株淀粉水解反應(yīng)呈陰性、接觸酶反應(yīng)呈陽性、脲酶反應(yīng)呈陽性、v-p反應(yīng)陽性、甲基紅反應(yīng)陽性、氧化酶反應(yīng)陽性、明膠液化反應(yīng)陽性。菌株wl-3的生理生化鑒定結(jié)果與代爾夫特菌的特征最為接近。

具體地，所述的1/3lb培養(yǎng)基是由蛋白胨3.0g，酵母粉1.5g，氯化鈉3.0g，加水至1.0l配制，調(diào)節(jié)ph值至7.0，固體培養(yǎng)基加入瓊脂20.0g、121℃滅菌15min。

本發(fā)明所述的菌株wl-3，其16srdna的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。

一種含有本發(fā)明所述的對苯二甲酸二乙酯及其代謝產(chǎn)物降解菌株delftiawl-316srdna序列的克隆載體。

所述的重組克隆載體，優(yōu)選出發(fā)載體為pmd19t。

含所述的對苯二甲酸二乙酯及其代謝產(chǎn)物降解菌株deftiawl-316srdna序列的基因工程菌escherichcolidh5α(pmd19t-16s)。

所述的基因工程菌escherichcolidh5α構(gòu)建方法：利用引物27f：5`-agagtttgatcctggctcag-3`和1492r：5`-taccttgttacgactt-3`擴(kuò)增菌株wl-3的16srdna，通過t/a克隆的方式連接至克隆載體pmd19t，構(gòu)建重組克隆載體pmd19t-16s，將其轉(zhuǎn)化到克隆宿主菌escherichcolidh5α獲得重組微生物escherichcolidh5α(pmd19t-16s)，將所獲得的重組微生物外源片段進(jìn)行測序，ncbi數(shù)據(jù)庫比對該16srdna序列，在分子水平上將菌株wl-3鑒定至代爾夫特菌屬。

上述菌株wl-3在降解廢水中對苯二甲酸二乙酯中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

其中，對苯二甲酸二乙酯在廢水中的濃度優(yōu)選范圍是250mg/l～1000mg/l。

一株對苯二甲酸二乙酯降解菌株delftiawl-3在廢水處理過程中的應(yīng)用，具體步驟如下：

(1)菌株wl-3種子液培養(yǎng)：菌株wl-3種子液采用lb液體培養(yǎng)基，取試管斜面保藏的菌株wl-3，用接種環(huán)挑去菌落接入含有100mllb液體培養(yǎng)基的三角瓶，30℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速200r·min^-1，獲得的菌體經(jīng)無機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌兩次后，制成od600nm＝1.0的菌懸液作為降解試驗(yàn)種子液；

(2)菌株wl-3降解對苯二甲酸二乙酯的動(dòng)力學(xué)：在對苯二甲酸二乙酯終濃度為1000mg/l的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5％接種量接入種子液，于30℃，180r·min^-1震蕩培養(yǎng)，每隔1d取樣一次，測定od600nm和對苯二甲酸二乙酯的殘留濃度。

(3)溫度和ph對菌株wl-3降解對苯二甲酸二乙酯的影響：在對苯二甲酸二乙酯終濃度為1000mg/l的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5％接種量接入種子液，分別于20℃、25℃、30℃、37℃、42℃，ph7.0，180r·min^-1震蕩培養(yǎng)；分別于初始ph4.0、6.0、6.5.、7.0、7.5、8、9、10，30℃、180r·min^-1震蕩培養(yǎng)，測定溫度和ph對菌株wl-3降解對苯二甲酸二乙酯的影響。

(4)底物初始濃度和接種量對菌株wl-3降解對苯二甲酸二乙酯的影響：在對苯二甲酸二乙酯終濃度為1000mg/l的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別按1％、3％、5％、10％的接種量接入種子液于30℃，180r·min^-1震蕩培養(yǎng)；分別在對苯二甲酸二乙酯終濃度為250mg/l、500mg/l、1000mg/l、1500mg/l的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5％接種量接入種子液，于30℃，180r·min^-1震蕩培養(yǎng)，測定底物初始濃度和接種量對菌株wl-3降解對苯二甲酸二乙酯的影響。

(5)菌株wl-3對對苯二甲酸的降解能力測定：分別在終濃度為2000mg/l的含對苯二甲酸的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5％接種量接入種子液，于30℃，200r·min^-1震蕩培養(yǎng)，測定菌株wl-3對對苯二甲酸的降解能力。

有益效果：本發(fā)明以化工廢水為分離材料，分離純化到一株可以高效降解對苯二甲酸二乙酯及其代謝產(chǎn)物的微生物，對pet生物降解和工業(yè)廢水的凈化非常具有現(xiàn)實(shí)意義。該菌株對對苯二甲酸二乙酯的代謝產(chǎn)物對苯二甲酸具有降解效果，適合應(yīng)用在工業(yè)廢水的生物治理上。

附圖說明

圖1a是未接種菌株wl-3的對苯二甲酸二乙酯hplc的效果圖。

圖1b是接種菌株wl-3四天后對苯二甲酸二乙酯hplc的降解效果圖。

圖1c是接種菌株wl-3七天后對苯二甲酸二乙酯hplc的降解效果圖。

圖2a是溫度對菌株wl-3生長的影響示意圖。

圖2b是ph值對菌株wl-3生長的影響示意圖。

圖2c是裝液量對菌株wl-3生長的影響示意圖。

圖2d是轉(zhuǎn)速對菌株wl-3生長的影響示意圖。

圖3是對苯二甲酸二乙酯降解曲線及菌株wl-3生長曲線。

圖4a是溫度對菌株wl-3降解對苯二甲酸二乙酯的影響示意圖。

圖4b是ph值對菌株wl-3降解對苯二甲酸二乙酯的影響示意圖。

圖4c是底物初始濃度對菌株wl-3降解對苯二甲酸二乙酯的影響示意圖。

圖4d是接種量對菌株wl-3降解對苯二甲酸二乙酯的影響示意圖。

圖5a是未接種菌株wl-3的對苯二甲酸hplc的效果圖。

圖5b是接種菌株wl-3兩天后對苯二甲酸hplc的降解效果圖

圖6對苯二甲酸降解曲線。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

下述的實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法無特殊說明均為常規(guī)方法。下述的實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)試劑耗材等無特殊說明均可從商業(yè)用途購買。

實(shí)施例1

對苯二甲酸二乙酯降解菌株delftiawl-3的分離篩選：

取5ml污水樣品置于100ml含500mg/l對苯二甲酸二乙酯的富集培養(yǎng)基中，于30℃、180r·min^-1培養(yǎng)7d。用紫外掃描儀測定富集液對對苯二甲酸二乙酯的降解情況，確定對苯二甲酸二乙酯被降解后，以10％的接種量接入到含750mg/l對苯二甲酸二乙酯富集培養(yǎng)基中，繼續(xù)富集并測定降解情況，按此方法直至對苯二甲酸二乙酯濃度提高至1500mg/l，并傳代3次。

將對苯二甲酸二乙酯富集液經(jīng)梯度稀釋后涂布于1000mg/l對苯二甲酸二乙酯為唯一碳源的無機(jī)鹽平板上，于30℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3～4d。將菌落形態(tài)不同的單菌落分別劃線于lb平板純化，并接種于以500mg/l對苯二甲酸二乙酯為唯一碳源的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30℃、180r·min^-1搖床培養(yǎng)7d后，取1ml樣品離心收集上清，用高效液相色譜hplc來檢測對苯二甲酸二乙酯的含量。通過高效液相色譜hplc發(fā)現(xiàn)，與對照不加菌的搖瓶對比，編號(hào)為wl-3的菌株可以使對苯二甲酸二乙酯的峰值下降。

上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基是由硝酸銨1.0g，氯化鈉1.0g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，加水至1.0l配制，調(diào)節(jié)ph值至7.0，固體培養(yǎng)基加入瓊脂20.0g、121℃滅菌20min，使用前添加對苯二甲酸二乙酯作為碳源。

上述lb培養(yǎng)基是由蛋白胨10.0g，酵母粉5g，氯化鈉5.0g，加水至1.0l配制，調(diào)節(jié)ph值至7.0，固體培養(yǎng)基加入瓊脂20.0g、121℃滅菌15min。

將wl-3降解對苯二甲酸二乙酯前后的培養(yǎng)液離心取上清后用10ml的甲醇稀釋，過0.22um有機(jī)濾膜，樣品用于高效液相色譜檢測(hplc)。未接菌的對照培養(yǎng)液中對苯二甲酸二乙酯的保留時(shí)間為3.29min左右，而接種菌株wl-3并培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)液中對苯二甲酸二乙酯的含量明顯下降，檢測到一個(gè)4.2min左右的中間代謝產(chǎn)物新峰。具體色譜條件為：色譜柱為c18kromasil250mm×4.6mm；柱溫為室溫；泵p680hplcpump；檢測器uvd170u；檢測波長240nm；流動(dòng)相甲醇80％；流速1ml/min.(圖1a和圖1b)。

實(shí)施例2

對苯二甲酸二乙酯及其代謝產(chǎn)物降解菌株delftiawl-3的鑒定及其生長特性：

wl-3的鑒定：

對wl-3進(jìn)行16srdna鑒定：利用引物27f：5`-agagtttgatcctggctcag-3`和1492r：5`-taccttgttacgactt-3`擴(kuò)增菌株wl-3的16srdna，通過t/a克隆的方式連接至克隆載體pmd19t，構(gòu)建重組克隆載體pmd19t-16s，將其轉(zhuǎn)化到克隆宿主菌escherichcolidh5α獲得重組微生物escherichcolidh5α(pmd19t-16s)，將所獲得的重組微生物外源片段進(jìn)行測序，ncbi數(shù)據(jù)庫比對該16srdna序列，在分子水平上將菌株wl-3鑒定至代爾夫特菌屬，其16srdna的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。

wl-3的生長特性：

delftiawl-3在lb平板上生長較慢，30℃，48h可形成直徑為2mm的乳白色菌落，菌落邊緣整齊，有光澤，突出，粘稠，濕潤，光滑，不透明，基于其16srdna序列以及生理生化特征，菌株wl-3被鑒定為delftia屬。

菌株wl-3的最適生長溫度為30℃，在37℃也可以很好的生長，但在較低溫度(20℃和25℃)和較高溫度(42℃)時(shí)，其生長則受到明顯抑制。菌株wl-3在ph為6和7時(shí)，生長良好，其最適生長ph為6；當(dāng)ph為4和10時(shí)，其生長就受到明顯抑制，菌株wl-3生長時(shí)隨著搖瓶裝液量的增加其生長量下降，表明菌株wl-3也是好氧型微生物，如圖2a-2d所示。

實(shí)施例3

對苯二甲酸二乙酯及其代謝產(chǎn)物降解菌delftiawl-3的降解特性：

從lb平板上挑取菌株wl-3單菌落，分別接種于3mllb液體培養(yǎng)基中于30℃，搖床180r·min^-1培養(yǎng)12h。然后將該菌株的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到100ml新鮮的液體lb培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)12h。6000r·min^-1離心10min，收集菌體，用滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌兩次后，制成od600nm＝1.0的菌懸液，即種子液。在對苯二甲酸二乙酯終濃度為1000mg/l的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按5％接種量接入od600nm＝1.0菌株wl-3種子液，于30℃、180r·min^-1震蕩培養(yǎng)，每隔24h取樣一次，測定od600nm和對苯二甲酸二乙酯的濃度。

由圖4a～圖4d可以看出，菌株wl-3接種到培養(yǎng)基中1d，就開始降解對苯二甲酸二乙酯，而沒有明顯的延滯現(xiàn)象；之后降解速率逐漸增加，到7d就已將1000mg/l的對苯二甲酸二乙酯基本降解完全。另外，從圖中還可以看出，隨著對苯二甲酸二乙酯的降解，菌株wl-3的生長量開始逐漸增加；當(dāng)對苯二甲酸二乙酯完全降解以后，菌株wl-3的生長量也達(dá)到最大。該結(jié)果表明菌株wl-3可以利用對苯二甲酸二乙酯進(jìn)行生長。

菌株wl-3在30℃和37℃時(shí)，對苯二甲酸二乙酯的降解率基本相同；而在25℃時(shí)，對苯二甲酸二乙酯的降解率就受到明顯抑制；當(dāng)溫度為42℃時(shí)，幾乎不降解對苯二甲酸二乙酯(圖4a)。菌株wl-3在降解對苯二甲酸二乙酯時(shí)對ph的適應(yīng)范圍很寬，在ph5-9之間均具有很好的效果；即使在ph為4時(shí)，對苯二甲酸二乙酯(的降解率也可以達(dá)到58％。將此結(jié)果與菌株wl-3的生長ph相比，發(fā)現(xiàn)其降解ph范圍比生長ph范圍寬的多，說明菌株wl-3產(chǎn)生的降解酶具有較強(qiáng)的ph適應(yīng)性(圖4b)。菌株wl-3對對苯二甲酸二乙酯的降解速率隨著底物濃度的增加而降低。當(dāng)對苯二甲酸二乙酯初始濃度為500mg/l時(shí)，其在7d的降解率為97.5％；而當(dāng)對苯二甲酸二乙酯初始濃度為1000mg/l時(shí)，其在7d的降解率仍然可以達(dá)到92.3％，說明該菌株對對苯二甲酸二乙酯具有高效的降解效率(圖4c)。隨著接種量的增大，對苯二甲酸二乙酯的降解速率明顯增加。當(dāng)接種量為1％時(shí)，對苯二甲酸二乙酯在7d的降解率為42.3％；而當(dāng)接種量為5％和10％時(shí)，對苯二甲酸二乙酯分別在3d和6d時(shí)即基本降解完全(圖4d)。

實(shí)施例4

對苯二甲酸二乙酯降解菌delftiawl-3對對苯二甲酸的降解：

48小時(shí)后，用hplc檢測對苯二甲酸發(fā)現(xiàn)此物質(zhì)濃度特別低(圖5a和圖5b)，因此，可以認(rèn)為菌株wl-3可以完全礦化上述底物。由圖6可以看出，菌株wl-3接種到對苯二甲濃度為2000mg/l的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中2h就開始降解對苯二甲酸，之后降解速率逐漸增加，到48h就已將2000mg/l的對苯二甲酸基本降解完全。

sequencelisting

<110>南京工業(yè)大學(xué)

<120>一株降解對苯二甲酸二乙酯的菌株及其應(yīng)用

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