本發(fā)明涉及生物膜ph指示計(jì)，具體涉及一種基于基因重組質(zhì)粒的變異鏈球菌生物膜指示計(jì)、制備及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

齲病是最常見的口腔疾病之一，牙面牙菌斑生物膜的聚集是齲病形成的首要因素；牙菌斑生物膜形成迅速且較難清除，生物膜內(nèi)結(jié)構(gòu)特殊；其中的微生物在特殊的環(huán)境中生長(zhǎng)，代謝產(chǎn)生的乳酸等酸性物質(zhì)不易流出亦不易被唾液中和，故可造成牙菌斑底部附著牙面的局部長(zhǎng)期低ph環(huán)境；齲病的發(fā)生就始于局部低ph環(huán)境造成的牙體脫礦；由此可見，相對(duì)于細(xì)菌本身而言，其產(chǎn)酸造成的菌斑附著表面的低ph環(huán)境才是齲病發(fā)生的直接因素；如何直觀準(zhǔn)確地反映菌斑ph也顯得尤為重要。

目前，菌斑ph的測(cè)量方法大致有以下幾種：1、接觸式電極測(cè)量法：將微電極插入待測(cè)部位進(jìn)行探測(cè)；2、取樣檢測(cè)法：將待測(cè)部位菌斑收集起來，再通過ph計(jì)進(jìn)行檢測(cè)；這兩種方法簡(jiǎn)單、便宜、靈活，但測(cè)量時(shí)會(huì)擾亂待測(cè)部位生物膜、測(cè)試時(shí)間不連續(xù)、唾液的緩沖作用影響大、非原位檢測(cè)；3、內(nèi)在電極測(cè)量法：將微電極事先置于未形成生物膜的物體表面(如義齒基托、培養(yǎng)皿底部等)，然后置于患者口內(nèi)或接入細(xì)菌，即可通過無線電技術(shù)連續(xù)長(zhǎng)期地檢測(cè)ph；這種方法不擾亂生物膜的形成且為原位檢測(cè)，但其價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜；4、ph染料法：使用商品化的ph熒光染料對(duì)生物膜進(jìn)行染色和檢測(cè)；此方法中ph染料染色的操作易受生物膜厚度、生物膜表面粗糙程度等因素的影響，造成實(shí)驗(yàn)誤差；總體來說，目前生物膜ph的測(cè)量方法不盡如人意。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種方便、便宜、連續(xù)原位測(cè)量且誤差較小的基于基因重組質(zhì)粒的變異鏈球菌生物膜指示計(jì)、制備及其應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種基因重組質(zhì)粒pdlph，所述質(zhì)粒pdlph的核苷酸序列如seqidno:1所示，其分子量為66183.62da。

一種基于質(zhì)粒pdlph的變異鏈球菌生物膜ph指示計(jì)，所述指示計(jì)通過將質(zhì)粒pdlph轉(zhuǎn)化入宿主變異鏈球菌ua159中獲得表達(dá)。

進(jìn)一步的，所述質(zhì)粒pdlph在宿主變異鏈球菌ua159中表達(dá)為綠色熒光蛋白。

進(jìn)一步的，指示計(jì)用于生物膜ph檢測(cè)。

進(jìn)一步的，指示計(jì)用于與生物膜ph變化相關(guān)的因素檢測(cè)。

進(jìn)一步的，指示計(jì)用于生物膜產(chǎn)酸抑制劑的篩選。

進(jìn)一步的，指示計(jì)用于變異鏈球菌生物膜ph檢測(cè)。

一種基因重組質(zhì)粒pdlph的制備方法，包括以下步驟：

(1)通過pcr方法獲得唾液鏈球菌57.i的purei基因和綠色熒光蛋白的編碼基因gfp；

(2)使用限制性核酸內(nèi)切酶bamhi酶切步驟(1)獲得的基因片段，通過dna連接酶連接獲得重組基因片段purei-gfp；

(3)將步驟(2)中得到的重組基因片段purei-gfp與質(zhì)粒pdl278分別使用限制性核酸內(nèi)切酶saci及sali雙酶切；

(4)將步驟(3)中得到的產(chǎn)物使用dna連接酶連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中；

(5)涂布含有100μg/ml壯觀霉素的液體培養(yǎng)基瓊脂平板，有氧條件下培養(yǎng)24h，挑選陽(yáng)性克隆于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)24h；

(6)提取質(zhì)粒進(jìn)行pcr和測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒為目標(biāo)產(chǎn)物。

一種指示計(jì)的制備方法，包括以下步驟：

(1)將變異鏈球菌ua159接種于bhi培養(yǎng)基瓊脂平板，37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h，挑單菌落接種于bhi培養(yǎng)基中傳代過夜；

(2)用bhi培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋20倍后，于厭氧條件下培養(yǎng)至od600nm值為0.2；

(3)取500μl上述菌液于無菌ep管中，向其中加入終濃度為1μg/ml變異鏈球菌感受態(tài)刺激肽csp，并置于37℃培養(yǎng)箱中孵育；

(4)10min后向步驟(3)溶液中加入5μl上述載體pdlph，厭氧條件下培養(yǎng)2h；

(5)取100μl步驟(4)中的菌液涂布含有1mg/ml壯觀霉素的bhi瓊脂平板，厭氧條件下培養(yǎng)48h；

(6)挑選抗壯觀霉素陽(yáng)性克隆于含有1mg/ml壯觀霉素的bhi液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧條件下進(jìn)行增菌培養(yǎng)過夜，即得到所述指示計(jì)。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明的指示計(jì)本身即為生物膜的組成成分之一，無需染色洗脫等操作即可檢測(cè)其所處環(huán)境的ph；

(2)本發(fā)明采用口腔生物膜的常駐菌變異鏈球菌作為質(zhì)粒pdlph的宿主，使得指示計(jì)適用范圍廣；

(3)本發(fā)明中指示計(jì)處于活體狀態(tài)，無需額外操作可連續(xù)觀察熒光變化以檢測(cè)生物膜ph變化情況；

(4)本發(fā)明中指示計(jì)構(gòu)建方便，培養(yǎng)簡(jiǎn)單、增殖快；

(5)本發(fā)明中指示計(jì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)無影響，能夠更真實(shí)的反映微生物表型與環(huán)境ph高低間的關(guān)系；

(6)本發(fā)明指示計(jì)成本低、適用范圍廣、可連續(xù)原位檢測(cè)其所處ph及與ph變化相關(guān)因素。

附圖說明

圖1為基因重組質(zhì)粒pdlph構(gòu)建方法示意圖。

圖2為不同ph、不同處理時(shí)間變異鏈球菌ph指示計(jì)熒光圖。

圖3為不同ph、不同處理時(shí)間變異鏈球菌ph指示計(jì)單位面積熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖。

圖4為對(duì)照組δcody/pdlph指示不同ph后熒光圖像。

圖5為對(duì)照組ua159/pdl278-pldh-gfp指示不同ph后熒光圖像。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

一種基因重組質(zhì)粒pdlph，所述質(zhì)粒pdlph的核苷酸序列如seqidno:1所示，其分子量為66183.62da。

一種基于質(zhì)粒pdlph的變異鏈球菌生物膜ph指示計(jì)，所述指示計(jì)通過將質(zhì)粒pdlph轉(zhuǎn)化入宿主變異鏈球菌ua159中獲得表達(dá)。

進(jìn)一步的，所述質(zhì)粒pdlph在宿主變異鏈球菌ua159中表達(dá)為綠色熒光蛋白。

進(jìn)一步的，指示計(jì)用于生物膜ph檢測(cè)。

進(jìn)一步的，指示計(jì)用于與生物膜ph變化相關(guān)的因素檢測(cè)。

進(jìn)一步的，指示計(jì)用于生物膜產(chǎn)酸抑制劑的篩選。

進(jìn)一步的，指示計(jì)用于變異鏈球菌生物膜ph檢測(cè)。

一種基因重組質(zhì)粒pdlph的制備方法，如圖1所示，包括以下步驟：

(1)通過pcr方法獲得唾液鏈球菌57.i的purei基因和綠色熒光蛋白的編碼基因gfp；

以唾液鏈球菌57.i及含有綠色熒光蛋白編碼基因的變異鏈球菌ua159(四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)基因組dna為模板，以purei-saci:5’-tttgagctcattcctgggagactagctg-3’；purei-bamhi:5’-tttggatccctcctaagttttttatgttaatatc-3’。及gfp-bamhi:5’-agaaggatccatgagtaaaggagaagaacttttc-3’；gfp-sali:5’-ttttgtcgacctatttgtatagttcatccatgccatg-3’為引物分別pcr擴(kuò)增約450bp大小的purei基因及約700bp大小的gfp基因；

pcr過程如下：

通過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，dna凝膠回收試劑盒回收pcr產(chǎn)物中的目的基因片段；

(2)使用限制性核酸內(nèi)切酶bamhi酶切步驟(1)獲得的基因片段，通過dna連接酶連接獲得重組基因片段purei-gfp；

將擴(kuò)增得到的目的基因片段用限制性核酸內(nèi)切酶bamhi酶切，然后使用2％瓊脂糖凝膠電泳及dna凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的基因片段，并使用t4dna連接酶16℃連接16小時(shí)；使用1.5％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行分析，并切取1200bp大小的條帶進(jìn)行dna回收，pcr富集重組連接體片段；

pcr過程如下：

(3)將步驟(2)中得到的重組基因片段purei-gfp與質(zhì)粒pdl278(保藏于四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)分別使用限制性核酸內(nèi)切酶saci及sali雙酶切；

(4)將步驟(3)中得到的產(chǎn)物使用dna連接酶連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中；

(5)涂布含有100μg/ml壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基瓊脂平板，有氧條件下培養(yǎng)24h，挑選陽(yáng)性克隆于lb液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)24h；

(6)提取質(zhì)粒進(jìn)行pcr和測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒為目標(biāo)產(chǎn)物。

一種指示計(jì)的制備方法，包括以下步驟：

(1)將變異鏈球菌ua159(四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)接種于bhi培養(yǎng)基瓊脂平板，37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h，涂片鏡檢及生化鑒定后，挑單菌落接種于bhi培養(yǎng)基中傳代過夜；

(2)用bhi培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋20倍后，于厭氧條件下培養(yǎng)至od600nm值為0.2；

(3)取500μl上述菌液于無菌ep管中，向其中加入終濃度為1μg/ml變異鏈球菌感受態(tài)刺激肽csp，并置于37℃培養(yǎng)箱中孵育；

(4)10min后向步驟(3)溶液中加入5μl上述載體pdlph，厭氧條件下培養(yǎng)2h；

(5)取100μl步驟(4)中的菌液涂布含有1mg/ml壯觀霉素的bhi瓊脂平板，厭氧條件下培養(yǎng)48h；

(6)挑選抗壯觀霉素陽(yáng)性克隆于含有1mg/ml壯觀霉素的bhi液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧條件下進(jìn)行增菌培養(yǎng)過夜；

使用菌液進(jìn)行pcr驗(yàn)證，驗(yàn)證過程如下：

驗(yàn)證正確的變異鏈球菌菌株命名為ua159/pdlph，即為所述指示計(jì)。

實(shí)施例1

為了驗(yàn)證所述指示計(jì)的效果，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

(1)將重組變異鏈球菌菌株ua159接種于含有終濃度為15mg/ml酸堿緩沖劑pipes(sigma，美國(guó))和1mg/ml壯觀霉素的bhi+h2o(體積比1:1)培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，菌液備用；

(2)將9個(gè)滅菌后的玻璃小圓片分別置于24孔板的9個(gè)孔內(nèi)，并向其中加入2ml上述混合培養(yǎng)液及20μl上述菌液；

(3)37℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14小時(shí)后，分別置于ph7.5、ph5.5和ph3.5的bhi培養(yǎng)基中處理1min、30min、60min；

(4)將各小圓片取出置于載玻片上，向小圓片中央滴加一滴無熒光鏡油，小心蓋上蓋玻片；

(5)于正置熒光顯微鏡藍(lán)紫光激發(fā)下觀察上述樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選取五個(gè)視野并使用imagepro-plus計(jì)算其單位面積熒光強(qiáng)度，并使用snk檢驗(yàn)分析組間差異。

其熒光圖如圖2所示，單位面積熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖如圖3所示；

如圖2和圖3所示，當(dāng)處理ph為7.5和5.5時(shí)，隨處理時(shí)間的增長(zhǎng)，單位面積熒光強(qiáng)度明顯升高；當(dāng)處理ph為3.5時(shí)，處理1min與30min單位面積熒光強(qiáng)度無明顯差異，但均較處理60min時(shí)低；使用不同ph處理相同時(shí)間時(shí)，單位面積熒光強(qiáng)度隨ph值的降低而升高；處理1min時(shí)，隨著ph的降低，指示計(jì)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；說明該指示計(jì)可以迅速的反映待測(cè)部位的ph高低；隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，變異鏈球菌生長(zhǎng)繁殖同時(shí)產(chǎn)酸，降低了所處環(huán)境的ph，故指示計(jì)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間增長(zhǎng)而增強(qiáng)。

實(shí)施例2

為驗(yàn)證指示計(jì)的特異性進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

首先構(gòu)建對(duì)照組δcody/pdlph和ua159/pdl278-pldh-gfp。

1、對(duì)照組δcody/pdlph的構(gòu)建

(1)將變異鏈球菌δcody接種于改良bhi培養(yǎng)基瓊脂平板，37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h；

(2)挑單菌落分別接種于改良bhi培養(yǎng)基中傳代過夜；

(3)使用改良bhi培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋20倍后，于厭氧條件下培養(yǎng)至od600nm值為0.2；

(4)取500μl上述菌液于無菌ep管中，向其中加入終濃度為1μg/ml變異鏈球菌csp，并置于37℃培養(yǎng)箱中孵育；

(5)10min后向其中加入載體pdlph。厭氧條件下培養(yǎng)2.5h；

(6)取100μl菌液涂布含有1mg/ml壯觀霉素的改良bhi瓊脂平板，厭氧條件下培養(yǎng)48h；

(7)挑選壯觀霉素陽(yáng)性克隆于改良bhi培養(yǎng)基中，37℃厭氧條件下進(jìn)行增菌培養(yǎng)；

(8)24h后以菌液作為模板，gfp-bamhi及gfp-sali為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的菌株分別命名為δcody/pdlph，保種凍存待用。

2、對(duì)照組ua159/pdl278-pldh-gfp的構(gòu)建

(1)將變異鏈球菌ua159接種于改良bhi培養(yǎng)基瓊脂平板，37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h；

(2)挑單菌落分別接種于改良bhi培養(yǎng)基中傳代過夜；

(3)使用改良bhi培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋20倍后，于厭氧條件下培養(yǎng)至od600nm值為0.2；

(4)取500μl上述菌液于無菌ep管中，向其中加入終濃度為1μg/ml變異鏈球菌csp，并置于37℃培養(yǎng)箱中孵育；

(5)10min后向其中加入5μl質(zhì)粒pdl278-pldh-gfp(保藏于四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，厭氧條件下培養(yǎng)2.5h；

(6)取100μl菌液涂布含有1mg/ml壯觀霉素的改良bhi瓊脂平板，厭氧條件下培養(yǎng)48h；

(7)挑選壯觀霉素陽(yáng)性克隆于改良bhi培養(yǎng)基中，37℃厭氧條件下進(jìn)行增菌培養(yǎng)；

(8)24h后以菌液作為模板，gfp-bamhi及gfp-sali為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的菌株分別命名為ua159/pdl278-pldh-gfp，保種凍存待用。

對(duì)照組進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)試

(1)將δcody/pdlph及ua159/pdl278-pldh-gfp分別接種于含有終濃度為15mg/ml酸堿緩沖劑pipes(sigma，美國(guó))和1mg/ml壯觀霉素的bhi+h2o(體積比1:1)培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，菌液備用；

(2)將18個(gè)滅菌后的玻璃小圓片分別置于兩個(gè)24孔板的18個(gè)孔內(nèi)(每個(gè)孔板9個(gè)孔)，并向其中加入2ml上述混合培養(yǎng)液；

(3)向孔板a中的9個(gè)孔內(nèi)加入20μlδcody/pdlph的菌液；向孔板b中的9個(gè)孔內(nèi)加入20μlua159/pdl278-pldh-gfp的菌液；

(4)37℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14小時(shí)后，分別置于ph7.5、ph5.5和ph3.5的bhi培養(yǎng)基中處理1min、30min、60min；

(5)將各小圓片取出置于載玻片上，向小圓片中央滴加一滴無熒光鏡油，小心蓋上蓋玻片；

(6)于正置熒光顯微鏡藍(lán)紫光激發(fā)下觀察上述樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選取五個(gè)視野并使用imagepro-plus計(jì)算其單位面積熒光強(qiáng)度，并使用snk檢驗(yàn)分析組間差異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4和圖5所示，δcody/pdlph及ua159/pdl278-pldh-gfp單位面積熒光強(qiáng)度分別約為0.39iod/μm²及0.42iod/μm²，且不隨處理ph的高低及處理時(shí)間的長(zhǎng)短而變化；與本發(fā)明中的指示計(jì)ua159/pdlph相比，δcody/pdlph缺失cody蛋白而ua159/pdl278-pldh-gfp缺失酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子purei；兩者在不同ph及不同處理時(shí)間下，單位面積熒光強(qiáng)度無明顯變化，說明其不具有指示生物膜ph的能力；同時(shí)，也驗(yàn)證了本專利構(gòu)建系統(tǒng)指示ph的特異性。

本發(fā)明利用purei的酸誘導(dǎo)表達(dá)特性構(gòu)建pdlph并轉(zhuǎn)入變異鏈球菌中制作生物膜原位ph指示計(jì)；指示計(jì)本身即為生物膜的組成成分之一，無需染色洗脫等操作，即可檢測(cè)其所處環(huán)境的ph；指示計(jì)始終處于活體狀態(tài)，且無需額外操作，可以連續(xù)觀察熒光變化以檢測(cè)生物膜ph變化情況；載體構(gòu)建方便快捷，指示計(jì)為菌體本身，培養(yǎng)簡(jiǎn)單增殖快；變異鏈球菌是口腔生物膜的常駐菌，產(chǎn)酸耐酸性強(qiáng)，將其作為載體pdlph的宿主，使得指示計(jì)適用范圍廣；可用于生物膜ph檢測(cè)及與ph變化相關(guān)的因素檢測(cè)，如生物膜產(chǎn)酸抑制劑的篩選等。

本發(fā)明中的生物膜指微生物個(gè)體間相互黏附聚集形成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、相對(duì)穩(wěn)定的微生物群體；菌斑指牙菌斑生物膜，是一種細(xì)菌性生物膜，為基質(zhì)包裹的相互粘附或粘附于牙面、牙間或修復(fù)體表面的軟而未礦化的細(xì)菌性群體，不能被水沖去或漱掉。

seqidno:1

<110>四川大學(xué)

<120>一種基于質(zhì)粒pdlph的變異鏈球菌生物膜ph指示計(jì)及其應(yīng)用

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>7885

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttcc60

gcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagct120

cactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatg180

tgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttc240

cataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcga300

aacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctct360

cctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtg420

gcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaag480

ctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactat540

cgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaac600

aggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaac660

tacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttc720

ggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttt780

tttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatc840

ttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatg900

agattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatca960

atctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggca1020

cctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtag1080

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atgaaaacgagaattggacctttacagaattactctatgaagcgccatatttaaaaagct1320

accaagacgaagaggatgaagaggatgaggaggcagattgccttgaatatattgacaata1380

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aataactataactaataacgtaacgtgactggcaagagatatttttaaaacaatgaatag1500

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aattaactaaaataattattatctagataaaaaatttagaagccaatgaaatctataaat1620

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