本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種mirna-4530作為肺癌診斷標(biāo)志物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

通過基因芯片、高通量測序法和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qrt-pcr)等方法發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中的mirna對nsclc的診斷有較高價值。其中roth等發(fā)現(xiàn)血液中的mir-361-3p和mir-625有助于從良性肺部病變中識別惡性肺癌。而血液中mir-21的上調(diào)是診斷肺鱗狀細(xì)胞癌的可靠生物學(xué)標(biāo)志，肺腺癌患者血液中mir-200b-5p、mir-502-5p、mir-629、mir-17和mir-100較肺部肉芽腫患者和健康吸煙者明顯增高。此外，rodriguez等發(fā)現(xiàn)肺部腫瘤患者血液中外泌體含有的mir-122-5p等mirna含量明顯高于支氣管肺泡灌洗液。munagala等發(fā)現(xiàn)肺癌外泌體中mir-21和mir-155升高對于肺癌復(fù)發(fā)診斷是潛在的生物學(xué)標(biāo)志。

微小rna(microrna，mirna)作為一種在某些腫瘤中異常表達(dá)的非編碼的小rna，可以作為腫瘤診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。然而，由于依靠組織活檢來取得腫瘤組織再分析其mirna的方法具有創(chuàng)傷性，因此限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。外泌體(exosomes)是一種直徑在50-90nm的亞細(xì)胞雙層膜顆粒，其中含有mirna，且腫瘤在生長過程中還會不斷地將外泌體釋放到周圍環(huán)境中去，因此檢測體液外泌體及外泌體rna有助于腫瘤診斷和預(yù)后判斷。taylor等首先提出通過檢測血液外泌體mirna來診斷卵巢癌，并進(jìn)一步用于判斷預(yù)后。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供檢測待測樣本外泌體中mirna-4530表達(dá)量的物質(zhì)的用途。

本發(fā)明提供了檢測待測樣本外泌體中mirna-4530表達(dá)量的物質(zhì)在制備診斷或輔助診斷所述待測樣本是否肺癌樣本的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了檢測待測樣本外泌體中mirna-4530表達(dá)量的物質(zhì)在制備篩查或輔助篩查所述待測樣本是否肺癌樣本的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

所述表達(dá)量為相對表達(dá)量，為相對于內(nèi)參基因的表達(dá)量，內(nèi)參基因為has-5.8s。

上述應(yīng)用中，所述待測樣本為離體血清。

上述應(yīng)用中，所述檢測待測樣本外泌體中mirna-4530表達(dá)量的物質(zhì)包括用于擴(kuò)增mirna-4530的引物對。

若mirna-4530在待測樣本外泌體中的表達(dá)顯著高于在非肺癌樣本中的表達(dá)，則待測樣本為或候選為肺癌樣本，反之，則不為或候選不為。

本發(fā)明還提供了檢測待測人血清外泌體中mirna-4530表達(dá)量的物質(zhì)在制備診斷或輔助診斷所述待測人是否肺癌患者的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了檢測待測人血清外泌體中mirna-4530表達(dá)量的物質(zhì)在制備篩查或輔助篩查所述待測人是否肺癌患者的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述檢測待測人血清外泌體中mirna-4530表達(dá)量的物質(zhì)包括用于擴(kuò)增mirna-4530的引物對。

上述應(yīng)用中，所述引物對由序列表中序列1所示的單鏈dna分子和序列表中序列2所示的單鏈dna分子組成。

所述血清為離體血清。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品，為上述檢測待測樣本外泌體中mirna-4530表達(dá)量的物質(zhì)或所述檢測待測人血清外泌體中mirna-4530表達(dá)量的物質(zhì)。

上述產(chǎn)品為如下1)-4)中任意一種：

1)診斷或輔助診斷所述待測樣本是否肺癌樣本的產(chǎn)品；

2)篩查或輔助篩查所述待測樣本是否肺癌樣本的產(chǎn)品；

3)診斷或輔助診斷所述待測人是否肺癌患者的產(chǎn)品；

4)篩查或輔助篩查所述待測人是否肺癌患者的產(chǎn)品。

mirna-4530作為肺癌診斷標(biāo)記物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明為了建立利用外泌體進(jìn)行肺癌診斷和預(yù)后判斷生物標(biāo)志物的方法，采用永生化的人支氣管上皮細(xì)胞bep2d及α粒子輻射誘發(fā)該細(xì)胞發(fā)生癌變的細(xì)胞系berp35t44-1，分離外泌體，并利用mirna芯片技術(shù)獲得了在癌變細(xì)胞系berp35t44-1細(xì)胞外泌體中表達(dá)明顯增高的mirna，在31例臨床肺癌病人的血清中進(jìn)行了檢測，與正常人群相比，mirna-4530表達(dá)均顯著增高。mirna-4530為臨床肺癌診斷奠定基礎(chǔ)，可用于制備診斷試劑盒。

附圖說明

圖1為hsa-5.8s基因?qū)崟r擴(kuò)增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖。

圖2為mir-4530基因?qū)崟r擴(kuò)增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖。

圖3為mirna-4530在人肺癌血清中高表達(dá)。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、與肺癌細(xì)胞相關(guān)的mirna的發(fā)現(xiàn)

永生化的人支氣管上皮細(xì)胞bep2d記載在如下文獻(xiàn)中：樓鐵柱、項曉瓊、吳德昌.238puα粒子誘發(fā)人支氣管上皮細(xì)胞bep2d轉(zhuǎn)化的初步研究.中國肺癌雜志，2000，3(6)：428-431.2；

腫瘤細(xì)胞berp35t44-1具有較高的血清抗性，較強(qiáng)的錨著獨(dú)立生長能力，較快的增殖速度，且具有一定的遷移能力，記載在如下文獻(xiàn)中：α粒子輻射誘發(fā)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化成瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性研究；胡迎春；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2003年中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的碩士論文。

1.細(xì)胞培養(yǎng)：bep2d細(xì)胞和berp35t44-1細(xì)胞培養(yǎng)于lhc-8無血清培養(yǎng)基中，置37c、5％co培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

2.外泌體的提?。菏杖?0⁷生長狀態(tài)良好的bep2d及berp35t44-1細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用多步差速離心法分離外泌體：4℃，300g離心10分鐘去除細(xì)胞；4℃，2000g離心20分鐘和4℃，10000g離心30分鐘去除細(xì)胞碎片；最后，4℃，100000g超速離心60分鐘所獲得的沉淀即為外泌體。

3.外泌體的電鏡分析：向外泌體沉淀中加入1mlpbs，吹打溶解后取20μl滴加于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置1分鐘，用濾紙從側(cè)面吸干液體，再滴加2％磷鎢酸溶液(ph6.8)30μl于銅網(wǎng)上，室溫負(fù)染1分鐘。濾紙吸干負(fù)染液，白熾燈下烤2分鐘，透射電鏡下觀察照相。

4.外泌體rna的提?。合蛲饷隗w沉淀中加入500μltrizol試劑(美國invitrogen公司)提取總rna，得到bep2d細(xì)胞外泌體rna和berp35t44-1細(xì)胞外泌體rna。

用超微量分光光度計測定總rna濃度。以a260nm/a280nm比值評估純度。為了確定提取出的總rna中有mirna存在，選用rnu6b為內(nèi)參，利用實時熒光定量pcr的方法對總rna中的mirna進(jìn)行檢測。

5.mirna芯片實驗：bep2d、berp35t44-1兩種細(xì)胞的外泌體，共2個總rna樣品進(jìn)行mirna芯片實驗。mirna芯片實驗由lcsciences公司采用人的lcsciencesmicrornamicroarray-single基因表達(dá)譜芯片完成。

用人的lcsciencesmicrornamicroarray-single基因表達(dá)譜芯片(由杭州聯(lián)川生物信息技術(shù)有限公司提供)檢測bep2d細(xì)胞外泌體rna和berp35t44-1細(xì)胞外泌體rna，經(jīng)檢測后發(fā)現(xiàn)rna質(zhì)量完好，進(jìn)行標(biāo)記雜交試驗。雜交芯片經(jīng)掃描儀掃描，數(shù)據(jù)信號提取，lowess過濾進(jìn)行歸一化處理以及差異表達(dá)分析等。得到人支氣管上皮細(xì)胞bep2d外泌體基因表達(dá)譜和腫瘤細(xì)胞berp35t44-1外泌體基因表達(dá)譜。

比較兩個基因表達(dá)譜，結(jié)果與人支氣管上皮細(xì)胞bep2d基因表達(dá)譜相比，腫瘤細(xì)胞berp35t44-1基因表達(dá)譜表達(dá)上調(diào)的mirna有140個，表達(dá)下調(diào)的mirna有169個。數(shù)據(jù)顯示，mirna-4530上調(diào)倍數(shù)為18.36倍。

實施例2、mirna-4530的表達(dá)量在診斷肺癌患者中的應(yīng)用

一、提取rna

肺癌患者血清來源：肺癌患者血清全部由解放軍總醫(yī)院提供，均為首診肺癌，患者尚未接受過任何包括手術(shù)及放化療等治療。診斷明確，病理清楚。

正常對照血清來源：正常對照血清全部由解放軍總醫(yī)院體檢中心提供，均為健康人群常規(guī)查體獲得。

分別提取肺癌患者血清外泌體rna和正常對照血清外泌體的rna。

1、樣本信息如下表1：

表1

二、引物設(shè)計與驗證

使用dnaman設(shè)計頸環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物和qpcr上游引物，下游引物使用通用引物，目的片段長度約60bp左右，退火溫度60℃(序列見表2)。引物驗證使用與定量pcr相同的條件，以cdna混合樣品為模板，結(jié)果熔解曲線均為單一峰，瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶，pcr擴(kuò)增特異性較好。定量結(jié)果見圖1、圖2。

表2mir-4530序列及qpcr引物序列

三、rt-pcr法(逆轉(zhuǎn)錄合成cdna)

將提取好的rna從-80℃冰箱中取出，放在冰上溶解，使用fastquantrtkit(withgdnaase)(tiangen)合成第一鏈cdna。

再分別以cdna為模板，用上游引物和下游引物進(jìn)行相對定量pcr。

相對定量pcr體系如表3：

表3

相對定量pcr反應(yīng)使用roche96熒光定量pcr儀進(jìn)行定量pcr：

表4

實驗組相對對照組(has-5.8s)樣本中目的基因的表達(dá)量以2^-δδct法計算，結(jié)果見表5。

表5.各樣本中目的基因的表達(dá)量(相對于has-5.8s的相對表達(dá)量)

用grampad軟件表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果如圖3所示。

用sas軟件對表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果如下表6-7所示：

表6為31例肺癌病人組mirna-4530結(jié)果

表7為5例正常對照組mirna-4530結(jié)果

不滿足正態(tài)性，本例采用成組設(shè)計定量資料的秩和檢驗：z＝-3.4307，p＝0.0006，兩組差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

序列表

<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所

<120>mirna-4530作為肺癌診斷標(biāo)志物的應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gcagcaggacgagagtgaaa20

<210>2

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gtgcagggtccgaggt16