本發(fā)明屬于分子生物學(xué)以及基因工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種縊蟶c1q基因、編碼蛋白及其克隆方法和重組縊蟶c1q基因工程菌構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

c1q(complement1q)是經(jīng)典補(bǔ)體途徑的靶標(biāo)識別蛋白，作為一種重要識別分子并且能夠啟動經(jīng)典補(bǔ)體途徑，是先天和適應(yīng)免疫系統(tǒng)之間的主要連接環(huán)節(jié)。除了作為經(jīng)典補(bǔ)體途徑的關(guān)鍵成分之外，c1q還涉及其他幾種免疫過程，包括通過清除細(xì)胞凋亡來維持免疫耐受，細(xì)菌吞噬，逆轉(zhuǎn)錄病毒的中和，細(xì)胞粘附和樹突狀細(xì)胞，b細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)有許多非補(bǔ)體蛋白也含有與補(bǔ)體c1q分子類似的c1q球狀結(jié)構(gòu)域,統(tǒng)稱為含c1q結(jié)構(gòu)域蛋白(c1qdomain-containingprotein，c1qdcprotein)。含有球狀c1q結(jié)構(gòu)域（c1qdc）蛋白，在c末端含有通用模式識別球狀c1q結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合各種配體并引發(fā)一系列免疫應(yīng)答。在結(jié)構(gòu)上，c1qdc結(jié)構(gòu)域的特征在于緊密的膠卷β-三明治折疊，其由c末端的?140個殘基組成，具有八個高度保守的殘基。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾種無脊椎動物c1qdc蛋白作為模式識別受體（prr）像凝集素一樣有凝集活性，可以直接與pamps結(jié)合并引發(fā)一系列免疫應(yīng)答。許多c1qdc蛋白被認(rèn)為是先天免疫中的多功能模式識別受體（prr），因為它們識別和結(jié)合病原體相關(guān)分子模式（pamp），然后引發(fā)快速增強(qiáng)的吞噬作用，導(dǎo)致有效的遏制病原體。除了pamp之外，多種配體可以被c1qdc蛋白與其有效和通用的電荷模式識別結(jié)構(gòu)域結(jié)合。包括某些逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白，脂多糖（lps），β-淀粉樣蛋白原纖維，來自革蘭氏陰性菌的肽聚糖，磷脂，凋亡細(xì)胞甚至一些急性期反應(yīng)物。

c1qdc蛋白序列廣泛存在于哺乳動物、低等脊椎動物及無脊椎動物中。目前，在對無脊椎動物的研究中，主要集中在海灣扇貝(wangetal.,2012)、文蛤(suietal.,2012)、長牡蠣(jiangetal.,2015)等，針對縊蟶c1q蛋白的研究不是很充分?？O蟶c1q在pamps結(jié)合上的優(yōu)越性，為解決縊蟶養(yǎng)殖業(yè)病害預(yù)防，開展健康養(yǎng)殖和實現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

縊蟶（sinonovaculaconstricta）俗名蟶子、蜻子，是屬于軟體動物門（mollusca）雙殼綱(bivalvialinnaeus)、簾蛤目(veneroida)、截蟶科(solecurtidae)，為廣溫廣鹽性海產(chǎn)貝類，廣泛分布于我國、日本和朝鮮等國的河口或有少量淡水注入的內(nèi)灣潮間帶中、下區(qū)軟泥灘。其僅見于西太平洋，是我國、朝鮮和日本的特產(chǎn)，為重要的經(jīng)濟(jì)軟體動物，與牡蠣、蛤仔、泥蚶一起號稱我國“四大養(yǎng)殖貝類”。由于其貝殼自殼頂至腹緣有一條微凹的斜溝，形似繩索的縊痕，因此而得名“縊蟶”。

縊蟶具有生長快、養(yǎng)殖周期短、易管理、產(chǎn)量高、效益好等養(yǎng)殖特點，是我國沿海蝦塘和灘涂貝類主要養(yǎng)殖對象。近年來，養(yǎng)殖縊蟶病害經(jīng)常出現(xiàn)，死亡現(xiàn)象時有發(fā)生，而且日趨嚴(yán)重，經(jīng)濟(jì)損失十分慘重。據(jù)報道，細(xì)菌性疾病是縊蟶養(yǎng)殖中近幾年病害死亡的主要影響因素之一，特別是由于弧菌引起的疾病比較嚴(yán)重，其易侵染縊蟶個體，導(dǎo)致縊蟶個體的免疫防御能力下降。目前的防治方法主要是使用抗菌素和化學(xué)藥物，但是抗菌素以及化學(xué)藥物的長期使用誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致抗生素失效，也會對養(yǎng)殖環(huán)境造成一定影響。因此，篩選特異性好，結(jié)合活性強(qiáng)的革蘭氏陰性菌結(jié)合分子勢在必行，同時，通過構(gòu)建水產(chǎn)動物c1q基因表達(dá)工程菌，從而產(chǎn)生工業(yè)化、高產(chǎn)量的縊蟶c1q基因，從而提升縊蟶機(jī)體的免疫力，可以為縊蟶的發(fā)病提供一種解決手段。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種縊蟶c1q基因、編碼蛋白及其克隆方法和重組縊蟶c1q基因工程菌構(gòu)建方法，表達(dá)的重組c1q對脂多糖、肽聚糖以及甘露聚糖有結(jié)合活性；對大腸桿菌、副溶血弧菌以及鰻弧菌，具有明顯的凝集作用。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：

1、一種縊蟶c1q基因，該基因具有seqidno.1所示的cdna序列。該序列全長1225bp，包括744bp的開放閱讀框，編碼247個氨基酸，5’非編碼區(qū)長258bp，3’非編碼區(qū)長223bp，具有多聚腺苷酸信號，序列末端含有典型的polya尾。

2、一種縊蟶c1q基因的克隆方法，根據(jù)與c1q基因同源的表達(dá)序列標(biāo)簽est序列設(shè)計基因特異性引物，采用race技術(shù)擴(kuò)增基因全長，具體的步驟如下：

（1）通過對副溶血弧菌誘導(dǎo)縊蟶的cdna文庫的表達(dá)序列標(biāo)簽分析，發(fā)現(xiàn)了多條編碼c1q基因的表達(dá)序列標(biāo)簽序列，選取編碼縊蟶c1q部分片段的表達(dá)序列標(biāo)簽克隆；

（2）race引物設(shè)計：根據(jù)編碼縊蟶c1q部分片段的est克隆設(shè)計3’race的巢式引物：3’上游特異性引物1：tgtgaacgacagtagtgacagcaaa，3’上游特異性引物2：atgggcacagaatgaccaactagac，擴(kuò)增3’接頭引物adaptor3：ggccacgcgtcgactagtactt；

（3）race擴(kuò)增獲取itgb基因全長序列，具體步驟如下：

a．總rna提取：取縊蟶組織制備得到rna提取液；

b．3’-race擴(kuò)增：將rna提取液用3’-fullracecoresetwithprimescript?rtase試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成擴(kuò)增3’的模板，以此為模板，使用3’上游特異性引物1和擴(kuò)增3’接頭引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，取pcr稀釋后的產(chǎn)物1ul作為模板，再用3’上游特異性引物2和擴(kuò)增3’接頭引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到3’端目的條帶；

c.將上述擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶用膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物與載體pmd19-t連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌escherichiacolidh5α后，在含有氨芐濃度為50μg/ml的lb平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-12h，挑取陽性克隆菌落，進(jìn)行rcr驗證并送至上海生物工程有限公司測序，所得結(jié)果經(jīng)dnaman軟件分析拼接得刺參c1q基因全長序列，其基因序列如seqidno.1所示。

上述race擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板cdna1.0μl，含mg²⁺的10×pcr緩沖液2.5μl，濃度10mm的dntp2.0μl，濃度10μm的上游特異性引物1.0μl，濃度10μm的接頭引物1.0μl，濃度5u/μl的dna聚合酶0.2μl，超純水：17.3μl；擴(kuò)增條件：94℃5min、94℃30s、55℃45s、72℃1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

4、一種縊蟶c1q基因的編碼蛋白，該編碼蛋白具有seqidno.2所示的氨基酸序列。

利用縊蟶c1q基因編碼蛋白構(gòu)建重組縊蟶c1q基因工程菌的方法，步驟如下：

（1）設(shè)計pcr引物，用分別含有bamhi位點和xhoi位點的引物擴(kuò)增縊蟶c1q蛋白編碼序列；

（2）將克隆得到的目的基因插入pet28a（+）載體，獲得重組質(zhì)粒pet28a（+）-c1q；

（3）對重組質(zhì)粒pet28a（+）-c1q進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，再進(jìn)行純化即獲得重組縊蟶c1q基因工程菌。

具體步驟如下：

（1）縊蟶c1q全長克隆及重組蛋白的構(gòu)建與表達(dá)

a．總rna提?。喝】O蟶組織制備得到rna提取液；

b．cdna合成：將上述rna提取液用cdna合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cdna，然后以合成的cdna為模板，用分別含有bamhi位點和xhoi位點的引物擴(kuò)增縊蟶c1q編碼蛋白，其中縊蟶c1q編碼蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示；

含bamhi位點c1q上游擴(kuò)增引物的基因序列如下所示：ggatccggtctgctgccaccagaggaagtc；

含xhoi位點c1q下游擴(kuò)增引物的基因序列如下所示：ctcgagcacggttgtgtacagcaagaagc

c．pcr擴(kuò)增：模板cdna1.0μl，含mg²⁺的10×pcr緩沖液2.5μl，濃度10mm的dntp2.0μl，濃度10μm的上游引物1.0μl，濃度10μm的下游引物1.0μl，濃度5u/μl的dna聚合酶0.2μl，超純水：17.3μl；擴(kuò)增條件：94℃5min、94℃30s、55℃45s、72℃1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；

d．pcr陽性克隆質(zhì)粒：擴(kuò)增反應(yīng)后，用膠回收試劑盒回收pcr產(chǎn)物，然后將回收產(chǎn)物與載體pmd19-t連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌escherichiacolidh5α后，在含有氨芐濃度為50ug/ml的lb平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-12h，挑取陽性克隆菌落，進(jìn)行rcr驗證和測序鑒定，得到正確的pcr陽性克隆質(zhì)粒；

e．重組質(zhì)粒：將pcr陽性克隆質(zhì)粒用bamhi和xhoi限制性內(nèi)切酶雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收分子量為24.415kda的目的條帶，與經(jīng)同樣酶切的pet28a（+）原核表達(dá)載體酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化escherichiacolidh5α，pcr篩選陽性克隆，經(jīng)測序鑒定獲得編碼框正確的表達(dá)載體pet28a（+）-c1q重組質(zhì)粒；

f．重組蛋白的表達(dá)：將陽性重組質(zhì)粒pet28a（+）-c1q轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主bl21（de3），再接種到卡那霉素濃度為50ug/ml的lb培養(yǎng)液中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至菌液od600的值為0.4-0.6時，加入異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷使其終濃度為1mmol/l，37℃誘導(dǎo)表達(dá)3-7h，收集菌液，經(jīng)10000g，4℃，離心5min，棄上清液，獲得細(xì)菌沉淀物；

（2）重組蛋白的純化

a、菌體裂解：將100ml細(xì)菌沉淀物用10mllysisbuffe重懸菌體沉淀，加入1mg/ml的溶菌酶，冰上孵育30min，超聲破碎菌體，10000g，4℃，離心20min，收集上清液；

b、蛋白純化：吸取1mlni-ntasefinose^tmresin上柱，用無菌水洗兩次，再用lysisbuffer平衡一次；將收集的上清液與經(jīng)上柱處理的ni-ntasefinose^tmresin混合，4℃混勻2h，收集流出液；用washbuffer洗脫2次，每次10ml，分別收集流出液；加入elutionbuffer每次1.25ml，洗脫2次，分別收集流出液，取每次收集的elutionbuffer洗脫的流出液進(jìn)行sds-page電泳鑒定，回收分子量為24.415kda的目的條帶，獲得重組縊蟶c1q蛋白。

所述的lysisbuffer配方如下：50mmnah2po4，300mmnacl，5mm咪唑，ph=8.0；

所述的washbuffer配方如下：50mmnah2po4，300mmnacl，40mm咪唑，ph=8.0；

所述的elutionbuffer配方如下：50mmnah2po4，300mmnacl，250mm咪唑，ph=8.0；

所述的超聲破碎菌體具體破碎過程為：超聲處理5s，停10s，重復(fù)6次，超聲功率為30w。

5、上述重組縊蟶c1q基因工程菌的應(yīng)用，其表達(dá)的重組縊蟶c1q在制備內(nèi)毒素脂多糖、肽聚糖和甘露聚糖結(jié)合劑方面的作用。

6、上述重組縊蟶c1q基因工程菌的應(yīng)用，其表達(dá)的重組縊蟶c1q在制備大腸桿菌、鰻弧菌和副溶血弧菌抑制劑方面的作用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，通過3’端cdna快速擴(kuò)增（3’-race）的方法，首次從縊蟶中克隆得到了c1q基因cdna序列，同時對刺參c1q蛋白質(zhì)進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)，獲得了一株具有對脂多糖、肽聚糖以及甘露聚糖有結(jié)合活性；對大腸桿菌、鰻弧菌、副溶血弧菌有凝集作用的重組c1q的基因工程菌，本發(fā)明優(yōu)點在于：

a、利用基因工程技術(shù)獲得的重組蛋白與化學(xué)合成法相比具有成本低的優(yōu)點；

b、該重組蛋白具有高效的結(jié)合活性和凝集活性，通過本研究的方法將工程菌產(chǎn)生的c1q蛋白投放于縊蟶養(yǎng)殖環(huán)境中，在縊蟶自身產(chǎn)生c1q的基礎(chǔ)上增加了c1q對陰性致病菌的結(jié)合能力，從而提升縊蟶機(jī)體的免疫力，可以為縊蟶感染弧菌提供一種解決手段。

附圖說明

圖1為縊蟶重組c1q蛋白的sds-page分析，m泳道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為pet-28a空載體，2為誘導(dǎo)3h的重組蛋白，3為誘導(dǎo)5h的重組蛋白，4為誘導(dǎo)7h的重組蛋白，5為純化后的重組蛋白；

圖2為縊蟶重組c1q蛋白基因工程菌對內(nèi)毒素脂多糖的結(jié)合活性分析圖；

圖3為縊蟶重組c1q蛋白基因工程菌對內(nèi)毒素肽聚糖的結(jié)合活性分析圖；

圖4為縊蟶重組c1q蛋白基因工程菌對內(nèi)毒素甘露聚糖的結(jié)合活性分析圖；

圖5為縊蟶重組c1q蛋白基因工程菌對大腸桿菌的凝集效果。其中a為tbs-ca和大腸桿菌，b為tbs-ca、大腸桿菌和bsa，c為tbs-ca-edta、大腸桿菌和重組c1q蛋白，d為tbs-ca、大腸桿菌和重組c1q蛋白；

圖6為縊蟶重組c1q蛋白基因工程菌對鰻弧菌的凝集效果。其中a為tbs-ca和鰻弧菌，b為tbs-ca、鰻弧菌和bsa，c為tbs-ca-edta、鰻弧菌和重組c1q蛋白，d為tbs-ca、鰻弧菌和重組c1q蛋白；

圖7為縊蟶重組c1q蛋白基因工程菌對副溶血弧菌的凝集效果。其中a為tbs-ca和副溶血弧菌，b為tbs-ca、副溶血弧菌和bsa，c為tbs-ca-edta、副溶血弧菌和重組c1q蛋白，d為tbs-ca、副溶血弧菌和重組c1q蛋白；

圖8為縊蟶重組c1q蛋白基因工程菌對藤黃微球菌的凝集效果。其中a為tbs-ca和藤黃微球菌，b為tbs-ca、藤黃微球菌和bsa，c為tbs-ca-edta、藤黃微球菌和重組c1q蛋白，d為tbs-ca、藤黃微球菌和重組c1q蛋白；

圖9為縊蟶重組c1q蛋白基因工程菌在大腸桿菌存在下對內(nèi)毒素脂多糖、內(nèi)毒素肽聚糖和內(nèi)毒素甘露聚糖的凝集效果。其中a為tbs-ca和大腸桿菌，b為tbs-ca、大腸桿菌和bsa，c為tbs-ca-edta、大腸桿菌、內(nèi)毒素脂多糖和重組c1q蛋白，d為tbs-ca、大腸桿菌、內(nèi)毒素脂多糖和重組c1q蛋白，e為tbs-ca-edta、大腸桿菌、內(nèi)毒素肽聚糖和重組c1q蛋白，f為tbs-ca、大腸桿菌、內(nèi)毒素肽聚糖和重組c1q蛋白，g為tbs-ca-edta、大腸桿菌、內(nèi)毒素甘露聚糖和重組c1q蛋白，h為tbs-ca、大腸桿菌、內(nèi)毒素甘露聚糖和重組c1q蛋白；

圖10為縊蟶重組c1q蛋白基因工程菌在鰻弧菌存在下對內(nèi)毒素脂多糖、內(nèi)毒素肽聚糖和內(nèi)毒素甘露聚糖的凝集效果。其中a為tbs-ca和鰻弧菌，b為tbs-ca、鰻弧菌和bsa，c為tbs-ca-edta、鰻弧菌、內(nèi)毒素脂多糖和重組c1q蛋白，d為tbs-ca、鰻弧菌、內(nèi)毒素脂多糖和重組c1q蛋白，e為tbs-ca-edta、鰻弧菌、內(nèi)毒素肽聚糖和重組c1q蛋白，f為tbs-ca、鰻弧菌、內(nèi)毒素肽聚糖和重組c1q蛋白，g為tbs-ca-edta、鰻弧菌、內(nèi)毒素甘露聚糖和重組c1q蛋白，h為tbs-ca、鰻弧菌、內(nèi)毒素甘露聚糖和重組c1q蛋白；

圖11為縊蟶重組c1q蛋白基因工程菌在副溶血弧菌存在下對內(nèi)毒素脂多糖、內(nèi)毒素肽聚糖和內(nèi)毒素甘露聚糖的凝集效果。其中a為tbs-ca和副溶血弧菌，b為tbs-ca、副溶血弧菌和bsa，c為tbs-ca-edta、副溶血弧菌、內(nèi)毒素脂多糖和重組c1q蛋白，d為tbs-ca、副溶血弧菌、內(nèi)毒素脂多糖和重組c1q蛋白，e為tbs-ca-edta、副溶血弧菌、內(nèi)毒素肽聚糖和重組c1q蛋白，f為tbs-ca、副溶血弧菌、內(nèi)毒素肽聚糖和重組c1q蛋白，g為tbs-ca-edta、副溶血弧菌、內(nèi)毒素甘露聚糖和重組c1q蛋白，h為tbs-ca、副溶血弧菌、內(nèi)毒素甘露聚糖和重組c1q蛋白；

圖12為縊蟶重組c1q蛋白基因工程菌在藤黃微球菌存在下對內(nèi)毒素脂多糖、內(nèi)毒素肽聚糖和內(nèi)毒素甘露聚糖的凝集效果。其中a為tbs-ca和藤黃微球菌，b為tbs-ca、藤黃微球菌和bsa，c為tbs-ca-edta、藤黃微球菌、內(nèi)毒素脂多糖和重組c1q蛋白，d為tbs-ca、藤黃微球菌、內(nèi)毒素脂多糖和重組c1q蛋白，e為tbs-ca-edta、藤黃微球菌、內(nèi)毒素肽聚糖和重組c1q蛋白，f為tbs-ca、藤黃微球菌、內(nèi)毒素肽聚糖和重組c1q蛋白，g為tbs-ca-edta、藤黃微球菌、內(nèi)毒素甘露聚糖和重組c1q蛋白，h為tbs-ca、藤黃微球菌、內(nèi)毒素甘露聚糖和重組c1q蛋白。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

具體實施例一

c1q基因克隆與序列分析

（1）通過前期對副溶血弧菌誘導(dǎo)縊蟶cdna文庫的est（表達(dá)序列標(biāo)簽）分析，發(fā)現(xiàn)了多條編碼c1q基因的est序列，對其中一個est克隆進(jìn)行測序分析，表明該克隆編碼縊蟶c1q的部分片段；

（2）race引物設(shè)計：根據(jù)編碼縊蟶c1q部分片段的est克隆設(shè)計3’race的巢式引物：3’上游特異性引物1：tgtgaacgacagtagtgacagcaaa，3’上游特異性引物2：atgggcacagaatgaccaactagac，擴(kuò)增3’接頭引物adaptor3：ggccacgcgtcgactagtactt；

（3）縊蟶c1q（3）race擴(kuò)增獲取c1q基因全長序列，具體步驟如下：

a．總rna提?。喝〈炭O蟶的腮和肝胰臟組織（0.2g-1g）于1.5mlrnafree離心管中，加入trizol試劑（購于takara公司）1.0ml，用勻漿器進(jìn)行充分勻漿。4℃，12000g，離心5min，取上清，再加入0.2ml氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5min，4℃，12000g，離心15min，吸取上清至離心管中，加入該上清等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置5min，4℃，12000rpm，離心5min，去上清，在沉淀中加入質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇1ml，4℃，12000rpm，離心5min，棄上清后在沉淀中加入質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇1ml重懸沉淀，4℃，12000rpm，離心5min，去上清，沉淀靜置5-10min，加20μl無rna酶水，得到rna提取液；

b．3’-race擴(kuò)增：將上述rna提取液用3’-fullracecoresetwithprimescript?rtase試劑盒（takara公司）逆轉(zhuǎn)錄合成擴(kuò)增3’的模板，具體合成方法依試劑盒說明書操作，以此為模板，使用3’上游特異性引物1和擴(kuò)增3’接頭引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，取pcr產(chǎn)物1ul作為模板，再用3’上游特異性引物2和擴(kuò)增3’接頭引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到3’端目的條帶；其中race擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下：模板1.0μl，10×pcr緩沖液（含mg²⁺）2.5μl，濃度2.5mm的dntp2.0μl，濃度10μm的3’上游特異性引物1.0μl，濃度10μm的擴(kuò)增3’接頭引物1.0μl，濃度5u/μl的dna聚合酶0.2μl，超純水：17.3μl；擴(kuò)增條件：94℃5min、94℃30s、55℃45s、72℃1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；

c．將擴(kuò)增產(chǎn)物3’端目的條帶使用凝膠回收試劑盒（百泰克）回收，回收產(chǎn)物與載體pmd19-t（takara公司）連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌escherichiacolidh5α（takara公司）后，在含有氨芐濃度為50ug/ml的lb平板培養(yǎng)基（lb平板培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l，瓊脂粉15g/l）中培養(yǎng)8-12h，挑取陽性克隆菌落，進(jìn)行rcr驗證并送至上海生工生物工程有限公司測序，所得結(jié)果經(jīng)dnaman軟件分析拼接得到縊蟶c1q基因全長序列，其基因序列如seqidno.1所示。

最終得到的縊蟶c1q基因cdna序列如seqidno.1所示，該序列全長1225bp，包括744bp的開放閱讀框，編碼248個氨基酸，5’非編碼區(qū)長258bp，3’非編碼區(qū)長223bp，序列末端含有典型的polya尾；縊蟶c1q蛋白質(zhì)的氨基酸序列如seqidno.2所示，該蛋白分子量為24.415kda，等電點為5.97，其中編碼序列的1-24為信號肽序列，該蛋白定位于縊蟶的細(xì)胞膜外。

具體實施例二

c1q基因全長克隆及重組蛋白的構(gòu)建與表達(dá)

a．總rna提?。喝】O蟶各部分組織（0.2g-1g）于1.5mlrnafree離心管中，加入trizol試劑（購于takara公司）1.0ml，用勻漿器進(jìn)行充分勻漿。4℃，12000g，離心5min，取上清，再加入0.2ml氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5min，4℃，12000g，離心15min，吸取上清至離心管中，加入該上清等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置5min，4℃，12000rpm，離心5min，去上清，在沉淀中加入質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇1ml，4℃，12000rpm，離心5min，棄上清后在沉淀中加入質(zhì)量百分濃度為75%的乙醇1ml重懸沉淀，4℃，12000rpm，離心5min，去上清，沉淀靜置5-10min，加20μl無rna酶水，得到rna提取液；

b、cdna合成：將上述rna提取液用cdna合成試劑盒（takara）轉(zhuǎn)錄cdna，具體合成方法依cdna試劑盒說明書操作，然后用帶酶切位點的引物對合成的cdna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，即如下所示：

含bamhi位點c1q上游擴(kuò)增引物：ggatccggtctgctgccaccagaggaagtc；

含xhoi位點c1q下游擴(kuò)增引物：ctcgagcacggttgtgtacagcaagaagc；

c、pcr擴(kuò)增：cdna1.0μl，10×pcr緩沖液（含mg²⁺）2.5μl，濃度10mm的dntp2.0μl，濃度10μm的上游引物1.0μl，濃度10μm的下游引物1.0μl，濃度5u/μl的dna聚合酶0.2μl，超純水：17.3μl；擴(kuò)增條件：94℃5min、94℃30s、55℃45s、72℃1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；

d、pcr陽性克隆質(zhì)粒：擴(kuò)增反應(yīng)后，用膠回收試劑盒（bioteke）回收pcr產(chǎn)物，然后回收產(chǎn)物與載體pmd19-t（takara公司）連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌escherichiacolidh5α（takara公司）后，在含有氨芐濃度為50ug/ml的lb（胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l）平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-12h，挑取陽性克隆菌落，進(jìn)行rcr驗證和測序鑒定，得到正確的陽性克隆質(zhì)粒；

e、重組質(zhì)粒：將pcr陽性克隆質(zhì)粒用bmhi和xhoi（newenglandbiolabs，neb）限制性內(nèi)切酶雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收分子量為24.415kda的目的條帶，與經(jīng)同樣酶切的pet28（a）原核表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化escherichiacolidh5α，pcr篩選陽性克隆，經(jīng)測序鑒定獲得編碼框正確的表達(dá)載體pet28（a）-c1q，將陽性重組質(zhì)粒pet28（a）-c1q轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主bl21（de3）（novagen公司），再接種到卡那霉素濃度為50μg/ml的lb培養(yǎng)液（胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l）中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至菌液od600的值為0.4-0.6時，加入異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷（iptg）使其終濃度為1mmol/l，37℃誘導(dǎo)表達(dá)3-7h，收集菌液，經(jīng)10000g，4℃，離心5min，棄上清液，得到細(xì)菌沉淀物。

具體實施例三

重組蛋白的純化

a、菌體裂解：將100ml細(xì)菌沉淀物用10mllysisbuffer(咪唑濃度5mm)重懸菌體沉淀，加入1mg/ml的溶菌酶，冰上孵育30min，超聲破碎菌體（超聲破碎5s，停10s，共6次，功率30w，10000g，4℃，離心20min，收集上清；

b、蛋白純化：吸取1mlni-ntasefinose^tmresin上柱，用無菌水洗兩次，再用裂解緩沖液（含咪唑濃度5mm）平衡一次；將步驟（a）得到的上清液與之前經(jīng)上柱處理的ni-ntasefinose^tmresin混合，4℃混勻2h，收集流出液，用washbuffer(咪唑濃度40mm)，每次10ml，洗脫2次，分別收集流出液，加入1.25mlelutionbuffer(咪唑濃度250mm)，洗脫2次，分別收集流出液。取每次收集的elutionbuffer洗脫的流出液進(jìn)行sds-page電泳鑒定（結(jié)果如圖1所示），回收分子量為24.415kda的目的條帶（圖1，箭頭所示即為目的蛋白），獲得重組縊蟶c1q蛋白。

上述步驟中，

所述的lysisbuffer(咪唑濃度5mm)配方：50mmnah2po4，300mmnacl，5mm咪唑，ph=8.0；

所述的washbuffer(咪唑濃度40mm)配方：50mmnah2po4，300mmnacl，40mm咪唑，ph=8.0；

所述的elutionbuffer(咪唑濃度250mm)配方：50mmnah2po4，300mmnacl，250mm咪唑，ph=8.0。

具體實施例四

縊蟶重組蛋白的內(nèi)毒素結(jié)合活性分析

a、將3種內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharidesfromescherichiacoli0111：b4，lps,sigma），肽聚糖（pgn，源葉），甘露聚糖（mannanfromsaccharomycescerevisiae，sigma）分別溶于50mmol/l，ph9.6的碳酸鹽緩沖液，終濃度為2mg/ml。取3種內(nèi)毒素各20μl加入96孔板，每組設(shè)置3個重復(fù)，4℃孵育過夜；

b、將孵育過夜的3種內(nèi)毒素分別用pbst緩沖液洗3次后，用200μl，5%bsa緩沖液封閉，37℃，靜置1h；

c、倒掉上一步的bsa緩沖液，用pbst緩沖液洗3次，3種內(nèi)毒素中分別加入具體實施例三獲得的重組縊蟶c1q基因工程菌、加his標(biāo)簽的對照蛋白(bsa)、空白對照（0.05m，ph7.4tris-hcl緩沖鹽溶液tbs）各100μl，根據(jù)c1q蛋白濃度（1.375μg/μl），設(shè)置5個不同的濃度組，分別為20%，40%，60%，80%，100%蛋白濃度，37℃孵育1h；

d、用pbst緩沖液洗3次，每孔加入100μlmouseanti-histag單抗（1：1000），37℃孵育1h；

e、將上一步溶液輕輕倒出，pbst洗3次，加入100μl的堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠igg二抗（1:3000），37℃孵育1h；

f、將上一步溶液輕輕倒出，pbst洗4次，加入100μlpnpp顯色液（北京賽馳生物科技公司），室溫黑暗條件下孵育30min；

g、向上一步的96孔板中加入50μl，3mol/lnaoh終止液，孵育15min終止反應(yīng)，405nm波長測定溶液的吸光度。

結(jié)果顯示，如圖2、圖3和圖4所示，縊蟶重組蛋白c1q對脂多糖、肽聚糖以及甘露聚糖有顯著地結(jié)合活性。

具體實施例五

縊蟶重組蛋白的凝集活性分析

a、細(xì)菌fitc標(biāo)記：將待標(biāo)記細(xì)菌培養(yǎng)到指數(shù)生長中后期，4℃5000g離心10min，棄上清液，用pbs(0.01mol/l、ph7.4)洗滌2次，4℃5000g離心10min，之后用碳酸鹽緩沖液(0.5mol/l、ph9.5)配成濃度為0.5×10⁹cfu/ml的懸菌液，加入fitc溶液(參照說明書)，使fitc在懸菌液中的終濃度為50～100μg/ml，常溫攪拌1～2h，5000g離心10min，棄上清液，用pbs洗滌2次，5000g離心10min，取沉淀的細(xì)菌用pbs配成濃度為0.5×10⁹cfu/ml的菌懸液。標(biāo)記完成后經(jīng)熒光顯微鏡檢查確認(rèn)，4℃避光保存。

b、使用tbs-ca緩沖液（50mmoll-1，tris-hcl，50mmoll-1nacl，10mmoll-1cacl2，ph7.5）和tbs-ca-edta（50mmoll-1，tris-hcl，50mmoll-1nacl，10mmoll-1cacl2，10mmoll-1edta，ph7.5）分別將fitc標(biāo)記的大腸桿菌、副溶血弧菌、鰻弧菌、藤黃微球菌重懸，使其濃度達(dá)到1×10⁹cell*ml^-1。在酶標(biāo)板中，取10μl菌懸液與25μl重組蛋白混勻。在對照組中，取10μl與25μbsa混勻。室溫下孵育1h后，取10μl在熒光顯微鏡下觀察。

c、使用tbs-ca緩沖液（50mmoll-1，tris-hcl，50mmoll-1nacl，10mmoll-1cacl2，ph7.5）和tbs-ca-edta（50mmoll-1，tris-hcl，50mmoll-1nacl，10mmoll-1cacl2，10mmoll-1edta，ph7.5）分別懸浮菌體使其濃度達(dá)到1×10⁹cell*ml^-1。在酶標(biāo)板中，取10μl糖溶液（本實驗所用糖及其濃度：2mg*ml^-1脂多糖、2mg*ml^-1肽聚糖、200mmol*l^-1甘露聚糖）與25μl重組蛋白混合。室溫下孵育30min后，加入10μl菌液。孵育1h后，取10μl制片于熒光顯微鏡下觀察。

結(jié)果顯示，如圖5、圖6、圖7和圖8所示，縊蟶重組蛋白c1q對大腸桿菌、鰻弧菌以及副溶血弧菌有顯著地凝集活性；如圖9、圖10、圖11和圖12所示，縊蟶重組蛋白c1q對內(nèi)毒素脂多糖、內(nèi)毒素肽聚糖以及內(nèi)毒素甘露聚糖有顯著地凝集活性。

上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。

序列表

<110>寧波大學(xué)

<120>縊蟶c1q基因、編碼蛋白及其克隆方法和重組縊蟶c1q基因工程菌構(gòu)建方法

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1225

<212>dna

<213>縊蟶c1q基因全長

<400>1

tgtaaggagtgttggaccgagtagttcgaacaagcgctgcttctaagatagttgaatttc60

cgtgcgtgtttgtgtaaaattgtagacattttctggcaaccagttctaagtgtggtgtag120

atcactaaaacgtggtcagagtctgacactctaacaaagcgatttcggaattgaacactc180

gaaaattggtgacatttgggttattctgaatcaatagtaactgtcttttactgaagactt240

tttcttggcagaagatccatgatgcgccacaattacaaactgcatatagttgccatggta300

acgtgtattatatcgcagctggttcagggaggtctgctgccaccagaggaagtccagacc360

gaggcttcaagtgaccggaaattgatacagcagttgatagatcgtctgggtgccatggaa420

acgcgagaggcaagactagagtcccgtgtcaaccaactggaacgtaccaaccgacaacta480

gaatctgagttgttccgtcttgaccagttggctaatcaacagaaagggcacctggagtcc540

ataaccaacgcgaccatccacggtcatggtcgctcagagagggcagttggacccagcaag600

ccaatcgcgtttacagcatgggcacagaatgaccaactagacatgggaatcaaccaaaac660

attcagttcgagcacgtcgtcaacaatgttggcaatgcttacaactcccacgccgggata720

tttgtagctccagtgactgggatatatgttttctctgtgaccacgttggcttatccagga780

atacaggcttactacagagtttctgtgaacgacagtagtgacagcaaagcgtggatattt840

gtccgcaactctcccagccagggggagcaaggggcgacaactgtgaccctgatcttgatg900

tcgggtgacatcgtgtctgtaaagaatctaggacagcatggcgccgtccacggaggaggg960

tttacgtcattctctggcttcttgctgtacacaaccgtgtaaattccgcagtaaagtgaa1020

gttccctgtacttggcgtagtaaaagataaaaatgaacggagttacacgattctctgtaa1080

ttcggatagtaaactgaacagatgaagagataacgttgttctctgtacagacaacactta1140

cacacgaagggctgctaacatcatccccagtaattgttcagctgaacttataaatgaaat1200

gcattccaaaaaaaaaaaaaaaaaa1225

<210>2

<211>247

<212>prt

<213>縊蟶c1q基因編碼蛋白

<400>2

metmetarghisasntyrlysleuhisilevalalamet13

valthrcysileileserglnleuvalglnglyglyleu26

leuproproglugluvalglnthrglualaserserasp39

arglysleuileglnglnleuileaspargleuglyala52

metgluthrargglualaargleugluserargvalasn65

glnleugluargthrasnargglnleuglusergluleu78

pheargleuaspglnleualaasnglnglnlysglyhis91

leugluserilethrasnalathrilehisglyhisgly104

argsergluargalavalglyproserlysproileala117

phethralatrpalaglnasnaspglnleuaspmetgly130

ileasnglnasnileglnphegluhisvalvalasnasn143

valglyasnalatyrasnserhisalaglyilepheval156

alaprovalthrglyiletyrvalpheservalthrthr169

leualatyrproglyileglnalatyrtyrargvalser182

valasnaspserseraspserlysalatrpilepheval195

argasnserproserglnglygluglnglyalathrthr208

valthrleuileleumetserglyaspilevalserval221

lysasnleuglyglnhisglyalavalhisglyglygly234

phethrserpheserglypheleuleutyrthrthrval247

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>3’上游特異性引物1

<400>3

tgtgaacgacagtagtgacagcaaa25

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>3’上游特異性引物2

<400>4

atgggcacagaatgaccaactagac25

<210>5

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>擴(kuò)增3’接頭引物

<400>5

ggccacgcgtcgactagtactt22

<210>6

<211>30

<212>dna

<213>含有bamhi位點c1q上游擴(kuò)增引物

<400>6

ggatccggtctgctgccaccagaggaagtc30

<210>7

<211>29

<212>dna

<213>含有noti位點c1q下游擴(kuò)增引物

<400>7

ctcgagcacggttgtgtacagcaagaagc29