本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種多肽，尤其涉及一種多肽及其組成的疫苗和應用。

背景技術：

阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease,ad)是一種嚴重威脅老年人生命健康的以記憶力下降為特征的神經(jīng)退行性疾病，腦內(nèi)病理特征主要表現(xiàn)為由β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，aβ)在神經(jīng)元細胞外形成的老年斑和由tau蛋白在神經(jīng)元細胞內(nèi)形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。據(jù)統(tǒng)計，截止到2015年底，全世界共有4600多萬癡呆病人，預計到2050年這一數(shù)字會增長至1億3千萬。隨著全球性的人口老齡化，ad的發(fā)病率及患病人數(shù)近年來呈現(xiàn)遞增趨勢。然而，目前尚無特異性治療ad的藥物，因此研發(fā)能夠有效防治ad的藥物異常迫切。

研究表明，由aβ單體聚集成的寡聚體是ad發(fā)生的初始誘因，aβ寡聚體可誘發(fā)一系列毒性級聯(lián)反應，包括誘發(fā)tau蛋白的聚集等，最終導致ad的發(fā)生。aβ是由其前體蛋白app經(jīng)順序性酶切而產(chǎn)生的多肽片段，app及aβ單體具有正常的生理功能，能夠抑制神經(jīng)突觸的過度活化而減少突觸興奮性毒性產(chǎn)生。只有當各種因素導致aβ產(chǎn)生和清除之間不平衡，導致aβ累積后發(fā)生聚集，形成aβ寡聚體，便會引發(fā)一系列不可逆轉(zhuǎn)的ad病理變化。

因此，靶向aβ的藥物可能是治療ad的突破口。其中，利用aβ疫苗的免疫治療發(fā)展迅速。目前已有多種aβ疫苗經(jīng)歷過治療ad的臨床試驗，包括an1792，cad106，acc001，ub311，affitopead02等。這些aβ疫苗在臨床前動物實驗階段都表現(xiàn)出良好的治療效果，能夠減少老年斑形成并改善動物認知水平。但在ad臨床試驗中由于嚴重的副作用或者治療效果欠佳，至今仍沒有一種疫苗或者抗體通過iii期臨床試驗。an1792是由合成的人源aβ1-42多肽在體外聚集而成，使用qs-21作為免疫佐劑，在臨床ii期試驗中由于引發(fā)了嚴重的腦膜炎等副作用而被迫終止臨床試驗。隨后分析表明，aβ42本身攜帶的t細胞表位引發(fā)的t細胞反應是引發(fā)腦膜炎的主要原因。隨后，cad106，acc001，ub311，affitopead02等第二代aβ疫苗在設計時主要是以aβ42n端的b細胞表位片段作為半抗原偶聯(lián)至載體，制備疫苗。它們的特點是去除了aβ42的t細胞表位區(qū)，從而減少aβ導致的t細胞活化，以達到減少炎癥反應的效果。

但是，系統(tǒng)的分析可以發(fā)現(xiàn)，目前所研發(fā)的aβ疫苗都不是特異性地針對致病性的aβ寡聚體。以aβ全長或者aβ的n端b細胞表位區(qū)制備的疫苗免疫產(chǎn)生的抗體可同時結(jié)合aβ單體、寡聚體和纖維以及app。這或許降低有限的抗體靶向寡聚體的能力。再者，靶向具有正常生理功能的aβ和app可導致副作用的發(fā)生，這種副作用可部分或全部抵消抗體或疫苗的治療作用。

基于以上分析，如何找到一種能夠特異針對致病性aβ寡聚體的疫苗可能起到較好的治療ad的作用是一個亟待解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多肽及其組成的疫苗和應用，該多肽為aβ42寡聚體的構(gòu)象模擬表位，其免疫產(chǎn)生的抗體能夠特異性的靶向致病性的aβ寡聚體，而不與aβ單體及app蛋白結(jié)合，能夠有效地減少aβ疫苗的自身免疫問題，具有較好的治療ad前景。

為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種多肽，所述的多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示或具有所述多肽功能的對seqidno.1所示的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加修飾的變體。

所述seqidno.1所示的氨基酸序列如下：arg-pro-asp-gln-val-met-trp-asp-ser-lys-arg-pro。

本發(fā)明中，所述的變體為具有和seqidno.1所述多肽相同的功能，夠特異性地識別aβ寡聚體，而不識別aβ單體和纖維及app蛋白，示例性地，所述突變體可以為所述多肽序列中的賴氨酸殘基和精氨酸殘基中的一個或多個突變?yōu)槠渌麕д姷陌被釟埢@得的變體。

根據(jù)本發(fā)明，所述多肽有多個拷貝數(shù)的時候也具有所述單個拷貝數(shù)的功能，所述多肽的拷貝數(shù)為1-10，例如可以是1、2、3、4、5、6或7，優(yōu)選為1-7。

第二方面，本發(fā)明提供一種dna片段，其包含編碼第一方面所述多肽的核酸序列。

第三方面，本發(fā)明提供一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包含至少一個拷貝的如第二方面所述的dna片段。

根據(jù)本發(fā)明，所述重組質(zhì)粒為pctcon2載體。

第四方面，本發(fā)明提供一種重組酵母細胞，所述重組酵母細胞包含第三方面所述的重組載體。

根據(jù)本發(fā)明，所述重組酵母細胞為eby100釀酒酵母細胞。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述多肽只有以釀酒酵母為載體才可以讓所述多肽的功能得以實現(xiàn)，采用別的大腸桿菌或是別的重組細胞不能實現(xiàn)所述多肽的功能，不僅如此，本發(fā)明采用eby100釀酒酵母細胞作為載體，可以最大程度的發(fā)揮多肽的功能，所述eby100釀酒酵母細胞與所述多肽能夠協(xié)同增效，進一步提高多肽的功效。

第五方面，本發(fā)明提供一種疫苗，所述疫苗包含如第一方面所述的多肽、第二方面所述的dna片段、第三方面所述的重組載體或第四方面所述的重組酵母細胞中的任意一種或至少兩種的組合。

根據(jù)本發(fā)明，所述疫苗還包括藥學上接受的輔料。

優(yōu)選地，所述輔料為賦形劑、稀釋劑、載體、調(diào)味劑、粘合劑和填充劑中的任意一種或至少兩種的組合。

根據(jù)本發(fā)明，所述疫苗在制備治療阿爾茨海默病(ad)的藥物中的應用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明所述多肽通過pctcon2載體表達在eby100釀酒酵母細胞后并展示在細胞表面制備的全酵母疫苗免疫阿爾茨海默病模型小鼠(app/ps1小鼠)，能夠刺激機體產(chǎn)生抗aβ42寡聚體的抗體，并且這些抗體不與aβ42單體結(jié)合，與aβ42纖維結(jié)合較弱；

(2)本發(fā)明所述多肽明顯降低小鼠腦內(nèi)的老年斑和aβ水平，尤其是aβ42寡聚體水平，降低小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活化，改善ad小鼠的認知功能損傷，并且不誘發(fā)aβ42特異性的t細胞活化和腦部微出血現(xiàn)象的發(fā)生；

(3)本發(fā)明多肽為aβ42寡聚體的構(gòu)象模擬表位，其免疫產(chǎn)生的抗體能夠特異性的靶向致病性的aβ寡聚體，而不與aβ單體及app蛋白結(jié)合，能夠有效地減少aβ疫苗的自身免疫問題，具有較好的治療ad前景。

附圖說明

圖1為aoe1表位多肽的表達與展示，其中，圖1(a)流式細胞儀分析檢測eby100酵母展示表位多肽情況，圖1(b)激光共聚焦顯微鏡分析檢測eby100酵母展示表位多肽情況；

圖2為aoe1疫苗免疫app/ps1小鼠后抗體水平分析，其中，圖2(a)aoe1免疫app/ps1小鼠血清中抗表位多肽igg滴度動力學，圖2(b)抗aβ42寡聚體igg滴度動力學，圖2(c)aoe1免疫app/ps1血清中抗aβ寡聚體igg亞型分析；

圖3為aoe1免疫抗體與不同聚集狀態(tài)aβ的結(jié)合特性分析，其中，圖3(a)elisa驗證aoe1免疫抗體與不同聚集狀態(tài)aβ的結(jié)合，圖3(b)dot-blot檢測aoe1免疫抗體與不同聚集狀態(tài)的aβ結(jié)合，圖3(c)western-blot檢測aoe1免疫抗體與aβ的結(jié)合，圖3(d)免疫組織化學檢測aoe1；

圖4為新物體識別及y迷宮系統(tǒng)檢測aoe1免疫治療ad小鼠后的認知改善情況，ad小鼠免疫治療結(jié)束2周后，利用新物體識別系統(tǒng)和y迷宮系統(tǒng)評價小鼠的認知與記憶能力，其中，圖4(a)新物體識別實驗中小鼠對新舊物體的探索次數(shù)統(tǒng)計(新物體探索次數(shù)與舊物體探索次數(shù)相比，*p<0.05)，圖4(b)小鼠對新物體的偏好指數(shù)統(tǒng)計分析(與ad對照組相比，*p<0.05)，圖4(c)y-迷宮實驗測試期小鼠在新臂的停留時間，圖4(d)新臂選擇次數(shù)(與ad對照組相比，*p<0.05)；

圖5為aoe1免疫治療對ad小鼠腦內(nèi)aβ老年斑的影響，其中，圖5(a)a，c、ths染色檢測ad小鼠腦中的老年斑，圖5(c)4g8免疫組化檢測ad小鼠腦中的老年斑，圖5(b)對ths染色結(jié)果的量化統(tǒng)計分析，圖5(d)4g8免疫組化結(jié)果的量化統(tǒng)計分析(與ad對照組相比，*p<0.05)；

圖6為aoe1免疫治療對ad小鼠的腦組織中aβ水平的影響，其中，圖6(a)-圖6(d)動物行為學結(jié)束后，小鼠麻醉灌流后取腦，利用ripa裂解液及鹽酸胍研磨腦組織分別獲得可溶性及不可溶性腦組織提取液，利用aβelisa檢測試劑盒測定aβ水平，圖6(a)可溶性aβ40水平，圖6(b)不可溶性aβ40水平，圖6(c)可溶性aβ42水平，圖6(d)不可溶性aβ42水平(與ad對照組相比，*p<0.05)，圖6(e)ripa可溶性腦組織提取液經(jīng)12％sds-page、轉(zhuǎn)膜印跡后，利用aβ單克隆抗體4g8檢測aβ蛋白水平，β-actin作為上樣內(nèi)參，圖6(f)wb結(jié)果量化統(tǒng)計分析(與ad對照組相比，*p<0.05)；

圖7為aoe1免疫治療對于ad小鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細胞活化的影響，其中，圖7(a)利用gfap單克隆抗體通過免疫組化染色檢測小鼠腦組織切片中皮層區(qū)及海馬區(qū)星形膠質(zhì)細胞活化情況，圖7(b)星形膠質(zhì)細胞免疫組化結(jié)果量化分析,圖7(c)利用cd11b單克隆抗體通過免疫組化染色檢測小鼠腦組織切片中皮層區(qū)及海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞活化情況，圖7(d)小膠質(zhì)細胞免疫組化結(jié)果量化分析(與ad對照組相比，*p<0.05)；

圖8為aoe1免疫ad小鼠后t細胞活化和腦部微出血情況檢測，其中，圖8(a)aoe1免疫ad小鼠結(jié)束后后，取小鼠脾臟細胞，分別以不同物質(zhì)再次刺激，應用elispot檢測γ干擾素的分泌，圖8(b)aoe1免疫ad小鼠結(jié)束后后，取小鼠脾臟細胞，分別以不同物質(zhì)再次刺激，應用elispot檢測白介素4的分泌，圖8(c)利用普魯士藍染色檢測小鼠腦組織切片中微出血情況。

具體實施方式

下面通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應視為對本發(fā)明的具體限制。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的pbs緩沖液ph值為7.4的緩沖液，配方為：9gnacl，5.73gna2hpo4·12h2o，0.62gnah2po4·2h2o，用水配成1升，調(diào)ph為7.4。

下述實施例中aoe1的表位多肽由吉爾生化(上海)有限公司合成制備。用于實驗的aoe1表位多肽純度為大于或等于95％，表位多肽保存于-20℃，避免反復凍融。

下述實施例中的所有實驗數(shù)據(jù)表示為數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用graphpadprism軟件或/和student’st-test進行，以p<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

下述實施例中的所有實驗數(shù)據(jù)都是通過3次獨立的實驗獲得的，實驗數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)加減標準差，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析是應用one-wayanova軟件進行，對于多組重復記憶力測定數(shù)據(jù)的比較分析則應用重復數(shù)據(jù)的two-wayanova。

實施例1多肽的制備

(1)將aoe1表位多肽插入aga2蛋白的c末端，進行全基因合成，其中，aβ1-15片段的基因作為陽性對照，pctcon2空載體作為陰性對照；

所述aoe1表位多肽的核酸序列如seqidno.2所示，所述seqidno.2所示的核酸序列如下：

seqidno.2：

cgtccggatcaggtgatgtgggatagcaaacgtccg

再用ndeⅰ和xhoi雙酶切pctcon2質(zhì)粒，將酶切后的載體pctcon2與aoe1表位多肽進行融合表達，得到重組載體。

實施例2多肽的制備

相比于實施例1，除了增加了aoe1表位多肽的拷貝數(shù)，所述aoe1表位多肽的拷貝數(shù)為7之外，其他條件與實施例1相同。

制備得到的多肽的效果與實施例1類似，后續(xù)的實驗采用實施例1制備的多肽進行。

實施例3疫苗的制備

(1)酵母感受態(tài)細胞制備

將釀酒酵母eby100按1：100接種于50mlypd液體培養(yǎng)基中，于30℃、260rpm振蕩培養(yǎng)4-6h至對數(shù)前期；室溫6000rpm離心10min；棄上清后用25ml重懸緩沖液重懸，轉(zhuǎn)移至250ml搖瓶中，于30℃振蕩培養(yǎng)10min；室溫6000rpm離心10min，棄上清；用25ml無菌水重懸，于室溫6000rpm離心10min，棄上清；用1ml無菌水重懸，即為感受態(tài)細胞；

(2)酵母細胞轉(zhuǎn)化與鑒定

取1μl構(gòu)建好的表達質(zhì)粒加入100μl酵母感受態(tài)細胞中，冰上孵育5min后，進行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)結(jié)束立即加入1mlypd培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至1.5mlep中，于30℃、260rpm振蕩培養(yǎng)1h。培養(yǎng)結(jié)束后，將所有酵母細胞涂布于sd-trp選擇性培養(yǎng)基平板上，倒置放于濕盒中,于30℃靜置培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后，挑選單克隆并劃線至ypd培養(yǎng)基平板中，倒置于濕盒中，30℃靜置培養(yǎng)24h，再次獲得單克隆。挑選單克隆涂布于ypd培養(yǎng)基平板中，30℃靜置培養(yǎng)24h，以富集酵母。隨后進行酵母印跡實驗，將整板印跡轉(zhuǎn)移至sd-trp選擇性培養(yǎng)基平板中，于30℃靜置培養(yǎng)24h；

(3)酵母細胞展示表位多肽的誘導表達

挑單克隆至sdcaa液體培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)過夜；將過夜菌按照1：100接種至sdcaa培養(yǎng)基中，30℃、260rpm振蕩培養(yǎng)8h至對數(shù)期；于室溫6000rpm離心10min，棄上清；用與sdcaa同樣體積的sgcaa培養(yǎng)基重懸酵母細胞，并轉(zhuǎn)移至搖瓶中，于30℃、260rpm振蕩培養(yǎng)72h；室溫6000rpm離心10min收集酵母沉淀；無菌pbs清洗2遍；再用pbs重懸。此即為展示表位多肽的酵母細胞；

(4)酵母細胞滅活

將上步獲得的酵母細胞于56℃滅活1h后，室溫6000rpm離心10min；棄上清，無菌pbs清洗2遍；此即為滅活的酵母細胞。加入等體積30％甘油，凍存于-80℃冰箱中備用。同時，取部分酵母細胞進行表達表位多肽的檢測；

(5)酵母細胞表達表位多肽檢測

利用流式細胞儀對獲得的酵母菌體進行計數(shù)，計數(shù)后取1×10⁶個酵母細胞重懸于100μl3％bsa中；按照1:100加入鼠源抗c-myc抗體(9e10)，4℃靜置作用30分鐘；pbs洗三遍；按照1:100加入fitc標記的羊抗鼠二抗，4℃靜置作用30分鐘；pbs洗三遍；流式細胞儀檢測。同時，取10μl標記好的酵母菌體滴于載玻片上，加上蓋玻片后，封片進行激光共聚焦顯微鏡觀察。

結(jié)果如圖1所示，圖1(a)結(jié)果表明，表達展示aoe1表位多肽和aβ15的酵母細胞可利用流式細胞儀檢測到明顯的熒光信號，eby100轉(zhuǎn)化空白pet載體則無任何熒光信號產(chǎn)生；圖1(b)結(jié)果表明，利用激光共聚焦顯微鏡可明顯觀察到aoe1表位多肽和aβ15很好地展示于酵母細胞表面，eby100轉(zhuǎn)化空白pet載體則無任何熒光信號產(chǎn)生。

實施例4aoe1誘導app/ps1小鼠產(chǎn)生抗aβ42寡聚體抗體

實驗方法：

(1)動物及免疫：將6月齡大的雄性app/ps1小鼠(華阜康生物公司，中國)隨機分為對照組-即注射轉(zhuǎn)化空白pet質(zhì)粒eby100(control)，aoe1疫苗組(aoe1)和陽性對照組-即展示aβ1-15片段的eby100酵母細胞(aβ15)，每組8只。同時以8只年齡相同的雄性c57bl/6j小鼠作為野生對照組(wt)，野生對照組以注射pbs作為對照(華阜康生物公司，中國)。

將上述四組小鼠進行如下處理：

以兩周一次的間隔分別在第0、14、28、42、56、70、84、98天對小鼠進行皮下注射。疫苗組每只小鼠每次注射6×10⁷個酵母細胞。野生對照組注射等體積的酵母注射液。

(2)抗體滴度測定：分別在免疫前、第二次及后續(xù)每次免疫后第十天尾靜脈取血，將取出的血液于37℃靜置2小時后，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上層血清，分裝待用。

(3)將100μl表位多肽或者aβ42寡聚體包被96孔酶聯(lián)免疫微孔板(aβ42寡聚體每孔包被0.5μg，多肽每孔包被1μg)，bsa為陰性對照，置4℃包被過夜，以pbs洗板3次；以3％bsa37℃封閉2小時，350μl/孔。以pbs洗板2次，加入以3％bsa梯度稀釋的小鼠血清100μl，室溫孵育1小時后用含有0.05％tween-20的pbs洗滌8次。每孔加入hrp標記的山羊抗小鼠igg(1:3000)，室溫孵育1小時后，用含有0.05％tween-20的pbs洗滌6次。每孔加入底物溶液tmb100μl，放置37℃20分鐘，然后每孔加入100μl1mm硫酸終止反應，于酶標儀上測定od值(波長450nm)，在相同的條件下重復三次。

實驗結(jié)果如圖2所示，抗表位多肽的抗體滴度如圖2(a)所示，對照組在免疫前和數(shù)次免疫后的抗體滴度都為0；aoe1疫苗在免疫前抗表位多肽的抗體滴度為0，在免疫六次后抗體滴度達到平臺期，約為1：24000；

抗aβ42寡聚體的抗體滴度如圖2(b)所示，對照組在免疫前的抗體滴度為0；在免疫第五次后產(chǎn)生抗體，滴度約1：50，并且達到平臺期；aoe1疫苗在免疫前抗aβ42寡聚體的抗體滴度為0，在免疫三次后開始出現(xiàn)抗體，滴度約1：50；免疫七次后抗體滴度達到平臺期，約:1：800；aβ15組免疫前抗體滴度為0，在免疫五次后抗體水平達到平臺期，約為1：24000。

抗aβ42寡聚體的抗體分型如圖2(c)所示，aoe1疫苗產(chǎn)生的抗aβ42寡聚體的igg亞型:，其產(chǎn)生的抗體主要是th2型的igg1類抗體，而igg2a、igg2b、igg3的含量較少。

實驗結(jié)果表明，aoe1疫苗免疫app/ps1轉(zhuǎn)基因小鼠能夠產(chǎn)生抗aβ42寡聚體的抗體，并且這種抗體主要是th2型的igg1類抗體。

實施例5aoe1疫苗免疫產(chǎn)生的抗體能特異性地識別aβ42寡聚體，而不與aβ42單體結(jié)合

(1)elisa測定aoe1免疫血清與不同聚集狀態(tài)aβ42的結(jié)合：aβ42按照1mg/ml的濃度加入dmso后，于渦旋震蕩儀上渦旋溶解3min，再用合適的移液器吹打2min，當吹打溶解至管壁不再沾液滴時，用預冷的pbs稀釋至0.01mg/ml，此液體為單體aβ溶液。aβ42以dmso溶解至2mg/ml，以pbs稀釋至0.4mg/ml，37℃靜置孵育2h，此液體為aβ寡聚體溶液。aβ42以dmso溶解至2mg/ml，以pbs稀釋至0.4mg/ml，37℃靜置孵育7day，于12000rpm離心30min，取沉淀重新溶于適當體積的pbs中，此即為aβ纖維。將不同聚集狀態(tài)的aβ包被于96孔板中(0.5μg/孔)，封閉后，將對照組免疫七次后的血清按照1:100稀釋后用于檢測；將aoe1免疫七次后的血清按照1:100稀釋后用于檢測；將aβ15免疫七次后的血清按照1:2000稀釋后用于檢測；4g8抗體按照1:3000稀釋后用于檢測。

(2)dot-blot測定aoe1免疫血清與不同聚集狀態(tài)aβ42的結(jié)合：將不同聚集狀態(tài)的aβ點樣至nc膜上，封閉后，將對照組免疫七次后的血清按照1:100稀釋后用于檢測；將aoe1免疫七次后的血清按照1:100稀釋后用于檢測；將aβ15免疫七次后的血清按照1:2000稀釋后用于檢測；4g8抗體按照1:3000稀釋后用于檢測。

(3)western-blot測定aoe1免疫血清與不同聚集狀態(tài)aβ42的結(jié)合：利用7pa2細胞裂解液混合aβ42單體制備電泳樣品后進行4-12％sds-page，轉(zhuǎn)膜封閉后，將對照組免疫七次后的血清按照1:100稀釋后用于檢測；將aoe1免疫七次后的血清按照1:100稀釋后用于檢測；將aβ15免疫七次后的血清按照1:2000稀釋后用于檢測；4g8抗體按照1:3000稀釋后用于檢測。

(4)免疫組織化學測定aoe1免疫血清與內(nèi)源性aβ的結(jié)合：利用12月齡app/ps1轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織切片進行了免疫組化分析，在同一張腦組織切片中，利用aoe1免疫血清(免疫七次后，1:100稀釋)和ths染色同時標記后，在腦組織切片的同一位置進行白光和熒光觀察。同時，另外一張腦片使用4g8抗體(1:100稀釋)和ths染色同時標記后，在腦組織切片的同一位置進行白光和熒光觀察。

實驗結(jié)果如圖3所示，elisa結(jié)果如圖3(a)所示，對照組免疫血清不能識別任何形式的aβ42；

aoe1免疫血清與aβ42寡聚體結(jié)合力最高，與aβ42單體沒有結(jié)合，與aβ42纖維結(jié)合較弱；aβ15免疫血清和4g8抗體相似，與不同聚集形式的aβ42結(jié)合力相當。

dot-blot結(jié)果如圖3(b)所示，對照組免疫血清不能識別任何形式的aβ42；aoe1免疫血清與aβ42寡聚體結(jié)合力最高，不識別aβ42單體，與aβ42纖維結(jié)合較弱；

aβ15免疫血清和4g8抗體相似，可識別不同聚集形式的aβ42。

western-blot結(jié)果如圖3(c)所示，對照組免疫血清不能識別任何形式的aβ42；aoe1免疫產(chǎn)生的aβ抗體主要結(jié)合35-130kd大小之間的aβ寡聚體，而不結(jié)合單體及較大聚集體；aβ15免疫產(chǎn)生的抗體與4g8抗體相似，可結(jié)合所有的aβ形式。

免疫組織化學結(jié)果如圖3(d)所示，aoe1免疫血清中的抗體能夠識別腦組織中彌散型的淀粉樣沉積，但不識別ths陽性的致密型斑塊；而4g8抗體則可同時識別彌散型和致密型的淀粉樣斑塊。

結(jié)果表明，aoe1免疫產(chǎn)生的aβ抗體主要結(jié)合寡聚體，而不與單體及高度聚集的纖維及斑塊結(jié)合，顯示出良好的特異性。

實施例6aoe1疫苗免疫改善ad小鼠認知損傷

(1)新物體識別實驗：利用50x50x30cm的空曠的活動箱，箱中特定位置上放置有a、b兩個物體，將小鼠放置箱中讓其自由探索5min。第一天為訓練實驗，a、b兩個物體完全一樣。將小鼠放置箱中記錄小鼠對a、b兩個物體的觸碰次數(shù)(小鼠鼻子或嘴巴觸及物體算作一次有效碰觸)。5min結(jié)束后，將小鼠放回飼養(yǎng)盒中，將活動盒擦洗干凈，進行第二只小鼠檢測，步驟同上。第二天為檢測實驗，即24小時后，將場地內(nèi)的a或者b物體換做一個新的物體c，c物體與a、b物體的形狀和顏色都不同。同樣，將小鼠放置入活動箱中分別記錄小鼠對兩個物體的探索次數(shù)。5min后，取出第一只小鼠，將活動盒擦洗干凈，放置第二只小鼠開始試驗。實驗結(jié)束后，統(tǒng)計分析小鼠對于新舊物體的探索次數(shù)及鑒別指數(shù)(di，discriminationindex)。di＝(tn-tf)/(tn+tf)，其中tn為新物體的探索時間，tf為舊物體探索時間。

(2)y-迷宮實驗：y迷宮由三個完全相同的臂組成。各個臂夾角120度，每一臂尺寸為30×8×15cm(長×寬×高)，在中央處各有一個可移動的隔板，迷宮各臂內(nèi)貼有不同的幾何圖形，作為視覺標記。y迷宮的3個臂被隨機設為：新異臂(novelarm)、起始臂(startarm)和其他臂(otherarm)，迷宮上方1.5m處安置攝像機，記錄小鼠的運動軌跡。y迷宮實驗包含兩個階段，間隔1h。第一階段為訓練期，將新異臂用隔板擋住后，將小鼠由起始臂放入，使其在起始臂和其他臂中自由活動10min，訓練結(jié)束后，將小鼠放回飼養(yǎng)籠。將迷宮設備擦洗干凈后，進行第二只小鼠訓練。1h后進行第二階段實驗。第二個階段為檢測期，打開新異臂隔板，同樣，將小鼠由起始臂放入，使其在3個臂中自由活動5min。記錄5min內(nèi)小鼠在各個臂的停留時間和穿梭次數(shù)。檢測結(jié)束后，擦洗y迷宮設備去除小鼠殘留氣味，進行第二只小鼠檢測。

實驗結(jié)果如圖4所示：新物體識別實驗結(jié)果如圖4(a)-圖4(b)所示：aoe1免疫的ad小鼠對新物體的探索次數(shù)則明顯多于舊物體(與舊物體的探索次數(shù)相比，p<0.05)；aoe1治療組小鼠對新物體的偏好指數(shù)也明顯高于ad對照組(與ad對照組相比，p<0.05)。

y-迷宮實驗結(jié)果如圖4(c)-圖4(d)所示：aoe1免疫的ad小鼠在新臂的停留時間和對新臂的探索次數(shù)明顯都明顯提高(與ad對照組相比，p<0.05)。

結(jié)果表明，aoe1免疫治療能夠改善ad小鼠的認知能力，降低記憶損傷。

實施例7aoe1疫苗免疫治療減少ad小鼠腦部的aβ沉積

(1)動物行為學實驗結(jié)束后，每只小鼠通過腹腔注射250μl2％戊巴比妥鈉進行麻醉；麻醉后，心臟灌注4℃預冷的含肝素(10u/ml)的pbs；斷頭取腦，腦組織沿矢狀面一分為二。一半大腦置于4％多聚甲醛溶液中，4℃固定24h，依次用10％、20％、30％蔗糖梯度脫水。脫水結(jié)束后，oct包埋劑包埋，利用冰凍切片機切片，腦切片厚度為20μm，用于后續(xù)的免疫組織化學實驗。

(2)ths染色：將冰凍腦組織切片于室溫下復溫30min；pbs洗滌3次，每次5min；將ths染色液(1mg/ml,70％乙醇配制)滴在腦片上染色5min；70％乙醇脫色5min；pbs洗滌3次，每次5min；封片后利用熒光顯微鏡觀察。

(3)免疫組化檢測老年斑：腦組織冰凍切片平鋪放置在組化盒中，室溫復溫30min；pbs洗滌3次，每次5min；80％甲醇(內(nèi)含0.3％h2o2)浸泡20min，消除內(nèi)源性的過氧化物酶；pbs洗滌3次，每次5min；用含0.3％triton-x的10％山羊血清封閉液于室溫封閉2h；加4g8(1:100稀釋)，4℃作用過夜；pbs洗滌3次，每次5min；加hrp標記的山羊抗小鼠抗體(1:100稀釋)，室溫作用1h；pbs洗滌4次，每次5min；dab室溫染色1min；流水終止染色，封片后進行觀察。

實驗結(jié)果如圖5所示，ths染色結(jié)果如圖5(a)-圖5(b)所示，aoe1免疫治療后，ad小鼠腦內(nèi)老年斑數(shù)量明顯減少(與ad對照組相比，*p<0.05)

免疫組化檢測老年斑結(jié)果如圖5(c)-圖5(d)所示，aoe1免疫治療后，aβ斑塊數(shù)量明顯減少(與ad對照組相比，*p<0.05)

結(jié)果說明aoe1疫苗免疫治療能夠減少ad小鼠腦內(nèi)aβ沉積水平。

實施例8aoe1疫苗免疫減少ad小鼠腦內(nèi)的aβ水平

(1)腦組織提取液中aβ水平測定:另一半大腦用1ml含蛋白酶抑制劑的ripa裂解液研磨裂解，于4℃、12000rpm離心30min，收集上清即為可溶性組分。沉淀中加入500μl5m鹽酸胍緩沖液(ph8.0，50mmtris-hcl配制)，研磨裂解后于4℃、12000rpm離心30min，上清即為不可溶性組分。將可溶與不可溶組分分裝后于-80℃保存。應用aβ40和aβ42elisa檢測試劑盒測定小鼠腦組織提取液中aβ水平。將待測樣品用稀釋緩沖液進行適當稀釋后包被于elisa檢測試劑盒中，同時包被aβ40或aβ42標準品，每孔100μl，于4℃包被過夜；次日棄掉包被液，洗板機洗滌9次，每次60s。加入標簽抗體工作液，每孔100μl，4℃孵育1h后，洗板機洗滌9次，每次60s。加入tmb底物顯色液，每孔100μl，37℃避光反應20min，終止后于450nm測定吸光度。

(2)western-blot檢測腦組織提取液中蛋白水平

將可溶性腦組織提取液進行電泳；電泳后以恒定電流300ma濕法轉(zhuǎn)膜2h；5％脫脂牛奶室溫封閉1h；加入合適稀釋度的一抗，4℃作用過夜；0.1％pbst洗膜3次，每次5min；加入二抗室溫孵育1h；0.1％pbst洗膜3次，每次10min。如果使用hrp標記的二抗則利用ecl系統(tǒng)進行曝光檢測.

實驗結(jié)果如圖6所示，圖6(a)-圖6(d)表明，注射aoe1疫苗后，ad小鼠腦內(nèi)可溶性及不可溶性aβ40水平與ad對照組相比顯著下降(*，p<0.05)；可溶性的aβ42水平與ad對照組相比顯著下降(*，p<0.05)，不可溶性的aβ42水平下降，但無顯著性差異。

圖6(e)的western-blot結(jié)果表明，aoe1疫苗免疫的ad小鼠腦中40-55kd大小的aβ寡聚體水平明顯下降(*，p<0.05)。說明aoe1疫苗免疫能夠減少ad小鼠腦內(nèi)的aβ水平

實施例9aoe1疫苗免疫減少ad小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活化

(1)星形膠質(zhì)細胞檢測：腦組織冰凍切片平鋪放置在組化盒中，室溫復溫30min；pbs洗滌3次，每次5min；80％甲醇(內(nèi)含0.3％h2o2)浸泡20min，消除內(nèi)源性的過氧化物酶；pbs洗滌3次，每次5min；用10％山羊血清(含0.3％triton-x)封閉液室溫封閉2h；加gfap抗體工作液(1:100稀釋)，4℃作用過夜；pbs洗滌3次，每次5min；加熒光標記二抗工作液(1:100稀釋)，室溫作用1h；pbs洗滌4次，每次5min；利用抗熒光淬滅封片劑封片后進行熒光顯微鏡觀察。

(2)小膠質(zhì)細胞檢測：腦組織冰凍切片平鋪放置在組化盒中，室溫復溫30min；pbs洗滌3次，每次5min；80％甲醇(內(nèi)含0.3％h2o2)浸泡20min，消除內(nèi)源性的過氧化物酶；pbs洗滌3次，每次5min；用10％山羊血清(含0.3％triton-x)封閉液室溫封閉2h；加cd11b抗體工作液(1:100稀釋)，4℃作用過夜；pbs洗滌3次，每次5min；加熒光標記二抗工作液(1:100稀釋)，室溫作用1h；pbs洗滌4次，每次5min；dab室溫染色1min；流水終止染色；封片后進行觀察。

(3)應用熒光顯微鏡采集圖像(olympusix73，10倍物鏡)。應用軟件imagej(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md)進行圖像統(tǒng)計分析。

實驗結(jié)果如圖7所示：星形膠質(zhì)細胞活化水平檢測結(jié)果如圖7(a)-圖7(b)所示，aoe1免疫治療后，ad小鼠海馬區(qū)和皮層區(qū)活化的星形膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯減少(*p<0.05)。

小膠質(zhì)細胞活化水平檢測結(jié)果如圖7(c)-圖7(d)所示，aoe1免疫治療后，ad小鼠皮層區(qū)活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯減少(*p<0.05)；海馬區(qū)活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)量減少，但無顯著性差異。

結(jié)果說明，aoe1疫苗免疫減少ad小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活化水平。

實施例10aoe1疫苗免疫不會活化aβ特異性的t細胞，并且不誘發(fā)腦出血產(chǎn)生

(1)elispot檢測：aoe1最后一次免疫結(jié)束后第七天，取三只小鼠，頸椎脫臼處死后，于70％酒精浸泡10min，無菌條件下剖開小鼠腹腔取脾臟；用注射器內(nèi)芯或者研棒于200目篩網(wǎng)上研磨；用2mlhank’s緩沖液沖洗；收集篩網(wǎng)下分離的脾細胞懸液，于2000rpm離心3min；棄上清后，加入8ml紅細胞裂解液，顛倒混勻，靜置5min；待紅細胞完全破碎，；棄上清，用hank’s緩沖液再次清洗2遍，每遍清洗后，于2000rpm離心3min；用含10％血清的rpmi-1640培養(yǎng)基重懸細胞；細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至5×10⁶個/ml。將elispot的預包被板活化后，加入調(diào)整好濃度的細胞懸液至各實驗孔中，每孔100μl(5x105個細胞)；同時，加入對應刺激物，每孔10μl；于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時；培養(yǎng)結(jié)束后，按照elispot試劑盒說明進行操作。

(2)普魯士藍染色：將冰凍腦組織切片于室溫下復溫30min；pbs洗滌3次，每次5min；80％甲醇(內(nèi)含0.3％h2o2)浸泡20min，消除內(nèi)源性的過氧化物酶；pbs漂洗3次，每次5min；滴加普魯士藍染液37℃反應2h；pbs洗滌3次，每次5min；封片后利用顯微鏡觀察。

結(jié)果如圖8所示，elispot結(jié)果如圖8(a)-圖8(b)所示，aβ42多肽刺激aoe1免疫組小鼠脾臟細胞不引發(fā)ifn-γ和il-4的分泌增加。

普魯士藍染色結(jié)果如圖8(c)所示，aoe1疫苗免疫組小鼠腦部只能檢測到極少的腦部微出血現(xiàn)象。

結(jié)果表明，aoe1疫苗具有良好的安全性。

對比例1

相比于實施例3，除了重組細胞為大腸桿菌之外，其他條件與實施例3相同。

所述多肽在大腸桿菌中不進行表達。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述工藝步驟才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>中國科學院過程工程研究所

<120>一種多肽及其組成的疫苗和應用

<130>2017

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