本發(fā)明涉及一種外泌體總rna的提取方法，屬于生物活性物質(zhì)提取領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

當(dāng)外泌體在1980年首次被發(fā)現(xiàn)后，其被認(rèn)為是細(xì)胞排泄廢物的一種方式，如今隨著大量對(duì)其生物來源、其物質(zhì)構(gòu)成及運(yùn)輸、細(xì)胞間信號(hào)的傳導(dǎo)以及在體液中的分布的研究發(fā)現(xiàn)外泌體具有多種多樣的功能。外泌體的功能取決于其所來源的細(xì)胞類型，其可參與到機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原提呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等方方面面。有研究表明腫瘤來源的外泌體參與到腫瘤細(xì)胞與基底細(xì)胞的遺傳信息的交換，從而導(dǎo)致大量新生血管的生成，促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)與侵襲。

人體內(nèi)多種細(xì)胞及體液均可分泌外泌體，包括內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血小板、平滑肌細(xì)胞等。當(dāng)其由宿主細(xì)胞被分泌到受體細(xì)胞中時(shí)，外泌體可通過其攜帶的蛋白質(zhì)、核酸、脂類等來調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)活性。外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊主要通過以下三種方式：一是外泌體膜蛋白可以與靶細(xì)胞膜蛋白結(jié)合，進(jìn)而激活靶細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路。二是在細(xì)胞外基質(zhì)中，外泌體膜蛋白可以被蛋白酶剪切，剪切的碎片可以作為配體與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路。有報(bào)道稱一些外泌體膜上蛋白在其來源細(xì)胞膜上未能檢測(cè)出。三是外泌體膜可以與靶細(xì)胞膜直接融合，非選擇性的釋放其所含的蛋白質(zhì)、mrna以及microrna。

中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)cn201610021424.5公開了一種血清外泌體中rna的提取方法，其包括以下步驟：1)提取血清中的外泌體；2)在超聲的作用下使用rna提取試劑裂解步驟1)中提取的外泌體；3)使用氯仿分離步驟2)中裂解后的外泌體的rna至水相；4)使用異丙醇沉淀步驟3)得到的水相中的rna；5)使用乙醇洗滌步驟4)中沉淀的rna，之后再次溶解rna，即得所述血清外泌體中的rna。本發(fā)明的血清外泌體中rna的提取方法具有提取時(shí)間短、效率高、效果好、試驗(yàn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。

中國(guó)專利申請(qǐng)cn201510488030.6提供了一種外泌體mirna的定量檢測(cè)方法，包括外泌體總rna提取、3’端和5’端特異性唯一標(biāo)簽接頭連接、反轉(zhuǎn)錄合成cdna并進(jìn)行pcr擴(kuò)增、mirna文庫的篩選純化與上機(jī)測(cè)序、糾錯(cuò)算法的信息分析等步驟。該方法基于特異性的唯一標(biāo)簽接頭的標(biāo)記，對(duì)每個(gè)原始模板進(jìn)行區(qū)分，避免了擴(kuò)增時(shí)分子間存在的偏好性，可以精確檢測(cè)低于10拷貝以下的mirna分子，且特異性高，可用于腫瘤源性的外泌體mirna的檢測(cè)，神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病，生育健康等領(lǐng)域的檢測(cè)，可為疾病的早期篩查提供依據(jù)，還可應(yīng)用于其他小rna精準(zhǔn)定量檢測(cè)領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種外泌體總rna的提取方法。該方法包括超速離心法提取外泌體和外泌體中rna的提取步驟，提取得到的樣品經(jīng)過檢測(cè)包括18s和28srna，其含量較高，提取方法可行性強(qiáng)，適宜推廣應(yīng)用。

一種外泌體總rna的提取方法，其包括如下步驟：

1)超速離心法提取外泌體：

將樣本加入離心管，300xg，4℃離心10min，吸取上清到離心管中，2000xg，4℃離心10min，吸取上清到離心管中，10000xg，4℃離心30min；吸取上清到離心管，100000xg，4℃離心70min，去除上清，保留沉淀，沉淀中含有外泌體和部分雜蛋白，加入1xpbs緩沖液重懸，100000xg，4℃離心70min，去除上清后得到的沉淀即為外泌體；向外泌體中加入140μl1xpbs緩沖液重懸保存得到外泌體保存液；

2)外泌體中rna的提?。?/p>

a.向外泌體保存液中加入700μl的qiazollysisreagent，使用移液槍吹打混勻，室溫條件下靜置5～10min，向其中加入140μl的氯仿，溫和顛倒混勻后混合液呈粉紅色，室溫條件下靜置2～3min；將混合液在12000xg，4℃離心15min，離心結(jié)束后液體分層，吸取上層水相rna層到離心管；

b.向其中加入1.5倍體積的無水乙醇，吹打數(shù)次混勻后轉(zhuǎn)移700μl混合液到離心收集管中，套上2ml收集管，≥8000xg，室溫條件下離心15s，重復(fù)b步驟，直到所有液體都進(jìn)行一次過柱；

c.向其中加入700μlbufferrwt，≥8000xg，室溫離心15s，加入500μl的bufferrpe，≥8000xg，室溫離心15s，再次加入500μl的bufferrpe，≥10000xg，室溫離心2min，將吸附柱套于一個(gè)新的2ml收集管中，全速離心1min，去除收集管；將吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5ml離心管中，打開蓋子，室溫風(fēng)干3～5min；加入24～40μl的depc水或無rnase水，室溫靜置3～5min，然后≥8000xg，室溫離心1min，即可得到rna溶液。

上述所述的rna的提取方法中，所述的樣本為細(xì)胞培養(yǎng)液/血清/血漿中的一種。

上述所述的rna的提取方法中，所述步驟2)a中離心結(jié)束后液體分成三層，其中上層為水相rna層，中層為蛋白層，下層為有機(jī)相。

一種利用上述rna的提取方法制備得到的rna檢測(cè)方法，其包括如下步驟：

a)進(jìn)行rnaagilent2100檢測(cè)前，所使用的ladder應(yīng)在70℃下預(yù)變性2min，然后迅速放于冰上，靜置5min，分裝成小管后放于-80℃?zhèn)溆?，其余試劑放于室溫備用?/p>

b)裝配加樣壓膠臺(tái)并將平臺(tái)配件調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)臋n位：

c)準(zhǔn)備試劑：吸取550μl的膠溶液到試劑盒中的離心過濾柱中，1,500xg±20％，室溫離心10min，去除過濾柱保留過濾液體膠；每次檢測(cè)時(shí)使用吸取65μl的液體膠到一個(gè)潔凈離心管中，并加入1μl的熒光染料，充分混勻，13000xg，室溫離心10min，得到混合膠溶液；

d)rna檢測(cè)：向?qū)?yīng)的孔位加入9μl混合膠溶液，蓋緊壓膠平臺(tái)，將注射器壓下，靜置30s；釋放注射器，待注射器恢復(fù)到原位置時(shí)打開平臺(tái)，在對(duì)應(yīng)的孔位中加入9μl混合膠溶液；向如圖所示加入每孔5μl的marker溶液，向?qū)?yīng)孔位加入1μl變性的ladder溶液，其余孔依次加入1μlrna樣本；加樣完畢后放于振蕩器中震蕩混勻1min；打開儀器軟件，設(shè)置程序，選擇rna→eukaryoternananochip→start運(yùn)行程序，即可得到各孔位的峰圖。

本發(fā)明通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明提取工藝制備得到的rna包括18srna和28srna，rna在提取過程中無丟失，且制備效率高，適宜進(jìn)行推廣應(yīng)用。本發(fā)明使用乙醇作為rna的沉淀溶劑要顯著優(yōu)于其他溶劑，其與其他溶劑相比具有顯著的提高rna濃度和rna純度的作用。本發(fā)明使用bufferrwt和bufferrpe組合的處理工藝對(duì)rna進(jìn)行純化，可以明顯提高rna的純度以及rna的濃度。其在rna純度和濃度的提升方面具有關(guān)鍵作用。本發(fā)明所使用的外泌體裂解試劑效率高，所獲得的rna的濃度顯著高于對(duì)照實(shí)施例，且本發(fā)明使用超速離心發(fā)提取外泌體，其極大地減少了外來試劑對(duì)于外泌體的消耗作用，從而提高了rna的濃度和純度。

附圖說明

圖1為本發(fā)明外泌體總rna提取方法中平臺(tái)孔位加樣示意圖，其中a、b對(duì)應(yīng)孔位加入混合膠溶液，c孔位加入mark溶液，d對(duì)應(yīng)孔位加入ladder溶液，e對(duì)應(yīng)孔位加入提取得到的樣品溶液。

圖2為本發(fā)明外泌體總rna提取方法中l(wèi)adder峰形圖。

圖3為本發(fā)明外泌體總rna提取方法中mark峰形圖。

圖4為本發(fā)明外泌體總rna提取方法中加入樣品和mark的峰形圖。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施方式進(jìn)一步描述本發(fā)明，但所述實(shí)施例并不以任何方式限定本發(fā)明專利保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1一種外泌體總rna的提取方法

一種外泌體總rna的提取方法，其包括如下步驟：

1)超速離心法提取外泌體：將樣本加入離心管，300xg，4℃離心10min，吸取上清到離心管中，2000xg，4℃離心10min，吸取上清到離心管中，10000xg，4℃離心30min；吸取上清到離心管，100000xg，4℃離心70min，去除上清，保留沉淀，沉淀中含有外泌體和部分雜蛋白，加入1xpbs緩沖液重懸，100000xg，4℃離心70min，去除上清后得到的沉淀即為外泌體；向外泌體中加入140μl1xpbs緩沖液重懸保存得到外泌體保存液；上述所述的rna的提取方法中，所述的樣本為細(xì)胞培養(yǎng)液/血清/血漿中的一種。

2)外泌體中rna的提?。合蛲饷隗w保存液中加入700μl的qiazollysisreagent，使用移液槍吹打混勻，室溫條件下靜置5～10min，向其中加入140μl的氯仿，溫和顛倒混勻后混合液呈粉紅色，室溫條件下靜置2～3min；將混合液在12000xg，4℃離心15min，離心結(jié)束后液體分成三層，其中上層為水相rna層(約300～400μl)，中層為蛋白層，下層為有機(jī)相，吸取水相rna層到離心管，向其中加入1.5倍體積的無水乙醇(450～600μl)，吹打數(shù)次混勻后轉(zhuǎn)移700μl混合液(包括沉淀)到離心收集管中，套上2ml收集管，≥8000xg，室溫離心15s，重復(fù)上一步，直到所有液體都進(jìn)行一次過柱，

向其中加入700μlbufferrwt，≥8000xg，室溫離心15s，加入500μl的bufferrpe，≥8000xg，室溫離心15s，再次加入500μl的bufferrpe，≥10000xg，室溫離心2min，將吸附柱套于一個(gè)新的2ml收集管中，全速離心1min，去除收集管將吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5ml離心管中，打開蓋子，室溫風(fēng)干3～5min；加入24～40μl的depc水或無rnase水，室溫靜置3～5min，然后≥8000xg，室溫離心1min，收集rna溶液，保留備用。

一種上述提取方法獲得的rna檢測(cè)方法，其包括如下步驟：

a)進(jìn)行rnaagilent2100檢測(cè)前，所使用的ladder應(yīng)在70℃下預(yù)變性2min，然后迅速放于冰上，靜置5min，分裝成小管后放于-80℃?zhèn)溆?，其余試劑放于室溫備用?/p>

b)裝配加樣壓膠臺(tái)并將平臺(tái)配件調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)臋n位：

c)準(zhǔn)備試劑：吸取550μl的膠溶液到試劑盒中的離心過濾柱中，1,500xg±20％，室溫離心10min，去除過濾柱保留過濾液體膠；每次檢測(cè)時(shí)使用吸取65μl的液體膠到一個(gè)潔凈離心管中，并加入1μl的熒光染料，充分混勻，13000xg，室溫離心10min，得到混合膠溶液；

d)向圖1對(duì)應(yīng)的孔位加入9μl混合膠溶液，同時(shí)，蓋緊壓膠平臺(tái)，將注射器壓下靜置30s，壓下前確認(rèn)注射器位置為1ml位置，釋放注射器，待注射器恢復(fù)到1ml位置。

e)打開平臺(tái)，同時(shí)在圖2對(duì)應(yīng)的孔位加入9μl混合膠溶液：然后再向如圖所示加入每孔5μl的marker溶液(包括ladder孔)。若rna濃度較低，可選擇加入適當(dāng)量的marker，如血清外泌體rna提取獲得rna量較少，同時(shí)片段較小，可用滅菌水代替marker

f)向如圖中加入1μl變性的ladder溶液，其余孔依次加入1μlrna樣本，放于振蕩器中震蕩混勻1min(儀器默認(rèn))：

g)打開儀器軟件，設(shè)置程序，選擇rna→eukaryoternananochip→start運(yùn)行程序，如圖所示分別為ladder和樣本的峰圖：

由圖2-圖4可以看出，25nt(20～25s間)處為marker峰。本發(fā)明通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明提取工藝制備得到的rna包括18srna和28srna，rna在提取過程中無丟失，且制備效率高，適宜進(jìn)行推廣應(yīng)用。

參比實(shí)施例1

除步驟2)中乙醇替換為異丙醇外，其余同實(shí)施例1。

參比實(shí)施例2

除步驟2)缺少“向其中加入700μlbufferrwt，≥8000xg，室溫離心15s，加入500μl的bufferrpe，≥8000xg，室溫離心15s，再次加入500μl的bufferrpe，≥10000xg，室溫離心2min，將吸附柱套于一個(gè)新的2ml收集管中，全速離心1min，去除收集管將吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5ml離心管中，打開蓋子，室溫風(fēng)干3～5min；”外，其余同實(shí)施例1

對(duì)照實(shí)施例1按照201610021424.5實(shí)施例1和實(shí)施例2所述的制備工藝制備外泌體rna。

試驗(yàn)例

使用同一血清樣本，分別按照實(shí)施例1，參比實(shí)施例1，參比實(shí)施例2以及對(duì)照實(shí)施例所述的工藝提取外泌體rna，測(cè)定rna的純度和rna濃度。測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1使用不同工藝提取樣本中外泌體rna的純度和濃度分析

從上表可以看出：

1)對(duì)比實(shí)施例1和參比實(shí)施例1可以看出，本發(fā)明使用乙醇作為rna的沉淀溶劑要顯著優(yōu)于其他溶劑，其與其他溶劑相比具有顯著的提高rna濃度和rna純度的作用。

2)對(duì)比實(shí)施例1和參比實(shí)施例2可以看出，本發(fā)明使用bufferrwt和bufferrpe組合的處理工藝對(duì)rna進(jìn)行純化，可以明顯提高rna的純度以及rna的濃度。其在rna純度和濃度的提升方面具有關(guān)鍵作用。

3)對(duì)比實(shí)施例1和對(duì)照實(shí)施例1可以看出，本發(fā)明所使用的外泌體裂解試劑效率高，所獲得的rna的濃度顯著高于對(duì)照實(shí)施例，且本發(fā)明使用超速離心發(fā)提取外泌體，其極大地減少了外來試劑對(duì)于外泌體的消耗作用，從而提高了rna的濃度和純度。